RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 210411 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 383861 (22) Data zgłoszenia: 23.11.2007 (51) Int.Cl. C12N 9/88 (2006.01) C12Q 1/527 (2006.01) C12N 11/00 (2006.01) (54) Sposób otrzymywania α-enolazy z nerki człowieka (43) Zgłoszenie ogłoszono: 25.05.2009 BUP 11/09 (73) Uprawniony z patentu: AKADEMIA MEDYCZNA IM. PIASTÓW ŚLĄSKICH WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.01.2012 WUP 01/12 (72) Twórca(y) wynalazku: JADWIGA PIETKIEWICZ, Wrocław, PL IRENEUSZ CEREMUGA, Brzeg, PL ANDRZEJ GAMIAN, Wrocław, PL PAWEŁ CHUDOBA, Wrocław, PL PL 210411 B1
2 PL 210 411 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania α-enolazy z nerki człowieka uzyskanej jako organ niewykorzystany do przeszczepu ze względu na brak odpowiedniego biorcy, znajdującej zastosowanie w diagnostyce klinicznej do monitorowania obecności przeciwciał anty-α-enolazowych w surowicach patologicznych i wykorzystywanej w biochemii do badań podstawowych. Enolaza jest enzymem szlaku glikolizy, przemiany powszechnie występującej w komórkach eukariota i prokariota, dostarczającej energii dla utrzymywania procesów życiowych. W ustroju człowieka i niższych ssaków enolaza występuje w formie izoenzymów tkankowo-specyficznych. W mięśniach poprzecznie prążkowanych dominuje izoenzym β, w neuronach i tkance endokrynnej - izoforma γ, ale najbardziej pospolita jest α-enolaza. Występuje ona w komórkach wątroby, nerek, płuc, śledziony, trzustki, w erytrocytach. Wiele nowych doniesień wskazuje, że α-enolaza jest białkiem wielofunkcyjnym i poza funkcją katalityczną spełnia inne, nieenzymatyczne zadania. Po wyeksponowaniu na powierzchni różnych komórek, α-enolaza jest białkiem receptorowym dla plazminogenu. Aktywacja tego zymogenu do plazminy nadaje komórkom powierzchniową aktywność proteolityczną, co może być przez nie wykorzystywane nie tylko do rozkładania fibryny w procesie fibrynolizy, ale również do degradacji białek macierzy zewnątrz-komórkowej. Układ α-enolaza/plazminogen, wykorzystują komórki systemu obronnego w migracji do rejonów zapalnych, komórki nowotworowe w procesach rozrostu guza i przerzutowaniu, a komórki patogenów do kolonizacji tkanek gospodarza. Wykazano, że w różnych stanach chorobowych wynikających z infekcji lub wskutek niekontrolowanego wzrostu i proliferacji komórek zmienionych nowotworowo, pojawiają się w układzie krążenia przeciwciała skierowane przeciwko α-enolazie. Mogą one reagować z rodzimą α-enolazą wyeksponowaną na powierzchni własnych komórek ustroju człowieka, co prowadzi do rozwoju chorób autoimmunoagresyjnych. Wykrywanie takich przeciwciał w surowicach pacjentów daje podstawy klinicystom na monitorowanie rozwoju choroby i sprawdzanie skuteczności stosowanej terapii. Wydzielona z tkanki ludzkiej α-enolaza jest predestynowana do wykorzystana jako specyficzny antygen do wykrywania w surowicach patologicznych obecności przeciwciał anty-α-enolazowych. Opisywane w doniesieniach metody oczyszczania różnych izoenzymów enolazy z tkanek człowieka i ssaków oparte są na ekstrakcji białek z frakcji cytosolowej, częściowym usuwaniu białek balastowych w etapach denaturacji termicznej i wysalania, a następnie frakcjonowaniu chromatograficznym w kolumnach wypełnionych różnymi nośnikami. Alfa-enolazę z nerki człowieka otrzymano dotychczas tylko jako wstępnie oczyszczone białko w metodzie opisanej przez: Pratesi F., Moscato S., Sabbatini A., Chimenti D., Bombardieri S., Migliorini P., J. Rheumatol. (2000) 27 : 109-115. Autoantibodies specific for α-enolase in systemic autoimmune disorders. Mrożoną tkankę zawieszano w 0.05M buforze Tris-HCl ph 6.8 zawierającym inhibitory proteaz : 0.002 M PMSF i leupeptynę -10 μg/ml. Materiał sonikowano w łaźni lodowej i wirowano przy 15 000 g przez 15 minut w 4 C. Białka ekstraktu rozdzielano w kolumnie wypełnionej CM-celulozą (Whatman). Związaną z kationitem α-enolazę eluowano gradientem NaCl. Brak jest danych o czystości otrzymanego czystego enzymu, jego aktywności i wydajności procesu. Dokładniej opisano sposoby otrzymywania α-enolazy z nerki wieprzowej. W sposobie przedstawionym w publikacji: Wakui H., Imai H., Komatsuda A., Miura A.B., Clin. Exp. Immunol. (1999) 118: 445-450. Circulating antibodies against α-enolase in patients with primary membranous nephropathy (MN). Ekstrakcję białek z nerki wieprzowej wykonywano w buforze Tris-HCl ph 7,4 o słabej sile jonowej, a białka z ekstraktu wysalano siarczanem amonowym w zakresie 50-80% nasycenia. W dalszych etapach oczyszczania zastosowano chromatografię kolumnową wykorzystując anionit DEAE-celulozę, kationit CM-celulozę oraz złoże hydrofobowe w postaci hydroksyapatytu. W publikacji nie podano bilansu preparacji, co powoduje, że brak jest danych o wydajności procesu, natomiast pokazany rozdział elektroforetyczny uzyskanego preparatu wskazuje na otrzymanie homogennej α-enolazy z nerki wieprzowej. Inna metoda wydzielania α-enolazy z nerki wieprzowej została opisana w publikacji: Oh S.K., Brewer J.M., Arch. Biochem. Biophys. (1973) 157: 491-499. Purification and properties of enolase from swine kidney, z podaniem pełnego bilansu oczyszczania. Porcję tkanki homogenizowano w podwójnej objętości wody destylowanej przez 3 minuty, mieszano w temperaturze 4 C przez 1 godzinę, po czym wirowano przy 10000 g przez 30 minut. Do uzyskanego supernatantu dodano 0,01 M MgSO 4 i 0,001 M EDTA, a następnie denaturowano część białek w temperaturze 55 C przez 3 minuty. Po wirowaniu zawartości przy 10000 g przez 30 minut, osad zdenaturowanych białek
PL 210 411 B1 3 odrzucono, a denaturację termiczną powtórzono po dodaniu do supernatantu 0,1 mm 2-fosfoglicerynianu jako substratu enolazy. Następnie wysalano z supernatantu frakcję białek zawierającą aktywną enolazę, stosując stały siarczan amonowy w zakresie nasycenia 55-75%. Wytrącone białka wirowano przy 10000 g przez 30 minut, zebrany osad rozpuszczono w 100 ml wody i odsalano w kolumnie Sephadex G-75, zrównoważonej 0,01 M buforem imidazol-hcl ph 7,0 z 0,002 M MgCh. Frakcje z aktywną enolazą zebrano, doprowadzono do ph 8,0 za pomocą 1 M Tris i frakcjonowano w kolumnie wypełnionej DEAE-celulozą, zrównoważoną buforem 0,01 M Tris-HCl ph 8,0 zawierającym 0,002 M MgCl 2. Związaną w tych warunkach enolazę eluowano liniowym gradientem 0,01-0,1 M Tris-HCl ph 8,0. Zebrane frakcje z aktywnym enzymem zagęszczano i nanoszono na kolumnę DEAE-Sephadex A-50. Z reguły enolaza nie była wiązana w tych warunkach, ale jeśli adsorbcja zachodziła, związane białko eluowano gradientem 0,00-0,05 M NaCl w 0,01 M Tris-HCl ph 8,0 z 0,002 M MgCl 2. Zebrane po tym etapie frakcje z aktywnym enzymem zagęszczano, doprowadzano do ph 7,0 roztworem 1 M imidazolu i oczyszczano w kolumnie CM-Sephadex C-50, zrównoważonej buforem 0,01 M imidazol-hcl ph 7,0 z 0.002 M MgCl 2. Związaną w tych warunkach enolazę eluowano w liniowym gradiencie 0,00-0,05 M NaCl. Uzyskane białko odsalano w kolumnie Sephadex G-100. Z ok. 550 g nerki wieprzowej uzyskano w ten sposób 15,4 mg homogennej α-enolazy o aktywności specyficznej 90 U/mg, z wydajnością 6%. Znane sposoby wydzielania homogennej α-enolazy z nerki wieprzowej wymagają zastosowania wielu etapów, zaś stosowane bufory używane do ekstrakcji mogą narazić białka ekstraktu na degradację proteolityczną ze względu na brak inhibitorów proteaz. W metodzie opisanej przez Oh'a i Brewer'a etap homogenizacji tkanki wykonywano w wodzie destylowanej, a sole magnezu dodawano dopiero w kolejnym etapie. Przed etapem wysalania białek wprowadzano dodatkowo denaturację termiczną, a dalsze oczyszczanie wymagało zastosowania pięcioetapowej chromatografii. Wydłużało to czas preparacji, zwiększało jej koszty, generowało straty aktywności, co powodowało, że wydajność procesu nie była wysoka. Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania α-enolazy z nerki człowieka poprzez ekstrakcję buforem Tris-HCl, wysalanie siarczanem amonowym oraz oczyszczanie metodą chromatografii kolumnowej. Istota wynalazku polega na tym, że w etapie ekstrakcji stosuje się bufor Tris-HCl o stężeniu 0,02 M i ph 7,2, zawierający 0,003 M siarczanu magnezowego, 0,01% objętościowych 2-merkaptoetanolu i inhibitory proteaz, a mianowicie PMSF o stężeniu 4 μl/ml oraz aprotyninę o stężeniu 2 μl/10 ml i homogenizuje, miesza i ponownie homogenizuje, po czym homogenat poddaje się wirowaniu, zaś otrzymany supernatant oddziela się i przesącza. Następnie prowadzi się wysalanie siarczanem amonowym w zakresie nasycenia 45-67% masowych, zaś otrzymany po wirowaniu osad z aktywną α-enolazą rozpuszcza się w buforze ekstrakcyjnym i dializuje do 0,02 M buforu Tris-HCl o ph 9,0 zawierającego 0,003 M siarczanu magnezowego i 0,001 M 2-merkaptoetanolu. Oczyszczanie prowadzi się najpierw na anionicie z użyciem DEAE-Sephadex A-50 zrównoważonym buforem Tris-HCl o ph 9,0, a następnie na kationicie CM-Sephadex C-50 zrównoważonym buforem fosforanowym (Na + ) o ph 6,0, zawierającym 0,003M siarczanu magnezowego i 0,001 M 2-merkaptoetanol. Korzystne jest, gdy wysalanie prowadzi się stałym siarczanem amonowym do nasycenia 45%, a po odwirowaniu do supernatantu dodaje się siarczan amonowy, aż do uzyskania nasycenia 67%. Korzystne jest, gdy po oczyszczaniu na anionicie zebrane frakcje z aktywnym enzymem zagęszcza się przez wirowanie w falkonach z błoną półprzepuszczalną, a następnie dializuje do buforu równoważącego kolumnę w następnym etapie oczyszczania. Korzystne jest, gdy po oczyszczaniu na kationicie zebrane frakcje z aktywnym enzymem zagęszcza się przez wirowanie w falkonach z błoną półprzepuszczalną, a następnie dializuje do buforu stabilizującego zawierającego 0,02 M imidazol ph 7,0, 0,003 M siarczan magnezu i 10% glicerol. Korzystne jest, jeżeli wszystkie etapy prowadzi się w temperaturze około 4 C. Sposobem według wynalazku wydziela się α-enolazę z nerki ludzkiej, zwłaszcza odrzuconej po przeszczepie, w której występuje ona w dużych stężeniach, nadającą się do wykorzystania jako specyficzny antygen pozwalający na wykrycie w patologicznych surowicach, między innymi w surowicach pacjentów cierpiących na toczeń trzewny, reumatoildalne zapalenie stawów czy retinopatię cukrzycową, obecności przeciwciał anty-α-enolazowych testem immunoenzymatycznym ELISA. Na tej podstawie możliwe jest skonstruowanie testu immunologicznego przydatnego w diagnostyce wielu różnych schorzeń autoimmuno-agresyjnych.
4 PL 210 411 B1 Ponadto otrzymywana tym sposobem czysta α-enolaza jest przeznaczona do badań podstawowych w biochemii jako białko modelowe do analizy procesów modyfikacji potranslacyjnych i w badaniach interakcji z innymi białkami. Ludzka α-enolaza służy także jako antygen do immunizacji zwierząt w celu otrzymywania przeciwciał na to białko i wykorzystania ich w badaniach immunochemicznych i immunohistochemicznych w skrawkach tkankowych i liniach komórkowych. W sposobie według wynalazku zastosowano do ekstrakcji bufor Tris-HCl o niskiej sile jonowej, ale zawierający jony magnezowe, stabilizujące aktywność α-enolazy oraz odpowiednie inhibitory proteaz w celu ochrony białek przed degradacją proteolityczną. Korzystne warunki ekstrakcji białek oraz wyeliminowanie denaturacji termicznej zmniejszyło straty aktywności α-enolazy na wstępnych etapach oczyszczania, natomiast wysalanie α-enolazy w zawężonym zakresie nasycenia siarczanu amonowego, w porównaniu do znanych sposobów, oraz wykorzystanie do zagęszczania roztworów białek metody ultrafiltracji z użyciem falkonów z błoną półprzepuszczalną, pozwoliło na usuwanie z supernatantów dużej ilości białek balastowych. Zastosowanie w pierwszej kolejności DEAE Sephadex A-50 do frakcjonowania białek pozwoliło na zaadsorbowanie znacznej ilości białek barwnych, co ułatwiło dalsze oczyszczanie α-enolazy. W rezultacie sposób według wynalazku pozwala uzyskać homogenny enzym z dobrą wydajnością, a mianowicie około 21%, o dużej aktywności specyficznej, około 80 U/mg i o wysokim stopniu oczyszczenia równym 220. Przedmiot wynalazku przedstawiono w przykładzie wykonania. Etap 1 - Ekstrakcja. Porcję nerki ludzkiej zadano trzema objętościami schłodzonego do 4 C buforu ekstrakcyjnego, dalej oznaczanego jako bufor A, o składzie 0,02 M Tris-HCl i ph 7,0, zawierającego 0,003 M MgSO 4, 0,01% (v/v) 2-merkaptoetanolu i inhibitory proteaz: PMSF o stężeniu 4 μl/ml oraz aprotyninę o stężeniu 2 μl/10 ml. Tkankę homogenizowano w czasie 5 minut i po delikatnym mieszaniu w ciągu następnych 5 minut, ponownie homogenizowano przez 4 minuty. Homogenat wirowano przy 4 500g przez 45 minut, a uzyskany supernatant sączono przez wyjałowioną gazę w celu usunięcia tłuszczów. Wszystkie czynności wykonywano w temperaturze 4 C. Etap 2 - Wysalanie. Z klarownego przesączu wysalano α-enolazę stałym siarczanem amonowym. Osad białek wytrącony przy nasyceniu 45% siarczanu amonowego odwirowano przy 20 000 g przez 45 minut i usuwano. Do supernatantu zawierającego aktywną α-enolazę dodawano siarczan amonowy do uzyskania nasycenia 67%. Po wirowaniu zawiesiny przy 20 000 g przez 45 minut zebrano osad zawierający aktywną α-enolazę, rozpuszczano go w 4 ml buforu A i dializowano do buforu 0,02 M Tris-HCl i ph 9,0, zawierającego 0,003 M MgSO 4 i 0,001 M 2-merkaptoetanol, dalej oznaczanego jako bufor B. Etap 3 - Oczyszczanie metodą chromatografii kolumnowej na anionicie. Klarowny roztwór białek frakcjonowano w kolumnie (4x30 cm) wypełnionej złożem DEAE-Sephadex A-50, produkowanym przez firmę Pharmacia, zrównoważonym buforem B. W tych warunkach duża część białek barwnych wiązała się z wymieniaczem. Alfa-enolaza nie absorbowała się i była eluowana buforem równoważącym. Zebrane frakcje z aktywnym enzymem łączono, zagęszczano metodą wirowania w falkonach z błoną półprzepuszczalną, firmy Amicon Ultra 15,30 kda, a następnie dializowano do 0,02 M buforu fosforanowego (Na + ) ph 6,0 zawierającego 0,003 M MgSO 4 i 0,001 M 2-merkaptoetanolu, dalej oznaczanego jako bufor C. Etap 4 - Oczyszczanie metodą chromatografii kolumnowej na kationicie. Uzyskany materiał nanoszono na kolumnę (4x20 cm) z CM-Sephadex C-50, zrównoważoną buforem C. W tych warunkach α-enolaza wiązała się z złożem i eluowano ją gradientem o ph 6,0-8,0 buforu C. Zebrane frakcje z aktywną α-enolazą łączono, zagęszczano w falkonach i dializowano do buforu stabilizującego zawierającego 0,2 M imidazol o ph 7,0, oraz 0,03 M MgSO 4 i 10% glicerol. Otrzymany enzym przechowywano w temperaturze -80 C. Wszystkie czynności wykonywano w temperaturze 4 C. Przykładowym sposobem z masy 1745 mg białka zawartego w ekstrakcie tkankowym nerki człowieka uzyskano 7,23 mg jednorodnej α-enolazy o aktywności specyficznej 78,3 U/mg i stopniu oczyszczenia 220. Wydajność metody wyniosła 21,3%. Bilans oczyszczania α-enolazy z 62 g nerki człowieka przedstawia poniższa tabela.
PL 210 411 B1 5 Etapy Masa białka (mg) Aktywność całkowita (U) Aktywność specyficzna (U/mg) Stopień oczyszczenia Wydajność % 1. Ekstrakcja 7450 2652 0,350 1 100 2. Wysalanie (45-67)% (NH 4 ) 2 SO 4 3. DEAE-Sephadex A-50 4. CM-Sephadex C-50 1364 2005 1,47 4 70 46,5 804 17,3 49 30 723 566 78,3 220 21,3 PIŚMIENNICTWO 1. Merkulova T., Lucas M., Jabet C, Lamande N., Rouzeau J.D., Gros F., Lazar M., Keller A.., Biochem. J. (1997) 323: 791-800. Biochemical characterization of the mouse muscle-specific enolase: developmental changes in electrophoretic variants and selective binding to other proteins. 2. Pancholi V., Cell. Mol. Life Sci. (2001) 58: 902-920. Multifunctional α-enolase: its role in diseases. 3. Liu K.J., Shih N.Y., J. Cancer Mol. (2007) 3:45-48. The role of enolase in tissue invasion and metastasis of pathogens and tumor cells. 4. Terrier B., Degand N., Guilpain P., Servettaz A., Guillevin L., Mouthon L., Autoimmunity Reviews (2007) 6: 176-182. Alphaenolase: a target of antibodies in infectious and autoimmune diseases. 5. Pratesi F., Moscato S., Sabbatini A., Chimenti D., Bombardieri S., Migliorini P., J. Rheumatol. (2000) 27: 109-115. Autoantibodies specific for α-enolase in systemic autoimmune disorders 6. Wakui H., Imai H., Komatsuda A., Miura A.B., Clin. Exp. Immunol. (1999) 118: 445-450. Circulating antibodies against α-enolase in patients with primary membranous nephropathy (MN) 7. Oh S.K., Brewer J.M., Arch. Biochem. Biophys. (1973) 157: 491-499. Purification and properties of enolase from swine kidney. 8. Rider C.C., Taylor C.B., Biochim. Biophys. Acta (1974) 365: 285-300. Enolase isoenzymes from rat tisues. Electrophoretic, chromatographic, immunological and kinetic properties. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania α-enolazy z nerki człowieka poprzez ekstrakcję buforem Tris-HCl, wysalanie siarczanem amonowym oraz oczyszczanie metodą chromatografii kolumnowej, znamienny tym, że w etapie ekstrakcji stosuje się bufor Tris-HCl o stężeniu 0,02 M i ph 7,2, zawierający 0,003 M siarczanu magnezowego, 0,01% objętościowych 2-merkaptoetanolu i inhibitory proteaz, a mianowicie PMSF o stężeniu 4 μl/ml oraz aprotyninę o stężeniu 2 μl/10 ml i homogenizuje, miesza i ponownie homogenizuje, po czym homogenat poddaje się wirowaniu, zaś otrzymany supernatant oddziela się i przesącza, po czym prowadzi się wysalanie siarczanem amonowym w zakresie nasycenia 45-67% masowych, zaś otrzymany po wirowaniu osad z aktywną α-enolazą rozpuszcza się w buforze ekstrakcyjnym i dializuje do 0,02 M buforu Tris-HCl o ph 9,0 zawierającego 0,003 M siarczanu magnezowego i 0,001 M 2-merkaptoetanolu, natomiast oczyszczanie prowadzi się najpierw na amonicie z użyciem DEAE-Sephad6ex A-50 zrównoważonym buforem Tris-HCl o ph 9,0, a następnie na kationicie CM- Sep-hadex C-50 zrównoważonym buforem fosforanowym (Na + ) o ph 6,0, zawierającym 0,003M siarczanu magnezowego i 0,001 M 2-merkaptoetanol. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wysalanie prowadzi się stałym siarczanem amonowym do nasycenia 45%, a po odwirowaniu do supernatantu dodaje się siarczan amonowy, aż do uzyskania nasycenia 67%. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po oczyszczaniu na anionicie zebrane frakcje z aktywnym enzymem zagęszcza się przez wirowanie w falkonach błoną półprzepuszczalną, a następnie dializuje do buforu równoważącego kolumnę w następnym etapie oczyszczania.
6 PL 210 411 B1 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po oczyszczaniu na kationicie zebrane frakcje z aktywnym enzymem zagęszcza się przez wirowanie w falkonach z błoną półprzepuszczalną, a następnie dializuje do buforu stabilizującego zawierającego 0,02 M imidazol ph 7,0, 0,003 M siarczan magnezu i 10% glicerol. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wszystkie etapy prowadzi się w temperaturze około 4 C. Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)