(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/IL02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/IL02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO02/ (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 31/01 ( ) A61P 9/10 ( ) (54) Kompozycja obejmująca fitoen, fitofluen lub ich mieszaniny oraz zastosowanie tej kompozycji (30) Pierwszeństwo: , IL, (73) Uprawniony z patentu: LYCORED NATURAL PRODUCTS INDUSTRIES LTD., Beer Sheva, IL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 20/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 04/11 (72) Twórca(y) wynalazku: MORRIS ZELKHA, Omer, IL TANYA SEDLOV, Beer Sheva, IL ZOHAR NIR, Meitar, IL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Zbigniew Kamiński PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest kompozycja obejmująca fitoen, fitofluen lub ich mieszaniny oraz zastosowanie tej kompozycji w hamowaniu postępu miażdżycy tętnic. Tło wynalazku Uważa się, że zapobieganie utlenianiu LDL jest ważnym czynnikiem w hamowaniu postępu miażdżycy tętnic. Istnieje wiele różnych leków przeciwko miażdżycy tętnic, np. leki z grupy wastatyny, zwane tutaj tradycyjnymi środkami przeciwko miażdżycy tętnic. Ponadto, karotenoidy, znane ze względu na ich działanie jako antyoksydanty, opisywano jako hamujące utlenianie LDL, co prowadzi do zahamowania postępu miażdżycy tętnic (patrz np. Krinsky, N., Free Radical Biology & Medicine, (1989) tom 7, str ). W opisie PCT/IL98/00286 ujawniono skuteczność synergistycznej mieszaniny likopenu i witaminy E w hamowaniu utleniania LDL, a zatem zatrzymanie postępu miażdżycy tętnic. Skuteczność karotenoidofitoenu i fitofluenu w hamowaniu utleniania LDL nie była badana. W opisie US nr przedstawiono kompozycję, która zawiera związki wybrane z długiej listy przeciwutleniaczy, przy czym nie ma żadnej wzmianki, które dwie z listy substancji są szczególnie korzystne według wynalazku. Kompozycja według US nr przedstawiona bardziej szczegółowo w przykładzie 7, odnosi się do wyjątkowej mieszaniny przeciwutleniaczy zawierającej kurkuminę i cały trans beta-karoten, cis beta-karoteny, cały trans alfa-karoten, cis alfa-karoteny, cały trans likopen, cis likopeny, cały trans gamma-karoten, cis gamma-karoteny, zeta-karoten, fitofluen, fitoen, witaminę C i witaminę E". W całym dokumencie US nr nie ma żadnej wzmianki, że fitofluen i fitoen lub ich mieszaniny są odpowiednie do uzyskania takiej aktywności hamowania utleniania LDL, która prowadziłaby do zatrzymania postępu miażdżycy tętnic. Co więcej, opis US nr sugeruje, że wskazane jest zastosowanie mieszaniny wszystkich wymienionych w zastrzeżeniach związków, a nie maksymalnie dwóch, jak w rozwiązaniu według wynalazku. Przedmiotem WO jest kompozycja zawierająca mieszaninę fitoenu i fitofluenu do ochrony przed uszkodzeniami powodowanymi przez promieniowanie UV. Wynalazek ten jest skierowany głównie na kompozycje stosowane do ochrony skóry przed stresem oksydacyjnym, jednak nie zawiera żadnych odniesień, ani nie wskazuje, że możliwe jest zastosowanie takiej kompozycji do zatrzymania postępu miażdżycy tętnic. Udział miażdżycy tętnic w chorobach serca jest dobrze znany. Dlatego istnieje stała potrzeba opracowania nowych kompozycji, które skutecznie hamują postęp miażdżycy tętnic. Zgodnie z powyższym, przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowej kompozycji, która wykazuje dużą skuteczność w hamowaniu utleniania LDL, a zatem zapewnia skuteczne przeciwdziałanie miażdżycy tętnic. Przedmiotem wynalazku jest kompozycja obejmująca fitoen, fitofluen lub ich mieszaniny do zastosowania w hamowaniu postępu miażdżycy tętnic. Korzystnie, kompozycja obejmuje przynajmniej 0,1 mg fitoenu albo 0,1 mg fitofluenu. W innym korzystnym rozwiązaniu kompozycja obejmuje przynajmniej 0,1 mg mieszaniny fitoenu i fitofluenu. Stosunek fitoenu i fitofluenu w mieszaninie korzystnie wynosi od około 1:20 do około 20:1. Kompozycja jest korzystnie w postaci stałych form dawkowania tabletki, kapsułki, kapsułki żelatynowej twardej, kapsułki żelatynowej miękkiej. W korzystnym rozwiązaniu kompozycja obejmuje farmaceutycznie dopuszczalny adiuwant, zaróbkę lub dodatek. Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie kompozycji zawierającej fitoen, fitofluen lub ich mieszaninę, do wytwarzania leku do hamowania postępu miażdżycy tętnic. Korzystnie, lek zawiera przynajmniej 0,1 mg fitoenu albo przynajmniej 0,1 mg fitofluenu, albo przynajmniej 0,1 mg mieszaniny fitoenu i fitofluenu. Stosunek fitoenu i fitofluenu w mieszaninie wynosi korzystnie od około 1:20 do około 20:1. Ponadto, kompozycja według wynalazku może być stosowana w ilości skutecznej do zahamowania utleniania LDL w żywności, dodatkach dietetycznych, artykułach żywnościowych i napojach, np. w ilości przynajmniej 0,1 mg fitoenu, 3 fitofluenu lub ich mieszanin.

3 PL B1 3 Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym: figury 1 (A), (B) przedstawiają wpływ krystalicznego naturalnego likopenu i oleorezyny z pomidorów na indukowane jonami miedzi utlenianie LDL, figury 2 (A), (B) przedstawiają wpływ fitofluenu/fitoenu na indukowane jonami miedzi utlenianie LDL, figura 3 przedstawia wpływ likopenu, witaminy E, β-karotenu i fitofluenu/fitoenu na utlenianie LDL, figura 4 przedstawia wpływ likopenu w połączeniu z przeciwutleniaczami na utlenianie LDL, figura 5 przedstawia wpływ β-karotenu w połączeniu z przeciwutleniaczami na utlenianie LDL, figura 6 przedstawia wpływ witaminy E w połączeniu z przeciwutleniaczami na utlenianie LDL, figura 7 przedstawia wpływ fitofluenu/fitoenu w połączeniu z przeciwutleniaczami na utlenianie LDL, figura 8 przedstawia wpływ połączenia przeciwutleniaczy na utlenianie LD, figura 9 przedstawia wpływ mieszaniny karotenoidów na utlenianie LDL. Szczegółowy opis korzystnego rozwiązania według wynalazku Poniższy opis stanowi przedstawienie korzystnych rozwiązań według wynalazku, lecz nie ogranicza zakresu wynalazku, gdyż zrozumiale jest, że osoba biegła w stanie techniki może przeprowadzić wiele oczywistych zmian w wynalazku. Opis dotyczy mieszanin fitoenu i fitofluenu, jak i każdego z tych związków osobno. Dlatego, gdy odniesienie jest czynione do mieszanin tych związków, to jest również z odniesieniem do każdego z karotenoidów oddzielnie. Badając wpływ różnych karotenoidów na utlenianie LDL niespodziewanie stwierdzono, że fitoen, fitofluen lub ich mieszaniny są zasadniczo bardziej skuteczne niż inne karotenoidy w hamowaniu utleniania LDL. Według wynalazku, przynajmniej 0,2 mg/dzień fitoenu, fitofluenu lub ich mieszanin, podaje się pacjentowi w celu hamowania utleniania LDL we krwi, a zatem zatrzymania postępu miażdżycy tętnic. Podawanie prowadzi się do uzyskania skutecznego stężenia fitoenu, fitofluenu lub ich mieszanin, we krwi zapewniającego przeciwdziałanie utlenianiu LDL, wynoszącego przynajmniej 0,01 μm. Poniższe przykłady ilustrują zasadniczo poprawioną skuteczność fitoenu i fitofluenu w porównaniu z innymi karotenoidami, w hamowaniu utleniania LDL. Przykłady Procedury ogólne Wszystkie badane związki rozpuszczono w THF do roztworu wyjściowego 1 mg/ml. LDL dializowano przez 24 godziny wobec roztworu soli w buforze fosforanowym (PBS) przed jego utlenieniem, aby usunąć cały EDTA, który może wpływać na utlenienie. LDL (100 μg białka/ml) inkubowano bez (kontrola) lub w obecności zwiększających się stężeń każdego z badanych związków, jak i w różnych połączeniach włącznie z 2, 3 lub 4 składnikami przy żądanym naturalnym rozmieszczeniu. Utlenianie LDL indukowano przez dodanie 5 μm CUSO 4, przez 2 godziny w temperaturze 37 C. Utlenianie LDL przerywano przez dodanie 1mM Na 2 EDTA i natychmiastowe schłodzenie w 4 C. Zakres utleniania LDL następnie wyznaczano przez pomiar ilości utworzonych substancji reaktywnych z kwasem tiobarbiturowym (thiobarbituric acid reactive substances - TBARS) i nadtlenków lipidowych (nadtlenków lipidowych - PD). Kontrola LDL była uzupełniona jedynie THF. P r z y k ł a d 1. Wpływ krystalicznego naturalnego likopenu i oleorezyny z pomidorów na indukowane jonami miedzi utleniania LDL Badania stężeniowe LDL (100 μg białka/ml) wstępnie inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37 C ze zwiększającymi się stężeniami krystalicznego czystego likopenu lub oleorezyną z pomidorów (przy równoważnym stężeniu likopenu), a następnie prowadzono dalszą inkubację przez 2 godziny w temperaturze 37 C w obecności 5 μmol\l CuSO 4. Utlenianie LDL mierzono metodami odpowiednio TBARS (A) lub nadtlenków lipidowych (B). Wyniki przedstawiono jako średnią ± SD (odchylenie standardowe) (n = 3). Dodanie zwiększających się stężeń likopenu hamowało indukowane jonami miedzi utlenianie LDL w stopniu umiarkowanym, w zależności od dawki. Najwyższe hamowanie, odpowiednio, 22% i 27% test TBARS (fig. 1A) i nadtlenków lipidowych (fig. 1B), otrzymano stosując 50 μmol/l likopenu. Jednakże, dodanie oleorezyny z pomidorów do lipoproteiny, hamowało utlenianie LDL w znacznie większym stopniu (około 90% hamowania), przy IC 50 (stężenie konieczne do hamowania utleniania LDL o 50%)

4 4 PL B1 wynoszącym 8,0 μmol/l i 8,4 mol/l ekwiwalentów likopenu do hamowania tworzenia odpowiednio TBARS (fig. 1A) i nadtlenków lipidowych (fig. 1B). P r z y k ł a d 2. Wpływ fitofluenu/fitoen na indukowane jonami miedzi utlenianie LDL Badania stężeniowe Fitofluen/fitoen hamowały w zależności od dawki, indukowane CuSO 4 utlenianie LDL, jak zmierzono testami odpowiednio TBARS 2 (A) i nadtlenków lipidowych 2 (B). Wartość IC 50 fitofluenu/fitoenu dla indukowanego jonami miedzi utleniania LDL wynosiła odpowiednio 0,25 μg/ml hamowania tworzenia TBARS i 0,35 μg/ml hamowania tworzenia nadtlenków lipidowych. P r z y k ł a d 3. Wpływ likopenu, witaminy E, β-karotenu i fitofluenu/fitoenu na utlenianie LDL Przy niskim stężeniu, które naśladuje kompozycję Lyc-O-Mato Likopen (10 μg/ml), witamina E (2,5 μg/ml) i β-karoten (0,4 ng/ml) nie wpływały znacząco na utlenianie LDL. Przeciwnie, fitofluen/fitoen (1,2 μg/ml) zasadniczo hamowały utlenianie LDL o 85-90%, jak analizowano testami TBARS i nadtlenków lipidowych. P r z y k ł a d 4. Wpływ likopenu w połączeniu z przeciwutleniaczami na utlenianie LDL Stosując likopen (10 μg/ml) w połączeniu z każdym z innych przeciwutleniaczy oddzielnie (2 związek w każdym badaniu), dodanie likopenu do β-karotenu (0,4 g/ml) lub witaminy E (2,5 μg/ml) hamowało utlenianie LDL (test TBARS) o odpowiednio 22% i 11%, w porównaniu do wpływu samego likopenu, podczas gdy dodanie fitofluenu/fitoenu (1,2 μg/ml) hamowało utlenianie LDL aż o 95%. Te wyniki, przedstawione na fig. 4 wykazują, że dodanie do likopenu β-karotenu lub witaminy E prowadzi do obniżenia, choć minimalnego, hamowania utleniania LDL, podczas gdy fitofluen/fitoen mają największą zdolność do działania jako najsilniejszy inhibitor utleniania LDL (same, jak i w połączeniu z likopenem). Podobne wyniki otrzymano dla utleniania LDL analizowanego testem nadtlenków lipidowych. P r z y k ł a d 5. Wpływ β-karotenu w połączeniu z przeciwutleniaczami na utlenianie LDL Jak przedstawiono na fig. 5, przy zastosowaniu β-karotenu jako głównego przeciwutleniacza samego lub w połączeniu z innymi przeciwutleniaczami, inaczej niż w przypadku likopenu, zupełnie nie obserwowano wpływu na utlenianie LDL samego lub w połączeniu z witaminą E. Hamujący wpływ (22%) na utlenianie LDL (TBARS) obserwowano, gdy β-karoten dodano w połączeniu z likopenem, a najsilniejsze hamowanie utleniania LDL (98% hamowania, w teście TBARS) otrzymano przy dodawaniu β-karotenu razem z fitofluenem/fitoenem. Podobne wyniki otrzymano dla utleniania LDL analizowanego testem nadtlenków lipidowych. P r z y k ł a d 6. Wpływ witaminy E w połączeniu z przeciwutleniaczami na utlenianie LDL Stosując witaminę E jako główny przeciwutleniacz, sam lub w połączeniu z 5 innymi przeciwutleniaczami, dodanie likopenu, lecz nie β-karotenu, hamowało utlenianie LDL o 12% (test TBARS). Dodanie fitofluenu/fitoenu do witaminy E prowadziło do 98% hamowania utleniania LDL. Podobne wyniki otrzymano w testach nadtlenków lipidowych, jak można zauważyć na fig. 6. P r z y k ł a d 7. Wpływ fitofluenu/fitoenu w połączeniu z przeciwutleniaczami na utlenianie LDL Jak przedstawiono na fig. 7, stwierdzono, że fitofluen/fitoen jest najsilniejszym badanym przeciwutleniaczem spośród badanych karotenoidów, prowadzącym do 90% hamowania utleniania LDL (test TBARS). Dodanie każdego z innych przeciwutleniaczy zmniejszało utlenianie LDL przy największym udziale obserwowanym dla likopenu. P r z y k ł a d 8. Wpływ połączenia przeciwutleniaczy na utlenianie LDL Analiza określonego wpływu różnych połączeń 3 przeciwutleniaczy razem. Jedynie, gdy frakcja fitofluenu/fitoenu była obecna w dowolnym połączeniu 3 badanych związków, obserwowano zasadnicze, ponad 90% hamowanie utleniania LDL. Gdy stosowano likopen, β-karoten i witaminę E w połączeniu lub bez fitofluenu/fitoenu, otrzymano jedynie minimalne hamowanie utleniania LDL, jak wykazano w obu testach TBARS i nadtlenku lipidowego, których wyniki przedstawiono na fig. 8. P r z y k ł a d 9. Wpływ mieszaniny karotenoidów na utlenianie LDL Wpływ Lyc-O-Mato porównano z mieszaniną karotenoidów otrzymanych z połączenia 5 związków zapobiegających utlenianiu w poniżej podanych stężeniach; likopen (10 μg/ml), β-karoten (0,4 μg/ml), witamina E (2,5 μg/ml) i fitoen/fitofluen (1,2 μg/ml). Jak przedstawiono na fig. 9, Lyc-O- -Mato powodował około 70% (test TBARS) hamowanie utleniania LDL. Wpływ hamujący mieszaniny karotenoidów na utlenianie LDL wynosił 96% (test TBARS). Podobne wyniki otrzymano w teście nadtlenków lipidowych.

5 PL B1 5 Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja obejmująca fitoen, fitofluen lub ich mieszaniny do zastosowania w hamowaniu postępu miażdżycy tętnic. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje przynajmniej 0,1 mg fitoenu. 3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje 0,1 mg fitofluenu. 4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje przynajmniej 0,1 mg mieszaniny fitoenu i fitofluenu. 5. Kompozycja według zastrz. 4 znamienna tym, że stosunek fitoenu i fitofluenu w mieszaninie wynosi od około 1: 20 do około 20:1. 6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jest w postaci stałych form dawkowania tabletki, kapsułki, kapsułki żelatynowej twardej, kapsułki żelatynowej miękkiej. 7. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje farmaceutycznie dopuszczalny adiuwant, zaróbkę lub dodatek. 8. Zastosowanie kompozycji zawierającej fitoen, fitofluen lub ich mieszaninę, do wytwarzania leku do hamowania postępu miażdżycy tętnic. 9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że lek zawiera przynajmniej 0,1 mg fitoenu. 10. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że lek zawiera przynajmniej 0,1 mg fitofluenu. 11. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że lek zawiera przynajmniej 0,1 mg mieszaniny fitoenu i fitofluenu. 12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że stosunek fitoenu i fitofluenu w mieszaninie wynosi od około 1:20 do około 20:1.

6 6 PL B1 Rysunki

7 PL B1 7

8 8 PL B1

9 PL B1 9

10 10 PL B1

11 PL B1 11

12 12 PL B1

13 PL B1 13

14 14 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)