Zastosowanie chromatografii do preparacji białek

Transkrypt

1 Zastosowanie chromatografii do preparacji białek Dr inż. Beata Greb-Markiewicz Zakład Biochemii Wydziału Chemicznego Politechniki Wrocławskiej

2 Plan wykładu Specyfika pracy z białkami; Wprowadzenie do tematyki oczyszczania białek (etapy poprzedzające, planowanie eksperymentu); Techniki pomocnicze wykorzystywane do pracy z białkami; Rodzaje chromatografii wykorzystywane do preparacji białek Przykłady praktyczne

3 Specyfika pracy z białkami Wpływ temperatury na stabilność - zalecana praca na lodzie lub w zimnym pokoju ; Wpływ ph na rozpuszczalność-zalecane sprawdzenie pi białka; Wpływ składu buforu-analiza poszczególnych składników buforu pod kątem potencjalnego oddziaływania z białkiem lub wpływu na zachowanie białka (np. obecność detergentów, reduktorów, soli, glicerolu) różna stabilność preparatów czystego białka, ze względu np. na brak czynników stabilizujących białko w komórce (białka ochronne), brak partnera tworzącego kompleks z białkiem, brak liganda wiązanego przez białko a wpływającego na strukturę przestrzenną białka Do detekcji wykorzystuje się absorbancję aromatycznych aminokwasów (280 nm) lub absorbancję wiązania peptydowego (220 nm)

4 Planowanie otrzymania wektora cdna do nadekspresji znakowanego białka Sekwencja cdna docelowego białka (odpowiednie bazy danych, np. Uniprot) zaplanowanie sposobu klonowania np. ze względu na możliwość użycia enzymów restrykcyjnych Wybór wektora zależny od: docelowego organizmu, wybranego znacznika ułatwiającego oczyszczanie (chromatografia powinowactwa HisTag, GST Tag inne), zastosowania fuzyjnego białka zwiększającego rozpuszczalność docelowego białka

5 Przykładowy wektor do nadekspresji białek w komórkach E. coli wprowadzający znacznik histydylowy (powtórzenie sześciu histydyn) do białka

6 Istotne aspekty prowadzenia hodowli w celu nadekspresji białka Wybór organizmu (eukariota czy prokariota ze względu na modyfikacje potranslacyjne) lub konkretnego szczepu bakterii (np. ze względu na występowanie mostków disiarczkowych lub kodonów rzadko używanych przez bakterie) Wybór pożywki LB, TB, auto indukcyjna Wybór momentu indukcji (indukcja produkcji docelowego białka) Wybór temperatury hodowli - zwykle 37 C lub 29 C lub 15 C Wybór czasu od indukcji do zakończenia hodowli od 2h do 24h w zależności od stosowanej temperatury hodowli i wyników eksperymentów wstępnych

7 Izolacja z komórek (tkanek) Mrożenie -80 C Homogenizacja mechaniczna, liza enzymatyczna, naprzemienne zamrażanie i rozmrażanie, sonikacja Zabezpieczenie przed proteazami (ochrona przed degradacją białka), fosfatazami (jeśli istotny stopień fosforylacji białka) - dodanie inhibitorów tych enzymów Pozbycie się DNA, RNA zanieczyszczających próbkę (dodanie DNAzy, RNAzy) Wirowanie oddzielenie osadu od frakcji rozpuszczalnej

8 Wizualizacja ekspresji lub stopnia oczyszczenia białka Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) a następnie wybarwienie żelu roztworem Coomassie blue Berg, Tymoczko Stryer Biochemistry

9 Technika western blot _4_9_429_100998_u14.jpg

10 Przykład wstępnej analizy rozpuszczalności białka A. B. Rysunek 1. Elektroforeza SDS-PAGE (A.) i Western Blot (B.). M Unstained Protein Molecular Weight Marker, T0 próbka total przed indukcją, T20 próbka total po 20-godzinnej indukcji, P0 próbka zawierająca frakcje nierozpuszczalne przed indukcją, P20 próbka zawierająca frakcje nierozpuszczalne po 20-godzinnej indukcji, S0 próbka zawierająca frakcje rozpuszczalne przed indukcją, S20 próbka zawierająca frakcje rozpuszczalne po 20-godzinnej indukcji. Indukcja przy pomocy IPTG spowodowała wyraźną ekspresję TF-GceC o masie około 85 kda. Na podstawie wyników Western Blot, widać, że TF-GceC jest białkiem o wysokiej stabilności. Szymon Kordon praca magisterska

11 Wstępne oczyszczanie próbki przez wysalanie siarczanem amonu GE Healthcare Handbook of affinity chromatography

12 Wymiana buforu, odsalanie Kolumny do filtracji żelowej wirowanie lub grawitacja Filtry membranowe wirowanie Dializa proces długotrwały waroot/xl/m9545_090119_997-16[85783-all].jpg P3THTS07ulQ/s1600/CAM00202.jpg

13 Przykład doboru warunków trawienia w celu pozbycia się białka fuzyjnego od białka docelowego Rysunek 1. Schemat otrzymanego białka fuzyjnego. His-Tag znacznik histydynowy l umożliwiający detekcję białka; Trigger Factor białko opiekuńcze; HRV 3C, Trombina, Czynnik Xa miejsca rozpoznawane przez proteazy; GceC białko docelowe.

14 Aparatura używana do oczyszczania białek (systemy FPLC)- zależnie od aparatu granica górna ciśnienia 0.5 MPa lub 10MPa Akta Explorer Bio-Rad system

15 Metody chromatograficzne używane w Rodzaj techniki separacji peptydów/białek Filtracja żelowa (SEC, ang. sixe exclusion chromatography) Chromatografia powinowactwa (ang. affinity chromatography) Podstawa rozdziału wielkość cząsteczek Specyficzność do określonego liganda Chromatografia jonowymienna Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC, ang. hydrophobic interaction chromatography) Chromatografia odwróconej fazy (RPC, ang. reversed phase chromatography) Ładunek Oddziaływania hydrofobowe w warunkach wysokiego stężenia soli Oddziaływania hydrofobowe

16 Filtracja żelowa (SEC size exclusion chromatography) Figure 3. Typical separation in gel filtration GE Healthcare Manual Rozdział odbywa się ze względu na różnice wielkości cząsteczek białek. Szybciej wypływają z kolumny białka większe. Istotny jest dobór odpowiedniej kolumny do zakresu wielkości rozdzielanych białek.

17 Zakresy wielkości rozdzielanych białek dla stosowanych do filtracji żelowej kolumn

18 Chromatografia powinowactwa Ge Healthcare Manual Ogólną zasadą w chromatografii powinowactwa jest zrównoważenie złoża i związanie do niego oczyszczanego białka poprzez np. inkubację ze złożem. Następnym etap jest przemycie buforem wymywającym białka nie związane specyficznie z kolumną. Końcowym etapem jest wymycie białka buforem zawierającym substancję oddziałującą z białkiem i konkurującą o to oddziaływanie ze złożem. Zwiększenie stężenia substancji w buforze doprowadza do wymycia białka.

19 Chromatografia powinowactwa 1) W przypadku białek znakowanych zwykle używa się wypełnionych gotowych kolumn: -HISTrap dla białek ze znacznikiem HIS (6-8 powtórzonych histydyn), do elucji wykorzystywany jest analog histydyny - imidazol; -GSTTrap dla białek ze znacznikiem GST (glutationo S-transferaza) złoże z immobilizowanym glutationem, elucja zredukowanym glutationem -MBPTrap dla białek ze znacznikiem MBP (białko wiążące maltozę) -StrepTrap dla białek ze znacznikem Strep -Protein A Trap dla białek znakowanych białkiem A -Protein G Trap dla białek znakowanych białkiem G Czasami upakowuje się złoże w pustych szklanych kolumienkach tzw. Tricorn 2) Wykorzystanie złoża ze związanymi przeciwciałami do białka 3) Wykorzystanie złoża ze związanym ligandem białka - wykorzystanie złoża ze związkiem imitującym oddziaływanie występujące w rzeczywistości np. kolumna z heparyną dla białek oddziałujących z DNA, lub związana grupa fosforanowa np. w przypadku aldolazy

20 IMAC (immobilized metal ion affinity chromatography) Clontech Technika zwana chromatografią powinowactwa na immobilizowanym metalu ze względu na użycie immobilizowanych jonów kobaltu (złoże Talon) lub niklu (złoże Ni Sepharosel). Początkowo następuje wiązanie białka posiadającego znacznik HIS do złoża, odmycie białek nie związanych specyficznie, a następnie wymycie białka ze znacznikiem wzrastającym stężeniem imidazolu, będącego analogiem histydyny.

21 Porównanie najczęściej wykorzystywanych znaczników białek

22 Chromatografia jonowymienna białek Istotne pi białka w buforze o ph powyżej pi białko posiada wypadkowy ładunek ujemny, w buforze o ph mniejszym od pi białko posiada wypadkowy ładunek dodatni Przykład używanych kolumn: MonoQ (anionit,+) oraz MonoS (kationit, -) Używany gradient stężenia soli od 0 do 1-2M, w celu zmniejszenia oddziaływań i wymycia białka

23 Chromatografia jonowymienna białek (IEX, ion exchange chromatography)

24 Chromatografia odwróconej fazy (RPC, reverse phase chromatography) Stosuje się wzrastający gradient eluentu B. Eluent A i B powinien zawierać 0,1% silnego kwasu jako czynnika parującego jony (ion-pairing agent) aby utrzymać niskie ph i jednorodny tryb elucji. Eluent B dodatkowo znacznie wyższą zawartość organicznego modyfikatora A: 0.1% TFA w wodzie, 5% acenitryl B:0.1% TFA w acetonitrylu (max 80%) Grupy występujące na powierzchni złoża RP-18

25 Chromatografia odwróconej fazy

26 HIC Chromatografia oddziaływań hydrofobowych Rozdział odbywa się w łagodnych (nie denaturujących warunkach). Jako eluentu używa się gradientu wodnych roztworów soli. Wymywanie w miarę Zmniejszającego się gradientu soli powodującego zmniejszenie oddziaływań hydrofobowych.

27 Bufory stosowane jako eluenty do chromatografii białek -zalecane składy buforów dla konkretnych technik chromatograficznych są w dostępne w instrukcjach kolumn lub wypełnień kolumn przygotowywanych przez producentów. W trakcie eksperymentu dobiera się bufor dla danego białka ze względu na jego indywidualne właściwości. -ph buforu powinno się różnić od pi białka co najmniej o 1, ze względu na wpływ na rozpuszczalność białka, np. dla białka o pi=6 można zastosować bufor o ph powyżej 7 lub poniżej 5. Zakres ph ograniczony jest warunkami granicznymi używanej kolumny zawartymi w instrukcji producenta. -zwykle bufory nie zawierają związków powodujących denaturację białek, poza szczególnymi przypadkami (np. niewidoczny znacznik HIS w przypadku formy natywnej białka) -najczęściej są to bufory fosforanowe lub zawierające TRIS (20-50mM) -zawierają zmienne stężenie soli (najczęściej NaCl ) w zależności od rodzaju techniki chromatograficznej np. zwykle 150 mm dla filtracji żelowej a 300mM dla chromatografii powinowactwa na złożu Talon - czasami dodanie substancji zwiększających stabilność białka np. podczas zamrażania (glicerol)

28 Przykłady zastosowania praktycznego

29 Zastosowanie wysalania siarczanem amonu i filtracji żelowej wpływ buforu na rozdział A 280 [mau] A A280 E B C D F 0 V [ml] 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 B. A 280 [mau] A A 600 F B C D E 0 V [ml] 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 Oczyszczanie białka fuzyjnego za pomocą wysalania siarczanem amonu i sączenia molekularnego. M marker wagowy, Z zagęszczony ekstrakt nastrzykiwany na kolumnę, A-E oznaczenia szczytów chromatogramu, 1-8 numery poszczególnych frakcji. A. Wysolone do 60% (NH 4 ) 2 SO 3 ekstrakty białkowe nanoszono na kolumnę do sączenia molekularnego. Na chromatogramie zaobserwowano 6 szczytów, odpowiadającym wypływającym frakcjom białek. Z każdej frakcji pobierano próbki na SDS-PAGE. Analiza żelu po elektroforezie pozwoliła na zidentyfikowanie TF-GceC we frakcji A. B. Zastosowanie buforu do HPLC z dodatkiem glicerolu (10%) i DTT (2,5 mm) umożliwiło uzyskanie frakcji zawierającej białko fuzyjne z mniejszą ilością zanieczyszczeń bakteryjnych.

30 Przykład oczyszczania na złożu Talon białka ze znacznikiem histydylowym Oczyszczanie białka znakowanego znacznikiem HIS za pomocą chromatografii powinowactwa na złożu Talon (IMAC) M marker wagowy, E zagęszczony ekstrakt nastrzykiwany na kolumnę,ft-przesącz, 0 przemycie, 10/1-4 elucja 10mM imidazolem, 200/1-4 elucja 200mM imidazolem

31 Przykład oczyszczania nie znakowanego białka

32 Podsumowanie Dobór metody oczyszczania zależny od charakteru, masy i innych specyficznych właściwości białka; Dobór buforu, warunków prowadzenia rozdziału i warunków przygotowania próbki kluczowy dla uzyskania funkcjonalnego białka, wybrany bufor zależny od właściwości białka i używanej podczas danego etapu oczyszczania kolumny; Zwykle oczyszczanie białka jest procesem wieloetapowym, wymagającym dokładnego planowania i precyzji wykonania na każdym etapie.

33 Literatura Affinity Chromatography. Principles and Methods, GE Healthcare Manual Size Exclusion Chromatography. Principles and Methods, GE Healthcare Manual Hydrophobic Interaction and Reversed Phase Chromatography. Principles and Methods, GE Healthcare Manual Podręcznik Berg J.M, Tymoczko J.L, Stryer L Biochemistry 7th edition Wiele praktycznych i teoretycznych informacji odnośnie pracy z białkami i oczyszczania białek dostępnych na stronie:

34