Oczyszczanie oraz badanie aktywności dehydrogenazy glutaminianowej

Transkrypt

1 Oczyszczanie oraz badanie aktywności dehydrogenazy glutaminianowej Joanna Kwinta, Wiesław Bielawski Cel ćwiczenia Badanie mechanizmu katalizowanej reakcji, a także sposobu regulacji aktywności prowadzi się na wysoko oczyszczonych preparatach enzymu. Enzymy oczyszcza się stosując następujące po sobie chemiczne lub fizyczne metody frakcjonowania białek. Z tego względu celem ćwiczenia jest przeprowadzenie początkowych etapów oczyszczania dehydrogenazy glutaminianowej (GDH), a także poznanie spektrofotometrycznej metody oznaczania aktywności tego enzymu stosowanej także w przypadku innych oksydoreduktaz. Wstęp Dehydrogenaza glutaminianowa (EC ) występująca głównie w mitochondriach komórek roślin i zwierząt katalizuje odwracalną reakcję redukcyjnej aminacji kwasu 2-oksoglutarowego do kwasu glutaminowego. Enzym może współdziałać zarówno z NAD(P)H jak i z NAD(P) + jako koenzymami. (Rys.1). + NH NAD(P)H + H + + NAD(P) + + H 2 O kwas 2-oksoglutarowy jon amonowy zredukowany koenzym kwas glutaminowy utleniony koenzym Rysunek 1. Reakcja katalizowana przez dehydrogenazę glutaminianową. Kwas glutaminowy jest dawcą grup aminowych w biosyntezie aminokwasów. Reakcja odwrotna, której produktami są 2-oksoglutaran, jon amonowy i zredukowane koenzymy łączy metabolizm aminokwasów z cyklem Krebsa. U bakterii i zwierząt dehydrogenaza glutaminianowa zbudowana jest z sześciu identycznych podjednostek kodowanych przez jeden gen i podlega regulacji allosterycznej. GTP, ATP, glutamina, glutaminian oraz NADH pełnią rolę inhibitorów allosterycznych enzymu, podczas gdy ADP, jony Ca 2+, Mn 2+ i NH 4 + działają jako aktywatory allosteryczne. Wysoki poziom aktywności enzymu występuje w wątrobie, nerkach, trzustce i mózgu ssaków. W diagnostyce medycznej, oznaczanie poziomu aktywności GDH w surowicy krwi jest wykorzystywane do wykrywania chorób wątroby. Enzym roślinny także jest heksamerem, ale może być zbudowany z dwóch typów podjednostek: α i β, różniących się nieznacznie masą cząsteczkową oraz ładunkiem elektrycznym. Podjednostki połączone ze sobą w różnym stosunku ilościowym mogą dać siedem izoenzymów (Rys.2). 1

2 A B Rysunek 2. (A) Wzór izoenzymów GDH u roślin. (B) Zymogram GDH, izoenzymy GDH w liściach Arabidopsis thaliana (1) oraz liściach (2) i korzeniach siewek pszenżyta (3). Rodzaj oraz liczba izoenzymów GDH u roślin zależy od rodzaju tkanki, stadium rozwoju a także od warunków środowiska zewnętrznego. Podjednostki α i β są kodowane przez różne geny. Regulacja aktywności roślinnej GDH odbywa się głównie na poziomie transkrypcji. Nadmiar amoniaku w komórkach, niezależnie od jego pochodzenia jest toksyczny i musi być szybko metabolizowany. Dehydrogenaza glutaminianowa jak obrazuje to schemat reakcji uczestniczy w przekształcaniu jonu amonowego w azot α aminowy kwasu glutaminowego. Z tego względu, GDH u wszystkich organizmów żywych bierze udział w utrzymaniu homeostazy jonów amonowych i kwasu glutaminowego. U roślin jon amonowy jest tą formą azotu, która może być przez nie przyswajana. Do niedawna uważano, że odbywa się to właśnie dzięki redukcyjnej aminacji 2-oksoglutaranu przez dehydrogenazę glutaminianową. W świetle najnowszej literatury rola roślinnej GDH w przyswajania azotu ma znaczenie drugorzędne, a głównym mechanizmem asymilacji azotu w warunkach fizjologicznych jest cykl syntetaza glutaminy i syntaza glutaminianowa GS/GOGAT. Badania na roślinach transgenicznych wykazały, że głównym zadaniem dehydrogenazy glutaminianowej jest deaminacja kwasu glutaminowego, natomiast w warunkach stresu abiotycznego enzym może także katalizować reakcję asymilacji amoniaku. Zasady zastosowanych metod Do częściowego oczyszczenia GDH wyekstrahowanej z siewek pszenżyta wykorzystuje się działanie podwyższonej temperatury oraz wysalanie siarczanem amonu. Białka wrażliwe na działanie podwyższonej temperatury (termolabilne) łatwo ulegają denaturacji i wypadają z roztworu w postaci osadu. Dehydrogenaza glutaminianowa jest białkiem termostabilnym i dlatego w temperaturze 50 C pozostaje w roztworze prawie nie tracąc aktywności. Odwirowanie ekstraktu i odrzucenie zdenaturowanych białek pozwala na uzyskanie preparatu GDH o kilkakrotnie wyższej aktywności właściwej. Drugim etapem oczyszczania jest wysolenie enzymu za pomocą siarczanu amonu (NH 4 ) 2 SO 4. Zaletą wysalania jest to, że białko zachowuje natywną strukturę. Wykorzystywane jest tu zjawisko różnej rozpuszczalności białek w stężonych roztworach soli obojętnych. 2

3 Białka zawierające więcej aminokwasów hydrofobowych ulegają wytrąceniu przy niższym wysyceniu solą w porównaniu z białkami bardziej hydrofilowymi. Stąd jest możliwe zastosowanie tej procedury do frakcjonowania białek. Białko po precypitacji może ponownie zostać rozpuszczone w mniejszej objętości buforu. Dodając (NH 4 ) 2 SO 4 w ilości pozwalającej na 60 % wysycenie roztworu tą solą wytrąca się grupę białek, wśród których znajduje się GDH. Metoda oznaczania aktywności GDH polega na pomiarze szybkości spadku absorbancji przy długości fali 340 nm wskutek utleniania NADH do NAD + przez tę oksydoreduktazę. Miarą aktywności właściwej GDH jest ilość µmoli utlenionego NADH w czasie 1 minuty w przeliczeniu na 1 miligram białka (µmole utlenionego NADH x min -1 x mg białka -1 ). W miarę oczyszczania aktywność właściwa enzymu wzrasta. Białko w surowym ekstrakcie z tkanek pszenżyta oraz w preparatach po każdym etapie oczyszczania oznaczane jest metodą Bradford. Metoda opiera się na zdolności wiązania formy anionowej barwnika, błękitu brylantowego Coomassie G-250 (ang. Coomasie Brillant Blue (CBB)) przez reszty argininy, lizyny oraz w mniejszym stopniu histydyny i aminokwasów aromatycznych (tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina) w białkach (Bradford 1976). Wiązanie ma charakter oddziaływań elektrostatycznych. CBB G-250 w środowisku kwaśnym ma brunatne zabarwienie, które po reakcji z białkami zmienia się na błękitne. Wiąże się z tym zmiana maksimum absorbancji z 465 nm na 595 nm. Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze. Mając wyznaczoną krzywą kalibracyjną dla białka wzorcowego (np. albuminy z surowicy bydlęcej, ang. BSA) można określić zawartość białka w badanej próbie poprzez pomiar absorbancji przy długości fali 595 nm. Odczynniki 1. 0,2 M bufor Tris-HCl o ph 7,8 zawierający 2 mm merkaptoetanol (ME) 2. Krystaliczny siarczan amonu ((NH 4 ) 2 SO 4 ) 3. 1,2 M chlorek amonu (NH 4 Cl) 4. 0,005 M NADH 5. 0,5 M 2-oksoglutaran 6. Odczynnik Bradford Wykonanie 1. Ekstrakcja dehydrogenazy glutaminianowej (w grupach) Odpowiednią naważkę drobno pociętej tkanki dokładnie rozetrzeć w moździerzu z dodatkiem 2 g piasku, następnie dodać zimnego 0,2 M buforu Tris-HCl o ph 7,8 z dodatkiem 5 mm ME w stosunku 4 ml buforu na 1g tkanki i rozcierać jeszcze przez 2 minuty. Uzyskany homogenat przenieść do probówek wirówkowych, zrównoważyć je parami i wirować przez 3

4 15 minut w temperaturze 4 C przy x g (wirówka MPV-350R). Supernatant (ciecz nadosadową) ostrożnie zlać do cylindra, a osad odrzucić. Pobrać 1 ml supernatantu do probówki typu Eppendorf i zachować do oznaczenia białka i aktywności GDH w surowym ekstraktcie. Zmierzyć objętość pozostałego supernatantu. 2. Oczyszczanie dehydrogenazy glutaminianowej ( w grupach) Supernatant przenieść do probówki chemicznej i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 50 C przez 20 minut. Następnie probówkę schłodzić w lodzie przez 5 min. Wytrącony podczas ogrzewania osad białek odwirować (15 minut w temperaturze 4 C przy x g). Supernatant przelać do cylindra miarowego, pobrać z niego 1 ml do probówki typu Eppendorf i zachować do oznaczenia białka oraz aktywności enzymu, zanotować objętość ekstraktu w cylindrze. Osad odrzucić. Zawartość cylindra przenieść do zlewki umieścić w wodzie z lodem na mieszadle, i dodawać małymi porcjami odpowiednią ilość krystalicznego (NH 4 ) 2 SO 4 do 60% nasycenia roztworu. Po 10 minutach dodatkowego mieszania całość odwirować jak podano wyżej. Supernatant odrzucić, a osad zawierający GDH dokładnie rozpuścić w 1-2 ml buforu do ekstrakcji. Tak jak na poprzednich etapach oznaczyć białko i aktywność enzymu. Wielkość naważki krystalicznego (NH 4 ) 2 SO 4 niezbędnej do wysalania można wziąć z tabeli lub obliczyć z równania: gdzie: V objętość początkowa ekstraktu, S 1 nasycenie początkowe w ułamkach dziesiętnych, S 2 nasycenie pożądane w ułamkach dziesiętnych, 53,3 współczynnik: liczba g (NH 4 ) 2 SO 4 w 100 ml nasyconego roztworu, 0,3 współczynnik korekcji objętości roztworu końcowego. 3. Oznaczanie aktywności dehydrogenazy glutaminianowej Do kuwety odmierzyć poszczególne składniki mieszaniny reakcyjnej w następujących ilościach: Składnik mieszaniny reakcyjnej Objętość (ml) Bufor Tris-HCl ph 7,8 2,2 NH 4 Cl 0,5 NADH 0,1 Enzym (surowy ekstrakt, supernatant lub rozcieńczony buforem 0,2 roztwór wysolonego enzymu) 4

5 Po dokładnym wymieszaniu zawartości kuwety, mierzyć absorbancję przy długości fali 340 nm w ciągu 3 minut dokonując odczytu co 1 min, po czym dodać 0,1 ml 2-oksoglutaranu wymieszać i zanotować wartość absorbancji. Pozostawiając kuwetę w spektrofotometrze notować wartości absorbancji przez 10 min, co minutę. Wyniki pomiarów, bez 2- oksoglutaranu świadczą o utlenianiu NADH bez udziału GDH. Szybkość reakcji katalizowanej przez GDH mierzyć w temperaturze pokojowej. 4. Oznaczanie białka metodą Bradford W próbach pochodzących z poszczególnych etapów oczyszczania GDH oznaczyć białko. Przed wykonaniem oznaczenia ekstrakty z części nadziemnych roślin należy 20-krotnie rozcieńczyć wodą dejonizowaną a próbę zawierającą wysolony enzym 10-krotnie. Następnie do probówek typu Eppendorf pobrać w dwóch powtórzeniach po 50 µl rozcieńczonych ekstraktów, po 750 µl wody dejonizowanej oraz po 200 µl odczynnika Roti - Quant i dokładnie wymieszać. Równolegle przygotować próbę materiałową zawierającą 800 µl wody dejonizowanej i 200µl odczynnika Roti - Quant. Po upływie 10 minut zmierzyć absorbancję prób przy długości fali 595 nm wobec próby materiałowej. Zawartość białka w próbach odczytać z krzywej wzorcowej. Uwzględniając objętości preparatu enzymatycznego obliczyć stężenie białka na poszczególnych etapach oczyszczania. 5. Opracowanie wyników W celu obliczenia szybkość reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę glutaminianową należy uśrednić wyniki pomiarów absorbancji bez 2-oksoglutaranu i odjąć je od uśrednionych wyników pomiarów w obecności tego substratu. Otrzymane różnice odzwierciedlają ilość utlenionego NADH (powstałego NAD) w ciągu jednej minuty w wyniku aktywności dehydrogenazy glutaminianowej. Aktywność enzymu należy obliczyć według następującego wzoru: gdzie: A/min - różnica absorbancji w ciągu 1 min.; ε - milimolowy współczynnik absorbancji dla NADH równy 6,22; d grubość warstwy badanego roztworu w cm, w warunkach ćwiczenia wynosi 1 cm; V k końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej; V p objętość wyciągu enzymatycznego (próby) 5

6 Bilans oczyszczania białka Po uwzględnieniu objętości preparatu enzymatycznego obliczyć całkowitą aktywność enzymu (µmol min -1 ) na poszczególnych etapach oczyszczania. Celem określenia jak skutecznie przebiega procedura oczyszczania enzymu należy obliczyć jego aktywność właściwą na każdym etapie. Obliczamy ją dzieląc aktywność całkowitą enzymu przez ilość białka zawartego w danej frakcji. Miarą skuteczności procedury oczyszczania jest stopień oczyszczenia, czyli iloraz aktywności właściwej preparatu enzymatycznego i aktywności właściwej surowego ekstraktu. Wreszcie istotną rzeczą jest wydajność procesu oczyszczania, którą obliczamy w procentach dzieląc aktywność całkowitą surowego ekstraktu przez aktywność całkowitą enzymu na poszczególnych etapach oczyszczania. Uzyskane wyniki zestawić w tabeli według załączonego wzoru: Etap oczyszczania Aktywność całkowita GDH (µmol min -1 ) Białko (mg) Aktywność właściwa GDH (µmol min -1 mg -1 ) Stopień oczyszczenia Wydajność oczyszczania (%) Surowy ekstrakt Ogrzewanie w temperaturze 50 C Wysalanie siarczanem amonu (0-60%) wysycenia Literatura 1. Kłyszejko-Stefanowicz L. Ćwiczenia z biochemii Wydawnictwo Naukowe PWN Kwinta J, Bielawski W (1998) Glutamate dehydrogenase in higher plants. Acta Physiol Plant 20: Duke SH, Koukkari WL, Soulen TK (1975) Glutamate Dehydrogenase Activity in Roots: Distribution in a Seedling and Storage Root, and the Effects of Red and Far-red Illuminations. Plant Physiol 34: Ferraro G, Bortolotti S, Mortera P, Sclereth A, Stitt M, Carrari F, Kamenetzky L, Valle EM (2012) Novel glutamate dehydrogenase genes show increase transcript and protein abundances in mature tomato fruits. J Plant Physiol 169: Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: