Genomic Maxi AX zestaw do izolacji genomowego DNA wersja 0616

Transkrypt

1 Genomic Maxi AX zestaw do izolacji genomowego DNA wersja izolacji Nr kat Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 500 µg 1

2 Skład zestawu Składnik Ilość Temp. Przechowywania Kolumny Spin 500AX 10 szt. +4 do +8 C Probówki o poj. 50 ml typu Falcon 4 x 5 szt. Temp. Pok. Kolumna równoważąca 1 szt. Temp. Pok. L1.4 roztwór lizujący 55 ml Temp. Pok. K2 roztwór płuczący 120 ml Temp. Pok. K3 roztwór elucyjny 55 ml Temp. Pok. Bufor TE 80 ml Temp. Pok. Izopropanol 45 ml Temp. Pok. Proteinaza K 2 x 1,1 ml +4 do +8 C Wyposażenie i materiały niezbędne do izolacji DNA, które nie wchodzą w skład zestawu 1. Materiał do izolacji DNA 2. Enzymy (opcjonalnie w zależności od rodzaju materiału): Lizozym - 10 mg/ml, 400 U/µl (nr kat , ) Lizostafyna - 1 mg/ml, 0,4 U/µl (nr kat , ) Mutanolizyna - 10 U/µl (nr kat , , ) 3. RNAza - 10 mg/ml (nr kat , ) (opcjonalnie) 4. Woda jałowa wolna od nukleaz (nr kat , ) (opcjonalnie) 5. 70% etanol 6. Probówki o poj. 50 ml typu Falcon 7. Vortex 8. Wirówka z rotorem do wirowania probówek o poj. 50 ml typu Falcon 9. LabZAP do oczyszczania powierzchni roboczych (nr kat ) UWAGA: Przed przystąpieniem do pracy zawsze oczyść powierzchnię roboczą używając produktu LabZAP Firma A&A Biotechnology udziela rocznej gwarancji na niniejszy zestaw. Firma nie gwarantuje poprawnego działania zestawu do izolacji DNA w przypadku: odstępstwa od dostarczonego wraz z zestawem protokołu braku zalecanego w niniejszym protokole wyposażenia i materiałów użycia innych odczynników niż zalecane lub które nie wchodzą w skład zestawu użycia przeterminowanych lub niewłaściwie przechowywanych odczynników oraz kolumn 2

3 Przygotowanie materiału Krew świeża lub mrożona 1. Przenieść 5 ml krwi do probówki o poj. 50 ml typu Falcon. Uwaga: w przypadku mniejszej ilości krwi niż 5 ml należy dodać buforu TE do całkowitej objętości 5 ml. 2. Dodać po 5 ml buforu lizującego L 1.4 oraz 200 µl Proteinazy K. 3. Całość wymieszać. Inkubować 20 min w temp. 50 C. Uwaga: Nie przedłużać inkubacji 4. Po inkubacji intensywnie worteksować próbkę przez 20 s. 5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. Bakterie 1. Przenieść 5-20 ml hodowli bakteryjnej do probówki o poj. 50 ml typu Falcon. 2. Odwirować. Usunąć supernatant. 3. Osad zawiesić w 5 ml buforu TE. Dodać po 50 µl Lizozymu (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat , ). Inkubować 15 min w temp. 37 C. Uwaga: dla S.aureus zalecamy traktowanie Lizostafyną (nie ma w zestawie, nr kat , ); dla Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Listeria zalecamy traktowanie Mutanolizyną (nie ma w zestawie, nr kat , , ). 4. Dodać po 5 ml buforu lizującego L1.4 oraz 200 µl Proteinazy K. 5. Całość wymieszać przez odwracanie probówki. Inkubować w temp. 50 C do osiągnięcia całkowitej klarowności mieszaniny (zwykle 60 min). Opcjonalne usuwanie RNA: do próbki należy dodać 10 µl RNAzy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat , ). Następnie całość wymieszać i pozostawić próbkę na 5 min w temp. pokojowej. 6. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. Hodowle komórkowe 1. Przenieść 1,5 x x 10 7 hodowli komórkowych do probówki o poj. 50 ml typu Falcon. Odwirować. Usunąć supernatant. 2. Osad zawiesić w 5 ml buforu TE. Dodać po 5 ml buforu lizującego L 1.4 oraz 200 µl Proteinazy K. 3. Całość wymieszać przez odwracanie probówki. Inkubować w przez 30 min w temp. 50 C. Opcjonalne usuwanie RNA: do próbki należy dodać 10 µl RNAzy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat , ). Następnie całość wymieszać i pozostawić próbkę na 5 min w temp. pokojowej. 4. Całość wirować 10 min przy x g. Przenieść supernatant do nowej probówki o poj. 50 ml typu Falcon. 5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. 3

4 Tkanki 1. Pociąć ok mg tkanki na małe fragmenty lub rozetrzeć w ciekłym azocie i przenieść do probówki o poj. 50 ml typu Falcon. 2. Dodać po 5 ml buforu TE, 5 ml buforu lizującego L 1.4 oraz 200 µl Proteinazy K. 3. Całość wymieszać przez odwracanie probówki. Inkubować w temp. 50 C do całkowitego strawienia tkanki (zwykle min). Próbkę należy mieszać od czasu do czasu. Opcjonalne usuwanie RNA: do próbki należy dodać 10 µl RNAzy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat , ). Następnie całość wymieszać i pozostawić próbkę na 5 min w temp. pokojowej. 4. Całość wirować 10 min przy x g. Przenieść supernatant do nowej probówki o poj. 50 ml typu Falcon. 5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. Protokół izolacji 1. Przygotowane próby nanieść na kolumny Spin 500AX umieszczone w probówkach o poj. 50 ml typu Falcon. W przypadku nieparzystej ilości próbek należy użyć do zrównoważenia kolumny równoważącej, dodając do niej odpowiednie ilości wody lub dowolnego roztworu równoważącego. 2. Wirować w rotorze uchylnym 2 min przy 4000 RPM. 3. Kolumny Spin 500AX przenieść do nowych probówek 50 ml typu Falcon (w zestawie). Nanieść na kolumny po 5 ml roztworu płuczącego K2. 4. Wirować w rotorze uchylnym 2 min przy 4000 RPM. 5. Następnie nanieść na kolumny Spin 500AX po 5 ml roztworu płuczącego K2. 6. Wirować w rotorze uchylnym 2 min przy 4000 RPM. 4

5 7. Przenieść kolumny Spin 500AX do nowych probówek 50 ml typu Falcon (w zestawie). Wymywać oczyszczone DNA przez dodanie po 2,5 ml roztworu elucyjnego K3. 8. Inkubować 2 min w temp. pokojowej. 9. Wirować 1 min przy 4000 RPM. 10. Dodać po 2,5 ml roztworu elucyjnego K Wirować 1 min przy 4000 RPM. 12. Usunąć kolumny Spin 500AX. Średnia objętość eluatu powinna wynieść około 5 ml. Dodać do eluatu DNA po 4 ml izopropanolu. Zamknąć wieczka probówek i wymieszać przez kilkakrotne odwracanie probówek. Jeśli jest widoczny biały precypitat, należy przejść do punktu A. Jeśli biały precypitat nie jest widoczny, należy przejść do punktu B. 5

6 A. Biały precypitat jest widoczny 1. Wirować 2 min przy 4000 RPM. 2. Ostrożnie usunąć supernatanty, a osady płukać przez dodanie 2 ml 70% etanolu (nie ma w zestawie). 3. Wirować 2 min przy 4000 RPM. 4. Ostrożnie usunąć supernatanty, a osady suszyć 10 min w temp. pokojowej przez odwrócenie probówek. 5. Osady DNA zawiesić w odpowiedniej ilości buforu TE (w zestawie) lub wody jałowej wolnej od nukleaz (nie ma w zestawie). DNA przechowywać w temp. +4 ºC lub -20 ºC do czasu dalszych analiz. W celu przyspieszenia rozpuszczania DNA można inkubować próbkę w temp. 50 C od czasu do czasu delikatnie wytrząsając. B. Biały precypitat nie jest widoczny 1. Przenieść próbki do nowej probówki wirówkowej dostosowanej do wysokich prędkości wirowania. Wirować 30 min przy x g. 2. Ostrożnie usunąć supernatanty, a osady płukać przez dodanie 2 ml 70% etanolu (nie ma w zestawie). 3. Wirować 5 min przy x g. 4. Ostrożnie usunąć supernatanty, a osady suszyć 10 min w temp. pokojowej przez odwrócenie probówek. 5. Osady DNA zawiesić w odpowiedniej ilości buforu TE (w zestawie) lub wody jałowej wolnej od nukleaz (nie ma w zestawie). DNA przechowywać w temp. +4 ºC lub -20 ºC do czasu dalszych analiz. W celu przyspieszenia rozpuszczania DNA można inkubować próbkę w temp. 50 C od czasu do czasu delikatnie wytrząsając. 6

7 Elementy do zamówień dodatkowych Produkt Ilość Nr kat. Proteinaza K roztwór (20 mg/ml) 1,1 ml mg L Proteinaza K liofilizat 100 mg L 250 mg L 1000 mg L Bufor TE 100 ml Lizozym roztwór (10 mg/ml, 400 U/µl) Lizostafyna roztwór (1 mg/ml, 0,4 U/µl) Mutanolizyna roztwór (10 U/µl) RNAza roztwór (10 mg/ml) 1 ml ml U U U U U ml ml

8 Informacje bezpieczeństwa NIEBEZPIECZEŃSTWO Proteinaza K H315 Działa drażniąco na skórę. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P261 Unikać wdychania pyłu. P342+P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego skontaktować się z Ośrodkiem Zatruć lub lekarzem. UWAGA L1.4 roztwór lizujący H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. NIEBEZPIECZEŃSTWO K2 roztwór płuczący H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. NIEBEZPIECZEŃSTWO K3 roztwór elucyjny H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. NIEBEZPIECZEŃSTWO Izopropanol H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. C. 8