OPRACOWAŁA : Klaudia Barczyńska

Transkrypt

1 OPRACOWAŁA : Klaudia Barczyńska 1

2 Przedmiotem normy są metody oznaczania zawartości chlorofilu w organizmach zielonych zasiedlających wody powierzchniowe. Zawartość chlorofilu a jest wskaźnikiem biomasy chlorofilowej organizmów zielonych. 2

3 Chlorofil a barwnik asymilacyjny występujący w komórkach wszystkich roślin zielonych Feopigmenty a produkty rozkładu chlorofilu a, zachodzącego w środowisku naturalnym, a także w warunkach sztucznych pod wpływem kwasu. Wśród feopigmentów a największy udział ma feofityna a. Biomasa chlorofilowa organizmów zielonych biomasa tych organizmów wyrażona zawartością chlorofilu a. 3

4 Oznaczanie chlorofilu a prowadzono w glonach planktonowych dwoma metodami: spektrofotometryczną monochromatyczną z poprawką na feopigmenty a, spektrofluorymetryczną z poprawką na feopigmenty a 4

5 Metoda stosowana do oznaczania chloforilu a występującego w glonach planktonowych wód powierzchniowych w stężeniu 1mg/m 3 300mg/m 3 przy wykonaniu oznaczania z próbki o objętości od 0,1 3 l i ekstrakcji barwników za pomocą 10 ml roztworu acetonu. W przypadku występowania wyższych stężeń chlorofilu od 300mg/1000l można wykonać oznaczanie, stosując do ekstrakcji większą objętość acetonu 5

6 Oznaczanie polega na zagęszczaniu sestonu na sączku z włókna szklanego przez przesączenie określonej objętości wody, roztarciu sączka wraz z odsączonym materiałem, wyekstrahowaniu acetonem barwników asymilacyjnych z otrzymanej miazgi, odwirowaniu i pomiarze absorbancji ekstraktu przy określonych długościach fali przed i po zakwaszeniu kwasem solnym. Stężenie chlorofilu a oblicza się wg określonego wzoru. W toku postępowania analitycznego i obliczeń eliminuje się wpływ obecności feopigmentów a na oznaczanie chlorofilu a. 6

7 W toku analizy próbka i ekstrakt powinny być chronione przed intensywnym światłem. Używane szkło laboratoryjne nie może zawierać śladów kwasów. 7

8 APARATURA I PRZYRZĄDY a) Aparat Coli z kolbą ssawkową, b) Pompka próżniowa, c) Probówki wirownicze, wyskalowane na 5 ml i 10 ml, d) Przyrząd do ucierania sączków (rozcieracz) napędzany elektrycznie, e) Sączki z włókna szklanego (bibuła Whatman GF/C) o średnicy mm, dopasowane do średnicy porowatej płytki aparatu Coli, f) Spektrofotometr o zakresie obejmującym długość fali do 800 nm z kuwetami pojemności 2 ml i grubości warstwy 1 cm, g) Wirówka laboratoryjna zapewniająca osiągnięcie 4000obr/min. 8

9 ODCZYNNIKI I ROZTWORY a) Aceton cz.d.a, roztwór wodny 90% b) Kwas solny cz.d.a, roztwór wodny o stężeniu c(hcl) = 0,12 mol/l 9

10 PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO BADAŃ Pobraną próbkę jak najszybciej przesączyć przez sączek z włókna szklanego umieszczony w lejku aparatu Coli, połączonego z pompką próżniową Suszyć sączek na zestawie, ssąc powietrze przez 2 3 min Chronić przed intensywnym światłem Objętość próbki należy tak dobrać, aby po jej przesączeniu uzyskać zielonkawe zabarwienie sączka Po przesączeniu próbki sączek ostrożnie wyjąć z aparatu przy pomocy pęsety, złożyć na pół warstwę sestonu do środka i umieścić na szalce Petriego wyłożonej miękką bibułą do sączenia Suchy sączek bezzwłocznie poddać dalszej obróbce 10

11 WYKONANIE OZNACZENIA sączek z sestonem umieścić w przyrządzie do ucierania, dodać 2 ml roztworu acetonu, przyrząd połączyć z napędem elektrycznym i dokładnie rozetrzeć, zawartość szklanej probówki przyrządu przenieść ilościowo do probówki wirowniczej, używając roztworu acetonu, ekstrakt uzupełnić roztworem acetonu do 10 ml lub do 5 ml w przypadku niskich stężeń chlorofilu, probówki wirownicze szczelnie zamknąć, wymieszać wytrząsając i pozostawić w ciemności w lodówce w temperaturze 4 C do następnego dnia, ale nie dłużej niż 24 h. 11

12 WYKONANIE OZNACZENIA Probówkę z ekstraktem umieścić w wirówce i wirować przez 10 min przy 4000 obr/min, do kuwety (o grubości warstwy 1 cm) spektrofotometru odmierzyć 2 ml odwirowanego ekstraktu, przykryć wieczkiem, wykonać pomiar absorbancji przy długościach fali 663 nm i 750 nm, do roztworu w kuwecie dodać 0,1 ml roztworu HCl o stężeniu c(hcl) = 0,12 mol/1, wymieszać starannie zawartość kuwety cienkim pręcikiem szklanym i wykonać ponownie pomiar absorbancji po upływie 1 min, lecz nie później niż po 2 min, od wprowadzenia kwasu, przy długości fali 665 i 750 nm 12

13 OBLICZANIE WYNIKÓW OZNACZANIA Zawartość chlorofilu oblicza się wg następującego wzoru: X = 26,73 A 663b A 750b (A 665a A 750a ) V E V w l Gdzie: (A 663b A 750b ) absorbancje ekstraktu oznaczone przed dodaniem kwasu, przy długości fali 663 i 750 nm odpowiednio, (A 665a A 750a ) absorbancje ekstraktu oznaczone po dodaniu kwasu, przy długości fali 665 i 750 nm odpowiednio, V E objętość przygotowanego ekstraktu [ l ] V w objętość przesączonej próbki wody [ 1000 l ] l grubość warstwy absorbującej w ku wecie [ cm ] 26,73 współczynnik przeliczeniowy. 13

14 WYNIK Za wynik końcowy oznaczania należy przyjąć średnią arytmetyczną dwóch równolegle wykonanych oznaczeń, różniących się między sobą nie więcej niż o 10% wyniku mniejszego. 14

15 ZAKRES STOSOWANIA METODY Metoda stosowana do oznaczania chlorofilu a występującego w glonach planktonowych wód powierzchniowych w stężeniu µg/l przy wykonaniu oznaczania z próbki wody o objętości 0,1 1,0 l i ekstrakcji barwników za pomocą 10 ml ekstrahenta. Przy występowaniu stężeń chlorofilu wyższych od 100 µg/l można wykonać oznaczanie, stosując do ekstrakcji większą objętość ekstrahenta. 15

16 ZASADA METODY zagęszczenie sestonu na sączku z włókna szklanego przez przesączenie odpowiedniej objętości wody, utarcie odsączonych glonów wraz z sączkiem, ekstrakcja acetonem chlorofilu a i pozostałych barwników z otrzymanej miazgi, odwirowanie, pomiar fluorescencji ekstraktu przy długościach fali emisji λ cm = 663 nm i fali wzbudzenia λ ex = 430 nm przed i po zakwaszeniu kwasem solnym. 16

17 ZASADA METODY Wynikiem kalibracji jest wyznaczenie średniej dla danej serii wzorców wartości współczynników F i r. Stężenie chlorofilu a w próbce oblicza się wg określonego wzoru. Tok postępowania analitycznego i obliczeń opisany w normie eliminuje wpływ feofityny a na oznaczanie chlorofilu a. 17

18 W toku analizy próbka i ekstrakt muszą być chronione przed światłem. Używane szkło laboratoryjne nie może zawierać śladów kwasów. 18

19 ODCZYNNIKI I ROZTWORY a) Aceton, roztwór 90% (V/V). Zmieszać 90 części acetonu z 10 częściami wody. Odczynniki odmierzać z dokładnością ± 0,5 ml. b) Kwas solny o d= 1,19 g/ml i roztwór o c(hcl) = 0,1 mol/1. c) Węglan magnezowy, zawiesina. 1 g dokładnie sproszkowanego węglanu magnezowego (MgCO 3 ) wymieszać w 100 ml wody. d) Wzorzec chlorofilu a. Jako wzorzec chlorofilu a stosować ekstrakt z hodowli glonów Scenedesmus ąuadricauda hodowanych na pożywce Knopa. 19

20 HODOWLA GLONÓW Scenedesmus quadricauda do 150 ml wody dodać 10 ml 10% roztworu Ca(NO 3 ) 2, dodać po 5 ml 5% roztworu KNO 3 lub KCl, 5% roztworu MgSO 4, 5% roztworu KH 2 PO 4 oraz 1 kroplę 1% roz tworu FeCl 3, roztwór KH 2 PO 4 dodawać kroplami. Przygotowany roztwór zaszczepić kulturą glonów. Kolby z hodowlą glonów należy trzymać w świetle dziennym do wystąpienia obfitego zakwitu. 20

21 HODOWLA GLONÓW Scenedesmus quadricauda zawartość kolb przesączyć przez sączki, wysuszyć w lodówce, rozetrzeć w moździerzu, przeprowadzić ekstrakcję barwnika, zalewając miazgę 100 ml roztworu acetonu. Ekstrakcja: 3 5 dni Odwirować Zdekantować ekstrakt 21

22 ODCZYNNIKI I ROZTWORY e) Roztwór wzorcowy podstawowy chlorofilu a: do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml odmierzyć 10 ml wzorca chlorofilu a i uzupełnić roztworem acetonu do kreski. Stężenie chlorofilu a w tak otrzymanym roztworze wzorcowym oznaczyć spektrofotometrycznie. Następnie, po oznaczaniu obliczyć stężenie chlorofilu a we wzorcu w µg/l wg wzoru X = 26,73 A 663b A 750b (A 665a A 750a ) 1000 l Stężenie roztworu wzorcowego podstawowego chlorofilu a powinno mieścić się w granicach µg/l. 22

23 ODCZYNNIKI I ROZTWORY f) Roztwór wzorcowy roboczy chlorofilu a o stężeniu 1000 µg/l : do kolby pomiarowej pojemności 100 ml odmierzyć odpowiednią objętość roztworu wzorcowego podstawowego chlorofilu a i uzupełnić roztworem acetonu do kreski. Wymieszać i przenieść do butelki z ciemnego szkła. Roztwór jest nietrwały i powinien być przygotowywany w dniu pomiarów. 23

24 APARATURA, PRZYRZĄDY I MATERIAŁY Spektrofluorymetr o zakresie długości fal odpo wiadającym długości fali wzbudzenia λ ex = 430 nm i fali emisji λ em = 663 nm. Aparat do sączenia z kolbą próżniową. Pompka próżniowa. Probówki wirówkowe pojemności 10 ml, wyskalowane co 0,1 ml. Moździerz porcelanowy do ucierania sączków lub przyrząd elektryczny - rozcieracz Wirówka laboratoryjna, 4000 obr/min. Sączki z włókna szklanego o średnicy mm bibuła Whatmana GF/C. Kolby Erlenmyera pojemności 300 ml. Kolby pomiarowe pojemności 10 ml Szalki Petriego. 24

25 PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO BADAŃ Próbkę o określonej objętości w zakresie od 0,1 do 1,0 l, jak najszybciej przesączyć przez sączek umieszczony w aparacie do sączenia połączonym z pompą próżniową. Na początku sączenia dodać na sączek 1 kroplę zawiesiny MgCO 3. Po przesączeniu próbki, należy jeszcze suszyć sączek w aparacie, ssąc powietrze przez 2 3 min, sączek ostrożnie wyjąć, złożyć warstwą sestonu do środka i ułożyć w szalce Petrie go wyłożonej miękką bibułą do sączenia, umieścić szalkę z sączkiem w lodówce, w temperaturze O 4 C, bez dostępu światła, wysuszony sączek bezzwłocznie poddać dalszej obróbce. 25

26 PRZYGOTOWANIE SKALI WZORCÓW I WYZNACZANIE WSPÓŁCZYNNIKÓW µg/l µg/l I seria wzorców: roztwór wzorcowy roboczy chlorofilu a w następujących ilościach: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 i 5,0 ml, następnie uzupełnić roztworem acetonu do kreski i wymieszać. Stężenia chlorofilu a w kolejnych wzorcach wynoszą: 100; 200; 300; 400 i 500 µg/l. II seria wzorców: roztwór wzorcowy roboczy chlorofilu a w następu jących ilościach: 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 i 10,0 ml, następnie uzupełnić roztworem acetonu do kreski i wymieszać. Stężenia chlorofilu a w kolejnych wzorcach wynoszą: 500; 600; 700; 800; 900 i 1000 µg/l. 26

27 PRZYGOTOWANIE SKALI WZORCÓW I WYZNACZANIE WSPÓŁCZYNNIKÓW Wykonać pomiar fluorescencji przy długości fali światła wzbudzenia λ ex = 430 nm i długości fali światła emisji λ em = 663 nm. Dla każdego wzorca w serii wykonać odczyty fluorescencji przed zakwaszeniem (R b,) i po zakwaszeniu (R a ) roztworem kwasu solnego. Odczyt fluorescencji wykonać po upływie co najmniej 1 min od momentu zakwaszenia, lecz nie później niż po upływie 2 min. Z otrzymanych wartości obliczyć współczynniki F i r dla każdego wzorca chlorofilu a w poszczególnych seriach wg wzorów: F = C WZ R b i r = R b R a 27

28 PRZYGOTOWANIE SKALI WZORCÓW I WYZNACZANIE WSPÓŁCZYNNIKÓW F = C WZ R b i r = R b R a C WZ stężenie chlorofilu a we wzorcu [µg/l], R b odczyt fluorymetryczny dla danego stężenia wzorca przed zakwaszeniem, R a odczyt fluorymetryczny dla danego stężenia wzorca po zakwaszeniu. Dla każdej serii wzorców obliczyć średnie arytmetyczne wartości współczynników: F i r 28

29 WYKONANIE OZNACZANIA Sączek z sestonem utrzeć, a otrzymaną miazgę dokładnie przenieść do probówki wirówkowej, zalać 10 ml roztworu acetonu, szczelnie zamknąć i pozostawić w lodówce na około 20 h ekstrakt odwirować w wirówce przez 10 min przy 4000 obr/min, zlać do kalibrowanej probówki i uzupełnić jego objętość do 10 ml roztworem acetonu. 29

30 WYKONANIE OZNACZANIA Zmierzyć fluorescencję (R b ) ekstraktu przy fali wzbudzenia λ ex = 430 nm i fali emisji λ em = 663 nm, ekstrakt zakwasić roztworem kwasu solnego o c(hcl) = 0,1 mol/l zmierzyć fluorescencję (R a ) przy tych samych długościach fal Ekstrakt chlorofilu a chronić przed światłem 30

31 OBLICZANIE WYNIKÓW OZNACZANIA Zawartość chlorofilu a w badanej próbce, z uwzględnieniem poprawki na feofitynę a, obliczyć w µg/l wg wzoru: X = F r r 1 (R b R a ) V E V w F średnia wartość współczynnika F dla serii wzorców, r średnia wartość współczynnika r dla serii wzorców, R b fhioreseencja ekstraktu badanej próbki przed zakwaszeniem, R a fluorescencja ekstraktu badanej próbki po zakwaszeniu, V E objętość ekstraktu [l] V w objętość sączonej próbki wody [l]. 31

32 WYNIK KOŃCOWY OZNACZANIA Za wynik końcowy oznaczania należy przyjąć średnią arytmetyczną wyników dwóch równolegle wykonanych oznaczeń, różniących się między sobą nie więcej niż o 10% wyniku mniejszego. 32

33 33