Deproteinizacja jako niezbędny etap przygotowania próbek biologicznych

Transkrypt

1 Deproteinizacja jako niezbędny etap przygotowania próbek biologicznych Instrukcja do ćwiczeń opracowana w Katedrze Chemii Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego. 1. Wstęp Określenie próbka biologiczna jest bardzo szerokie i najczęściej rozumiane jako porcja materiału pobrana od organizmu żywego. Do próbek takich zalicza się zarówno materiał pochodzenia roślinnego oraz zwierzęcego, a niekiedy żywność w szerokim pojęciu obejmującym zarówno surowy materiał z produkcji rolnej, jak i wysokoprzetworzony produkt spożywczy. Często głównym składnikiem próbek biologicznych jest białko, które przysparza najwięcej problemów podczas analizy. Wprowadzenie białek, np. do systemu HPLC, powoduje szybki spadek sprawności kolumny i wzrost oporu, który powoduje podwyższenie ciśnienia fazy ruchomej. Wyjątek stanowią specjalne kolumny chromatograficzne, na które można nanosić rozcieńczone próbki zawierające białka. W związku z tym próbki biologiczne powinny być pozbawione białka, przed ich końcową analizą. Popularną metodą oddzielenia białek od analitu jest ich wytrącanie, przy zastosowaniu odpowiednich odczynników lub temperatury. Po wytrąceniu białka, próbkę poddaje się sączeniu lub wirowaniu. Alternatywną metodą jest wirowanie płynnego materiału biologicznego na odpowiednich filtrach membranowych typu cut off, pozwalających na separację białka od innych małocząsteczkowych składników próbki. Najczęściej białka są wytrącane przy użyciu roztworów kwasów, rozpuszczalników organicznych i soli. Mechanizm wytrącania białka jest różny w zależności od zastosowanych odczynników. W roztworach silnie kwaśnych, poniżej punktu izoelektrycznego, białka posiadają netto ładunek dodatni i tworzą nierozpuszczalne sole z kwasami takimi jak trichlorooctowy czy chlorowy (VII). Wytrącanie białka poprzez dodanie soli (wysalanie) polega na powstrzymywaniu hydratacji białka na korzyść hydratacji jonów zawartych w soli. Powoduje to usunięcie wody z powierzchni hydrofobowych białek, następstwem czego jest wzrost oddziaływań pomiędzy grupami hydrofobowymi białek, co prowadzi do ich agregacji i wytrącania. Dodanie rozpuszczalnika organicznego mieszalnego z wodą (aceton, acetonitryl, czy metanol) obniża stałą dielektryczną roztworu białka, co zwiększa przyciąganie pomiędzy naładowanymi cząsteczkami i ułatwia elektrostatyczne oddziaływania białka. Ponadto rozpuszczalnik organiczny wypiera przyłączone cząsteczki wody z fragmentów hydrofobowych białka, ułatwiając jego agregację i wytrącanie. 1

2 Podczas wytrącania białek należy rozważyć możliwość współwytrącania analitu i wpływu środowiska na jego trwałość. W przypadku stosowania rozpuszczalnika organicznego, ważne jest aby rozpuszczalnik ten bardzo dobrze rozpuszczał analit, gdyż niektóre związki mogą się adsorbować na wytrącanych białkach. Wytrącając białko często stosuje się duże objętości rozpuszczalników w stosunku do wielkości próbki. W związku z tym należy zwrócić szczególną uwagę na czystość stosowanych odczynniki, tak aby analizowany materiał nie uległ dodatkowemu zanieczyszczeniu. Zjawiska wytrącania białek nie należy mylić z denaturacją białek. Denaturacja następuje wówczas, gdy pod wpływem czynników chemicznych czy fizycznych ulega zniekształceniu struktura IV, III lub II rzędowa białka. Podczas denaturacji dochodzi do zmiany w konformacji łańcucha polipeptydowego, wskutek czego białko traci rodzime właściwości. Białko zdenaturowane może pozostać w roztworze, bądź może być z niego wytrącone w postaci kłaczków. Do czynników fizycznych wywołujących denaturację zaliczyć należy: wysoką temperaturę, ultradźwięki, promieniowanie krótkofalowe oraz wytrząsanie roztworów wodnych białka w atmosferze powietrza. Chemiczne czynniki denaturujące to np.: kwasy, zasady, jony metali ciężkich, mocznik, detergenty, alkohol, aceton, chloroform. Celem ćwiczenia jest zbadanie efektywności wytrącania białka z jego wodnych roztworów przy zastosowaniu różnych kwasów oraz rozpuszczalników organicznych. Oznaczenie zawartości białka pozostałego w roztworze po deproteinizacji zostanie wykonane metodą pomiaru absorbancji w nadfiolecie przy analitycznej długości fali wynoszącej 280 nm. Pomiar absorbancji w nadfiolecie jest możliwy dzięki obecności w białkach tyrozyny i tryptofanu, które posiadają maksimum absorpcji przypadające na 280 nm. Metoda obarczona jest błędem, gdyż występuje duża zmienność absorbancji dla różnych rodzajów białek, wynikająca z niejednakowej procentowej zawartości wspomnianych aminokwasów. Inną wadą tej metody jest to, iż związki wielocząsteczkowe takie jak kwasy nukleinowe mogą wpływać na wartość absorbancji mierzonej przy 280 nm. Poza tym niektóre związki małocząsteczkowe (puryny, pirymidyny, fenole) wykazują dużą absorbancję przy 280 nm. Mimo to metoda ta jest szeroko stosowana, gdyż pozwala na szybkie oznaczenie zawartości białka w próbce. 2. Aparatura i odczynniki spektrofotometr UV-Vis, kuweta kwarcowa o długości 10 mm, pipety automatyczne, 2

3 probówki polipropylenowe, probówki szklane, roztwór standardowy albuminy o stężeniu 5 mg/ml, 0,9% NaCl, 10% kwas trichlorooctowy (TCA), metanol. Wymagane środki ostrożności W trakcie wykonywania ćwiczenia student powinien nosić odzież ochronną. Roztworów nie należy wdychać i pipetować ustami. Identyfikacja zagrożeń (Klasyfikacja zgodnie z dyrektywami UE 67/548/EWG lub 1999/45/WE): Metanol - F Produkt wysoce łatwopalny R11, T Produkt toksyczny R23/24/25, R39/23/24/25 Kwas trichlorooctowy - C Produkt żrący R35, N Produkt niebezpieczny dla środowiska R50/53 Pierwsza pomoc: - w razie kontaktu ze skórą: spłukać dużą ilością wody. - w razie kontaktu z oczami: przepłukać dużą ilością wody, przy szeroko otwartej powiece. - w przypadku wystąpienia podrażnień skontaktować się z lekarzem. - w razie spożycia: przepłukać usta wodą. Dokładne instrukcje postępowania są zawarte w dołączonych kartach charakterystyk substancji. 3. Przygotowanie próbek i wykonanie oznaczenia 3.1. Przygotowanie krzywej wzorcowej do oznaczenia zawartości albuminy Do probówek polipropylenowych wprowadzić odpowiednie ilości roztworu standardowego albuminy o stężeniu 5 mg/ml i 0,9% NaCl, tak aby uzyskać po 2 ml roztworów o końcowym stężeniu wynoszącym 0,0; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 oraz 1,0 mg/ml. Przygotowane 2 serie roztworów albuminy delikatnie wymieszać (nie powodując pienienia), przelać do kuwety pomiarowej (rozpoczynając od najmniejszego stężenia) i zmierzyć absorbancję roztworu przy 280 nm Wytrącenie białek i oznaczenie stężenia białka po deproteinizacji 3

4 a) Wytrącanie białka za pomocą kwasów W celu sprawdzenia sprawności deproteinizacji przygotować po dwie serie roztworów zgodnie z następującą procedurą. Do probówek polipropylenowych wprowadzić po 500 µl roztworu standardowego albuminy a następnie dodać odpowiednie ilości TCA (tabela 1). Probówki z próbkami wymieszać, pozostawić na 5 min i odwirować przez 10 min przy g, pamiętając o wyważeniu probówek. Do szklanych probówek wprowadzić po 500 µl supernatantu i uzupełnić do objętości 5 ml roztworem 0,9% NaCl. Roztwory wymieszać, przelać do kuwety kwarcowej i zmierzyć ich absorbancję przy 280 nm. Tabela 1. Objętości albuminy i kwasów użytych do wytrącenia białka. Nr probówki objętość albumina [µl] objętość kwasu [µl] b) Wytrącanie białka za pomocą rozpuszczalnika organicznego Przygotować po dwie serie roztworów zgodnie z następującą procedurą. Do probówek polipropylenowych wprowadzić odpowiednie ilości roztworu standardowego albuminy, a następnie dodać metanol w takiej ilości aby stosunek objętościowy albuminy do rozpuszczalnika wynosił: 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 oraz 1:4 (tabela 2). Probówki z próbkami wymieszać, pozostawić na 5 min i odwirować przez 10 min przy g, pamiętając o wyważeniu probówek. Do szklanych probówek wprowadzić po 500 µl supernatantu i uzupełnić do objętości 5 ml roztworem 0,9% NaCl. Roztwory wymieszać, przelać do kuwety kwarcowej i zmierzyć ich absorbancję przy 280 nm. Tabela 2. Objętości albuminy i odczynników użytych do wytrącenia białka. Nr probówki objętość albumina [µl] objętość rozpuszczalnika [ml] 0,25 0,5 1 1, Opracowanie wyników 4.1. Wstęp teoretyczny. 4

5 4.2. Wykreślić krzywą kalibracyjną dla albuminy jako zależność zmierzonej absorpcji od stężenia albuminy w próbce i obliczyć równanie prostej metodą najmniejszych kwadratów Na postawie uzyskanego równania obliczyć stężenie [mg/ml] pozostałej po deproteinizacji albuminy w każdej próbce. Otrzymaną wartość przeliczyć na zawartość [mg] albuminy w próbce Dla każdej próbki obliczyć wydajność procesu deproteinizacji korzystając z następującego wzoru: 4.5. Wyniki dla poszczególnych stężeń odczynnika deproteinizującego uśrednić i wyliczyć względne odchylenie standardowe (RSD) Uzyskane wyniki zebrać w tabeli. Przykład tabeli dla wyników deproteinizacji za pomocą TCA Nr probówki Początkowa ilość 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 albuminy [mg] Absorbancja seria 1 Absorbancja seria 2 Stężenie albuminy 1 [mg/ml] Stężenie albuminy 2 [mg/ml] Zawartość albuminy 1 [mg] Zawartość albuminy 2 [mg] Wydajność 1 [%] Wydajność 2 [%] Średnia wydajność [%] RSD [%] 4.7. Przeprowadzić dyskusję wyników. Literatura Ćwiczenia z biochemii, praca zbiorowa pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa, 1999, str ,

6 C. Polson, P. Sarkar, B. Incledon, V. Raguvaran, R. Grant, Optimization of protein precipitation based upon effectiveness of protein removal and ionization effect in liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B, 785 (2003)