2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy

Transkrypt

1 Metody analizy DNA 1. Budowa DNA. 2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy 3. Klonowanie in vivo a. w bakteriach, wektory plazmidowe b. w fagach, kosmidy c. w drożdżach, YAC d. transformacja organizmów wyższych 4. Klonowanie in vitro PCR

2 1. Budowa DNA Francuski uczony R. Chargaff wykrył w latach 1940-tych uderzającą prawidłowość w kompozycji DNA, już wtedy uznawanego za potencjalny nośnik informacji genetycznej Czyszczenie DNA Dodatek kwasów kwasów rozbija rozbija wiązania wiązania fosforanów fosforanów Rozdział zasad i zliczenie ich stosunków ilościowych

3 1. Budowa DNA Opierając się na odkryciach Chargaffa i badaniach dyfrakcji promieni rentgenowskich Watson i Crick zaproponowali strukturę DNA w 1953.

4 1. Budowa DNA

5 1. Budowa DNA Nić DNA to kręgosłup złożony z cukrów przeplatanych fosforanami Z cukrów wystają zasady łączące się w w pary wiązaniami wodorowymi Nici są przeciwbieżne: jedna od 5 do 3 druga od 3 do 5 C i G są mocniej związane niż A i T

6 1. Budowa DNA Znana nam podwójna helisa to tak zwane B-DNA, Możliwe są też formy A i Z. Białka mające się przyczepić do DNA odnajdują formę B, co potwierdza, że ta forma dominuje in vivo.

7 2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA Organizmy muszą ciąć i sklejać DNA. Dokonują tego przy pomocy wyspecjalizowanych enzymów. Polimerazy DNA (zależne od DNA lub RNA) Nukleazy to enzymy tnące DNA w środku (endonukleazy) lub z końców (egzonukleazy) Ligazy łączą końce DNA

8 2a. Polimerazy DNA Polimerazy DNA wymagają obecności jednoniciowego DNA i krótkiego odcinka drugiej nici nazywanego starterem (ang. primer) Konieczność istnienia startera wykorzystywana jest do zaczęcia polimeryzacji DNA od określonego (sekwencją) miejsca

9 2a. Polimerazy DNA Polimerazy DNA zależne od matrycy RNA nazywane są też odwrotnymi transkryptazami Wykorzystuje się je np. do uzyskania DNA z mrna in vitro. Pomocne jest to, że mrna ma doczepione po transkrypcj ogonki poliadenylowe

10 2b. Nukleazy : enzymy restrykcyjne Skąd się wzięły tak niezwykłe enzymy... służą bakteriom do niszczenia DNA wirusów bakteryjnych.

11 2b. Jak sprawdzić czy enzymy restrykcyjne zadziałały? Należy pocięte DNA poddać elektroforezie, czyli rozdzielić w żelu agarozowym poddanym działaniu pola elektrycznego.

12 2b. Jak sprawdzić czy wycięliśmy właściwy odcinek? znacznik wielkości DNA i próbki Technika bibułowa - blotting elektroforeza bibuła Southern hybridization (blotting) blot przeniesienie na filtr sondy odszukują sekwencje komplementarne błona fotograficzna

13 2c. Ligazy DNA W komórce dochodzi do pęknięcia nici i wtedy ligazy odtwarzają wiązanie fosforanu z cukrem W probówce wykorzystuje się je do połączenia dwóch dowolnych nici w jedną

14 2c. Ligazy DNA Łatwiej jest złączyć lepkie końce DNA bo wiązania wodorowe przytrzymują nici DNA, które chcemy zligować Dlatego niekiedy warto najpierw doczepić (ligować) krótkie odcinki łącznikowe zawierające sekwencje palindromowe (linkers), a potem je przyciąć

15 3. Klonowanie DNA in vivo In vivo czyli przy pomocy organizmów wykorzystując ich funkcje replikacji DNA (bakterii, fagów, drożdży, etc.) In vitro czyli używając samych oczyszczonych enzymów i nukleotydów (PCR)

16 3a. Klonowanie DNA w bakteriach badany DNA wektor plazmidowy transformacja namnożenie plazmidów wewnątrz komórek i namnożenie komórek

17 3a. Klonowanie DNA w bakteriach d) Celem może być nie tylko namnożenie samego DNA, ale też uzyskanie produktu namnożonego genu (np. ludzkiej insuliny... której dwa peptydy są syntetyzowane w bakterii, a potem są modyfikowane in vitro)

18 3a. Plazmidy - wektory klonowania dla niewielkich odcinków DNA

19 3a. Niektóre wektory to wahadłowce (shuttle vectors) ponieważ mogą replikować się i być wykrywane w tak różnych organizmach jak np. bakterie i drożdże. Zapewnia to odpowiedni dobór genów markerów oraz osobnych genów umożliwiających replikację w poszczególnych organizmach ampr marker bakteryjny ten odcinek zapewnia replikację w drożdżach ten odcinek zapewnia replikację w bakteriach URA3 - ten gen zapewnia utrzymanie się w drożdżach

20 3b. Klonowanie większych odcinków DNA wektory fagowe Fag jako wektor - w główce faga mieści się 50 kb - ale 15 kb można wyciąć restrykcyjnie i wstawić 15kb obcego DNA

21 3b. Kosmidy (udoskonalone wektory fagowo-plazmidowe) - mają tylko te odcinki DNA faga, które są rozpoznawane przy pakowaniu do główki (miejsca cos, stąd nazwa); delecji ulega aż 45 kb DNA faga, tyle obcego DNA może być pobrane - mają też miejsca replikacji i markery plazmidowe, i dlatego fag-kosmid zarażający komórkę może się w niej mnożyć jako plazmid cos - fragmenty faga odpowiedzialne za pakowanie do kapsydów namnożenie cos w plazmidach cięcie DNA na odcinki 35kb plazmid zlinearyzowany cięcie restrykcyjne i pakowanie do kapsydów biblioteka (fagi lub klony bakteryjne)

22 3c. Klonowanie wielkich odcinków DNA w drożdżach, YAC Istnieją specjalne plazmidy zawierające centromery i telomery chromosomów drożdowych, a także markery troficzne (URA3) i sekwencje inicjacji replikacji (ori). Można do nich wstawić bardzo duże odcinki DNA (insert DNA, np. ludzki), nawet 1000 kb, i otrzymać YAC (yeast artificial chromosome). Zachowują się one w czasie mitozy jak normalne chromosomy drożdży, które są podobnej wielkości

23 3d. Transformacja organizmów wyższych U roślin odkryto, że czynnikiem powodującym rakowate narośla na łodydze był czynnik T, który znaleziono jako zintegrowany z plazmidem bakterii Agrobacterium, albo jako wbudowany w chromosom rośliny. Element T to rodzaj samorozprzestrzeniającego się pasożyta genetycznego. U roślin jako wektory stosuje się także niektóre wirusy zdolne do namnażania się i rozchodzenia po całej roślinie. U zwierząt stosuje się np. mikroiniekcje DNA do jądra komórkowego, unieszkodliwione retrowirusy, lub wstrzeliwanie DNA.

24 4. PCR polymerase chain reaction (namnożenie DNA in vitro) a) Substratami do reakcji sekwencjonowania są: -dwuniciowy DNA, -dwa startery (ok.. 20 aa) - mieszanina 4 nukleotydów - polimeraza DNA nie ulegająca degeneracji w wysokiej temperaturze (np.. Taq) b) Reakcja jest cykliczna: - denaturacja (rozdzielenie nici DNA) 95ºC - przyłączenie starterów 45ºC - synteza nici komplementarnej 72ºC