Dodtek A Metody inżynierii genetycznej wykorzystywne w oliczenich molekulrnych A.1 BudowDNA DNA(kws dezoksyryonukleinowy) jest nośnikiem informcji genetycznej w orgnizmch żyjących n Ziemi. Cząsteczk DNA skłd się z dwóch opltjących się, oddlonych od sieie o 2 nm nici złożonych z nukleotydów. Tką strukturę nzyw się podwójną helisą. Nukleotyd skłd się z nukleozydu i reszty kwsu fosforowego. W skłd nukleozydu DNA wchodzi z kolei cząsteczk dezoksyryozy i zsd zotow. Dezoksyryoz jest to cząsteczk cukru prostego z grupy pentoz, czyli cukrów pięciowęglowych. Do środk helisy skierowne są połączone z cząsteczkmi cukru zsdy zotowe. Skok helisy wynosi 3,4 nm. Budowę podwójnej helisy DNA przedstwiono n rys. A.1. W nturze występują 4 różne nukleotydy DNA, które różnią się jedynie zsdmi zotowymi. Istnieją nstępujące zsdy zotowe: Adenin, Gunin, Cytozyn i Tymin, więc istnieją nstępujące nukleotydy DNA: kws dezoksydenylowy, kws dezoksygunylowy, kws dezoksycytydylowy, kws dezoksytymidylowy. W skrócie nukleotydy ozncz się litermi 1
A.1. Budow DNA zsd zotow wi¹znie wodorowe szkielet fosfornowo - cukrowy Rysunek A.1: Budow podwójnej helisy DNA. A,G,C,T. Chemicznie otrzymno jeszcze wiele innych typów nukleotydów chrkteryzujących się ciekwymi włsnościmi. Zgodnie z regułą Chrgff (ustloną, gdy nie znno jeszcze struktury DNA) ilość moli zsd purynowych (Adenin, Gunin) jest równ ilości moli zsd pirymidynowych(cytozyn, Tymin). Reguł t znlzł potwierdzenie w istnieniu komplementrnościzsd,coznczy,żedeninzjednejniciłączysięzwszeztyminą z drugiej nici, gunin z cytozyną. To selektywne oddziływnie jest często wykorzystywnym mechnizmem w oliczenich molekulrnych. Wiązni łączące zsdy nleżą do grupy wodorowych, czyli słych, łtwych do rozerwni oddziływń między przeciwnie nłdownymi tommi. Między deniną tyminą występują dw tkie wiązni, między guniną cytozyną-trzy. Nukleotyd jest cząsteczką niesymetryczną- wykzuje polrność, poniewż cząsteczk cukru nie jest symetryczn. N jednym końcu nukleotydu, ozncznym, występuje grup fosfornow(któr jest przyłączon do piątego tomu węgl dezoksyryozy), n drugim, ozncznym 3, znjduje się grup hydroksylow związn z trzecim tomem węgl dezoksyryozy. Kolejne nukleotydy tworzą łńcuch polinukleotydowy łącząc się szeregowo, koniec z 3 końcem. Nukleotydy połączone są ze soą wiąznimi fosfodie- 2
A.1. Budow DNA strowymi, które są silne i tworzą tk zwny szkielet fosfornowo- cukrowy. W podwójnej helisie DNA nici ułożone są nprzeminlegle, to znczy nprzeciwko końc jednej nici jest 3 koniec drugiej nici. Ozncz to, że łńcuchy mjąprzeciwnąpolrność-jedenznichiegniewjednąstronę,drugi w przeciwną. Heliks DNA możn porównć do skręconej spirlnie driny, której szczele tworzą oddziłujące ze soą zsdy, ntomist pionowe listwy stnowią połączone wiąznimi fosfodiestrowymi cząsteczki dezoksyryozy. Konieczność spirlnego skręceni cłej struktury wynik z rozmirów poszczególnych elementów nukleotydów. N jeden pełny orót heliksu przypd 11 pr zsd. Heliksy DNA są prwoskrętne, łńcuchy polinukleotydowe wydłużjąc się, okręcją się wokół sieie w kierunku zgodnym z ruchem wskzówek zegr. Cząsteczki DNA występujące w komórkch orgnizmów owijją się wokół iłek tworząc złożone struktury i ulegjąc wielokrotnej spirlizcji(w jądrze komórki człowiek znjdują się cząsteczki DNA o łącznej długości około 2 metrów). Przy opisie rekcji z dziedziny oliczeń molekulrnych stosuje się uproszczony sposó zpisu cząsteczek DNA. Podje się jedynie sekwencje nukleotydów orz kierunki nici DNA. Tk więc pewien frgment podwójnej helisy możn zpisć: 5 AAGCTGATGC 3 3 TTCGACTACG 5 Stosując tki zpis trci się informcję o ksztłcie cząstki, który może mieć duży wpływ n wydjność rekcji. Gdy opisuje się sekwencję pojedynczej nici zzwyczj koniec znjduje się po lewej stronie. Jeżeli orzuje się dwuniciową cząsteczkę DNA, to nić górn m koniec po lewej stronie. W zpisie czsmi pojwi się liter N oznczjąc dowolny nukleotyd(z A, T,G,C). 3
A.2. Hyrydyzcj i denturcj A.2 Hyrydyzcj i denturcj Poniewż wiązni wodorowe utrzymujące dwie nici podwójnej helisy ze soą są reltywnie słe, nici te możn rozpleść i rozdzielić przy niewielkim nkłdzie energii. Żey rozpleść helisę, wystrczy doprowdzić do tempertury liskiej temperturze wrzeni wodny roztwór DNA wysok tempertur powoduje rozerwnie wiązń wodorowych nie uszkdzjąc silniejszych wiązń, utrzymujących rzem nukleotydy w poszczególnych nicich. Zjwisko to nosi nzwę denturcji DNA. Denturcj zchodzi również pod wpływem wysokiego ph(powyżej 13). Tempertur równowgi termodynmicznej dl dnej cząsteczki zleży od tworzących ją nukleotydów i możn oliczyć ją dlkrótkich(do20przsd)łńcuchówdnazzleżnościa.1,gdziejest licząprat,zśjestlicząprgc. t[ C]=2 +4 (A.1) Komplementrne, pojedyncze nici odtwrzją strukturę dwuniciową w procesie zwnym renturcją. Renturcję zchodzącą pomiędzy łńcuchmi kwsów nukleinowych o różnym pochodzeniu(np. DNA i RNA, lu DNA z dwóch różnych orgnizmów) nzyw się hyrydyzcją. Hyrydyzcj jest oddziływniem selektywnym- hyrydyzują do sieie tylko cząsteczki o komplementrnych sekwencjch. Hyrydyzcj jest podstwowym zjwiskiem wykorzystywnym do przeprowdzni oliczeń molekulrnych, m tkże duże znczenie w inżynierii genetycznej(służy do wyszukiwni komplementrnych odcinków DNA w nku genów, stosuje się ją do dń ewolucyjnych orz dni stopni pokrewieństw między poszczególnymi osonikmi). A.3 Polimeryzcj DNA, PCR Enzymy są to iłk, wyodręnione z żywych orgnizmów, njczęściej z kterii. Niektóre enzymy pozwlją przeprowdzć pewne opercje n cząstecz- 4
A.3. Polimeryzcj DNA, PCR kch DNA i z tego powodu są powszechnie wykorzystywne przez inżynierię genetyczną. Cząsteczk DNA jest dwuniciow i nici są do sieie wzjemnie komplementrne, więc występuje redundncj informcji. Replikcj DNA jest procesem, w którym główną rolę odgrywją enzymy zwne polimerzmi DNA. Podczs replikcji nici helisy są rozpltne w określonym rejonie i kżd z nich służy jko mtryc dl nowej, komplementrnej nici. Tk więc w kżdej z nowo powstjących dwuniciowych cząsteczek DNA jedn z nici jest odziedziczon po cząsteczce mcierzystej, drug- nowo syntezown. Enzym polimerzy DNA syntezuje cząsteczkę komplementrną do mtrycowej nici DNA. Polimerz ktlizuje rekcję wydłużni syntetyzownego łńcuch DNA przez kolejne dołącznie nukleotydów do wolnej grupy 3 OH. Kieruneksyntezyjestzwszetkism-oddo3 końc.dosyntezynicidna polimerzy wymgją komplementrnego, krótkiego jednoniciowego odcink DNA zwnego strterem(poniewż potrfią jedynie wydłużć nić w oprciu onićmtrycową). Często potrzene jest zwiększenie ilości cząsteczek DNA o dnej sekwencji. Możn to osiągnąć umieszczjąc tę sekwencję w łńcuchu DNA orgnizmu żywego. Mechnizmy powielni komórek sprwią, że interesując ns sekwencj ędzie powieln. Tki proces nzyw się klonowniem. Jest on njrdziej wydjny, gdy klonujemy w komórkch kteryjnych, poniewż ich podził nstępuje co około 20 minut. Proces tki jest stosowny w iologii molekulrnej, jednk jest on rdzo czsochłonny, dltego w dziedzinie oliczeń molekulrnych nie jest spotykny. Polimerzow rekcj łńcuchow(pcr) jest techniką powielni in vitro frgmentów DNA. Poleg on n powielniu frgmentu DNA n mtrycy kwsu nukleinowego z użyciem strterów i termostilnej polimerzy. PCR pozwl n nmnożenie określonych odcinków DNA prktycznie w dowolnych ilościch. W metodzie PCR chcąc nmnożyć określony odcinek DNA, dodje się strtery- krótkie( z reguły do 20 nukleotydów) jednoniciowe cząsteczki DNA, komplementrne do dwóch nici żądnego odcink DNA n jego 5
A.4. Cięcie enzymmi restrykcyjnymi końcch(rys. A.2). Ay strtery mogły się przyłączyć, mtrycow cząsteczk DNA musi njpierw ulec denturcji(jk pokzno n rys. A.2), coosiągsiępodnosząctemperturędookoło94 C.Nstępnietempertur zostjeoniżondookoło40 50 C(zleżnieodsekwencjistrterów).Wtej temperturze strtery hyrydyzują w odpowiednich miejscch, co zilustrownonrys.a.2c.strterysądodnewstężeniutkwysokim,żeprwdopodoieństwo hyrydyzcji strter jest o wiele wyższe niż renturcj dwóch nicimtrycy.wkońcupodnosisiętemperturędo72 Ciwtejtemperturze przeprowdz się polimeryzcję(polimerz doudowuje nowe nici zczynjąc od strterów). Tym smym uzyskuje się z jednej cząsteczki DNA dwie tkiesme,copokznonrys.a.2d.potymkrokucyklmożnpowtórzyć. W kżdym cyklu ilość cząsteczek DNA uleg podwojeniu, więc po niewielu cyklch uzyskuje się żądną liczę cząstek. Metod jest możliw do zstosowni dzięki temu, że enzym termostilnej polimerzy nie jest niszczony wtemperturze95 C.Używsiępolimerzyizolownejzkteriiżyjących w gorących źródłch, zwnej Tq polimerzą. Metod PCR m wiele zstosowń i jest podstwową techniką wykorzystywną do udowy urządzeń oliczeniowych przedstwionych w niniejszej rozprwie. A.4 Cięcie enzymmi restrykcyjnymi Enzymy restrykcyjne(zwne tkże restryktzmi) są iłkmi zdolnymi do rozpoznwni specyficznych sekwencji w DNA i do przecinni dwuniciowej cząsteczki DNA. Cięcie poleg n zerwniu silnego wiązni fosfodiestrowego, utrzymującego rzem nukleotydy w poszczególnych nicich. Njwiększe znczenie prktyczne mją enzymy klsy II, które rozpoznją sekwencje skłdjące się z 4 12 nukleotydów, zś miejsce przecięci znjduje się w oręie rozpoznwnej sekwencji lu w ściśle określonej odległości od niej. Znnych jest oecnie kilk tysięcy restryktz, z których kilkset jest sprzedwnych przez firmy zjmujące się hndlem odczynnikmi chemicznymi. T. A.1 zwier sekwencje rozpoznwne i miejsc cięci niektórych 6
A.4. Cięcie enzymmi restrykcyjnymi ) 3' ) c) d) 3' 3' 3' 3' Rysunek A.2: Polimerzow rekcj łńcuchow, nmnżnie łńcuch o końcch ozncznych, ; ) cząsteczk wejściow orz strtery; ) denturcj nici mtrycowej; c) przyłączenie strterów orz polimeryzcj; d) wynikowe cząsteczki. enzymów restrykcyjnych. W wyniku trwieni enzymem restrykcyjnym mogą powstć cząsteczki z jednoniciowymi końcmi. Mówimy wtedy, że enzym zostwi lepkie końce. Dziejesiętkdltego,żeenzymtnieoieniciDNAwróżnychmiejscch. Przykłdem tkiego enzymu jest EcoRI. Jeżeli miejsce przecięci ou nici jest tkie smo, to cząsteczki po przecięciu mją tępe końce. Tk tnie HeIII. Lepkie końce mją duże znczenie, poniewż sekwencje lepkich końców powstłych w wyniku dziłni tego smego enzymu są komplementrne i mogą one łtwo hyrydyzowć ze soą. Możn też czsmi dorć dw enzymy roz- 7
A.5. Ligcj DNA Nzw Rozpoznwn sekwencj Cząsteczki po przecięciu HinfI GANTC G ANTC CTNAG CTNA G EcoRI GAATTC G AATTC CTTAAG CTTAA G FokI GGATGNNNNNNNNNNNNN GGATGNNNNNNNNN NNNN CCTACNNNNNNNNNNNNN CCTACNNNNNNNNNNNN N HeIII GGCC GG CC CCGG CC GG HpII CCGG C CGG GGCC GCC C PstI CTGCAG CTGCA G GACGTC G ACGTC Tlic A.1: Niektóre enzymy restrykcyjne, sekwencje rozpoznwne i miejsc cięci. poznjące różne sekwencje i zostwijące tkie sme lepkie końce. Trwienie enzymem restrykcyjnym(orz inne rekcje wykorzystujące enzymy) możn ztrzymć przez grznie przez 10-15min w temperturze 65-70 Cluekstrkcjęfenolem(dodniensyconegofenolusprwi,żeDNA przechodzi do fzy wodnej, którą się zier). Istnieją termostilne enzymy restrykcyjne, które nie ulegją termicznej inktywcji. A.5 LigcjDNA Powstnie długiego łńcuch DNA wymg łączeni wielu krótkich frgmentówwjednąnić.odpowiedzilnyztojestenzymzwnyligządna,który ktlizuje powstwnie wiązń między frgmentmi DNA. Ligcj poleg n tworzeniu kowlencyjnych wiązń fosfodiestrowych pomiędzy grupą fosfornową n końcu jednego łńcuch grupą hydroksylową z 3 końc 8
A.6. Odczytywnie długości łńcuchów DNA drugiego łńcuch. Jest to rekcj odwrotn do rekcji cięci enzymem restrykcyjnym. Ligzy wymgją oecności ATP, który jest źródłem energii. Rekcjęligcjiprzeprowdzsięwniskiejtemperturze14 16 C,poniewż tk tempertur sprzyj powstwniu wiązń wodorowych między lepkimi końcmi frgmentów DNA. W przypdku ligowni cząsteczek z tępymi końcmi konieczne jest dodnie glikolu polietylenowego do uforu ligcyjnego, y zwiększyć prwdopodoieństwo połączeni tępych końców ze soą. A.6 Odczytywnie długości łńcuchów DNA Elektroforez w żelch jest techniką stosowną stndrdowo przy rozdzile, nlizie i oczyszczniu kwsów nukleinowych. Pozwl on dć długość DNA z dokłdnością do 1 nukleotydu, eliminując w wielu przypdkch użycie drogich mikroskopów elektronowych. Po umieszczeniu w polu elektrycznym cząsteczki DNA migrują w żelu, zgodnie ze swym ujemnym łdunkiem. Szykość migrcji zleży od wielkości cząsteczki. Schemtycznie proces ten pokzno n rys. A.3. d³u sze frgmenty krótsze frgmenty ktod(-) nod(+) el Rysunek A.3: Elektroforez- rozdzielnie cząsteczek DNA ze względu n ich długość. Elektroforezę możn prowdzić w wrunkch ntywnych ądź denturujących. Żel posid wrunki denturujące, gdy nstępuje w nim rozdził 9
A.6. Odczytywnie długości łńcuchów DNA dwuniciowej cząsteczki DNA n jednoniciowe. Jeśli tkie zjwisko nie występuje mówimy, że elektroforez jest prowdzon w wrunkch ntywnych. Szykość migrcji w żelu jednoniciowych cząsteczek DNA, zleży nie tylko od ich wielkości i łdunku, le również w dużym stopniu od ksztłtu, jki przyier cząsteczk. Ay dokłdnie określić wielkość tkich cząsteczek eliminuje się różnice w szykości migrcji wywołne ksztłtem stosując żele denturujące. Są to njczęściej żele krylmidowe, w których czynnikiem denturującym jest mocznik. Elektroforez w żelch grozowych, jest metodą do rozdzielni cząsteczek o długościch 200 10000 pr zsd. Elektroforezę przeprowdz się w odpowiednim uforze. Njczęściej stosownym uforem jest TAE(Trisoctn, EDTA) lu TBE(Tris-orn, EDTA). Przed nniesieniem n żel próki zwiesz się w uforze zwierjącym ociążcze (glicerol, Ficoll lu schroz) orz rwnik umożliwijący śledzenie przeiegu elektroforezy. Elektroforez w żelch polikrylmidowych stosown jest do rozdziłu młych cząsteczek DNA. Żel tki powstje poprzez polimeryzcję monomerów krylmidu w długie łńcuchy z wytworzeniem wiązń poprzecznych przez iskrylmid. Wielkość porów w żelu zleży od stężeni krylmidu do iskrylmidu. Żele polikrylmidowe stosuje się przy rozdzile frgmentówowielkościod6przsd(20%polikrylmid)do1000przsd(3% polikrylmid) orz przy rozdzile jednoniciowych cząsteczek DNA. Do elektroforezy stosuje się zzwyczj ufor TEB(tris-orn, EDTA). W żelch krylmidowych stosuje się njczęściej rwniki, y kontrolowć przeieg rekcji. DNA w żelu uwidczni się poprzez znkownie omówione w dlszej części prcy. Liniowe cząsteczki DNA migrują w żelu z prędkością odwrotnie proporcjonlną do logrytmu dziesiętnego ich msy cząsteczkowej(wyrżonej w Dltonch lu w liczie pr zsd). Prędkość migrcji jest również zleżn od stężeni orz rodzju żelu, ntężeni pol elektrycznego, tempertury. Prktycznie stosuje się klircję żelu. Używ się do tego stndrdy wielkości, czyli cząsteczki DNA o znnej wielkości, poddwne elektroforezie w tym smym 10
A.7. Odczytywnie sekwencji DNA żelu co cząsteczki dne. A.7 Odczytywnie sekwencji DNA Sekwencjonownie cząsteczek DNA pozwl poznć kolejność występujących w nich nukleotydów. Oecnie njczęściej stosuje się metodę polegjącą n nlizowniu produktów polimeryzcji n jednoniciowej mtrycy, począwszy od przygotownego strter. Prowdzi się równolegle cztery rekcje. Kżd z nich zwier w mieszninie nukleotydów dideoksytrifosforny nukleotydów, powodujące zkończenie polimeryzcji w pozycji, w której zostną włączone do syntetyzownej nici. Powstje ztem pełen zestw frgmentów DNA o różnej długości, kończących się odpowiednim nukleotydem. Metod t pozwl odczytć sekwencje 400-700 nukleotydów w jednym doświdczeniu. Techniki sekwencjonowni DNA są n tyle zutomtyzowne, że stło się możliwe podjęcie projektów poznni sekwencji cłych genomów. A.8 Modyfikcj końców cząsteczek DNA Cząsteczki DNA izolowne z orgnizmów zwierją n końcu grupę fosfornową, któr jest niezędn do łączeni dwóch łńcuchów DNA z pomocą ligzy. Tkie cząsteczki są pokzne n rys. A.4. Jeżeli cząsteczki tkiej grupy nie mją, to ligcj frgmentów nie jest możliw. Usunięcie grupy fosfornowej nstępuje w wyniku dziłni lkicznej fosftzy. W wyniku tej rekcji n końcu zostje dołączon grup OH, tkjkpokznonrys.a.4. Dziłnie odwrotne posid enzym zwny kinzą polinukleotydową. Kinz tk przenosi grupę fosfornową z nukleotydu ATP n cząsteczkę DNA,zwierjącygrupęOHnkońcu.Jeżelicząsteczkzrys.A.4zostnie poddn rekcji kinzowni, to powstnie cząsteczk z rys. A.4. Po rekcji kinzowni cząsteczki mogą yć łączone z pomocą enzymu ligzy. 11
A.9. Znkownie kwsów nukleinowych ) P 3 OH OH 3 P ) OH 3 OH OH 3 OH Rysunek A.4: Grupy n końcch DNA; ) DNA izolowne z orgnizmów posid n końcu grup fosfornow, to smo po rekcji kinzowni; ) DNA otrzymywne sztucznie posid n końcu grup OH, to smo po dziłniu lkicznej fosftzy. Sztucznie syntezowne oligonukleotydy tkże nie mją grupy fosfornowej n końcu, ztem nie mogą one ligowć, jeżeli nie zstosuje się rekcji kinzowni. A.9 Znkownie kwsów nukleinowych Wiele metod iologii molekulrnej orz wiele metod oliczeń molekulrnych opier się n wykorzystniu znkownych cząsteczek DNA. Stosuje się techniki znkowni rdioktywnego orz znkowni fluorescencyjnego. Metody znkowni fluorescencyjnego dzieli się n dw typy: ezpośrednie i pośrednie. Njrdziej rozpowszechnione są systemy pośrednie, w których dodtkow cząsteczk wudowuje się w helisę DNA. Przykłdmi tkich cząsteczek są romek etydyny i iotyn. Njrdziej powszechną metodą znkowni cząsteczek podczs elektroforezy jest dodnie do żelu grozowego romku etydyny, który wudowuje się między oie nici cząsteczki DNA. Bromek etydyny uwidczni się pod wpływem świtł UV. 12
A.9. Znkownie kwsów nukleinowych Systemy ezpośrednie stosują specjlne nukleotydy, które podczs syntezy zostły tk zmodyfikowne, że wykzują włsności fluorescencyjne. Tkie systemy nie potrzeują dodtkowych związków iorących udził w rekcji. Mimo dużego postępu technik znkowni fluorescencyjnego, w dlszym ciągu wykorzystuje się znkownie rdioktywne. Używ się nukleotydów, w których jeden z tomów zostł zstąpiony izotopem rdioktywnym.njczęściejstosujesięizotopyfosforu 32 Plu 33 P,orzizotopsirki 35 S.Fosfor 32 Pemitujepromieniownieonjwyższejenergiiwśródwykorzystywnych w prktyce iologicznej izotopów(promieniownie β o energii 1,7 MeV). Uzyskuje się ztem njrdziej ktywne sondy, zpewnin jest wysokczułośćikrótkiczsdetekcji.okrespółtrwni 32 Pwynosi14dni. Sirk 35 Semitujepromieniownieoniskiejenergii,niesąwymgneżdne specjlne ekrny ochronne(promieniownie β o energii 0,17 MeV). Okres rozpdupołowicznegowynosi87dni.fosfor 33 Pmwłsnościpośredniepomiędzy omówionymi powyżej izotopmi. Metody znkowni możn tkże podzielić n metody znkujące równomiernie łńcuch n cłej długości, orz metody znkujące końce nici. Do pierwszej klsy zlicz się metodę zwną rndom priming, któr poleg n polimeryzcji nici z użyciem znkownych nukleotydów. Znkownie przy użyciu kinzy polinukleotydowej pozwl otrzymć cząsteczkę wyznkowną n końcu. Znkownie 3 końc frgmentu DNA jest możliwe przy użyciu terminlnej trnsferzy. Jest to enzym dołączjący nukleotydy n 3 końcu, nie wymgjąc do tego mtrycy. Inną metodą znkowni 3 końc jest wypełninie lepkich końców przy użyciu znkownych nukleotydów. 13