ENZYMY RESTRYKCYJNE CZYM RÓŻNIĄ SIĘ POSZCZEGÓLNE ENZYMY? ENZYMY RESTRYKCYJNE- TYP I. nazewnictwo: EcoRV

Transkrypt

1 nazewnictwo: EcoRV ENZYMY RESTRYKCYJNE - pierwsza litera- rodzaj bakterii - druga i trzecia- gatunek - następna litera oznacza szczep lub typ - kolejne enzymy izolowane z danego szczepu lub typu otrzymują litery rzymskie Escherichia coli, szczep RY13; piąty enzym wyizolowany z tego szczepu CZYM RÓŻNIĄ SIĘ POSZCZEGÓLNE ENZYMY? Budową, miejscem utworzenia kompleksu z DNA po rozpoznaniu sekwencji oraz mechanizmem enzymatycznym Rozpoznawaną sekwencją (jej długością i składem nukleotydowym) Miejscem hydrolizy w obrębie sekwencji TYP I Enzymy zbudowane z trzech podjednostek strukturalnofunkcjonalnych Podjednostka S rozpoznaje Sekwencję DNA Podjednostka M Modyfikuje DNA Podjednostka R posiada aktywność Restrykcyjną Kompleks podjednostek R 2 M 2 S 1 jest enzymem restrykcyjnym (wymaga ATP i S-adenozylo-L-metioniny) gdy napotka niezmodyfikowany* DNA. *Podjednostki S i M tworzą metylazę, która rozpoznaje i modyfikuje DNA w obrębie określonej sekwencji Cięcie następuje w różnych niezdefiniowanych odległościach od miejsca rozpoznania, zwykle kilkaset do kilku tysięcy par zasad 1

2 TYP II Enzymy, których aktywności metylazy i endonukleazy rozdzielone są między dwa odrębne białka kodowane przez różne geny nie wymagają obecności ATP ale MgCl 2 trawią DNA w obrębie sekwencji rozpoznania lub w niedużej, ściśle określonej odległości od niej, dając na ogół powtarzalne produkty trawienia rozpoznają krótkie najczęściej palindromiczne sekwencje 4-8pz wyróżnia się kilka klas w obrębie typu o homodimery, rozpoznają sekwencje asymetryczne, trawią w odległości 1-20pz od miejsca rozpoznania o homotetramery, rozpoznają sekwencje asymetryczne, trawią w miejscu rozpoznania TYP III Enzymy zbudowane z dwóch podjednostek strukturalnofunkcjonalnych Podjednostka M Modyfikuje DNA Podjednostka R posiada aktywność Restrykcyjną Kompleks podjednostek R 2 M 2 jest enzymem restrykcyjnym wymagającym do aktywności ATP i S-adenozylo-L-metioniny Cięcie następuje w odległości ok 20-30pz od miejsca rozpoznania, Rozpoznawane są sekwencje niesymetryczne o długości 5-6pz TYP IV Enzymy rozpoznające zmetylowany DNA Właściwość Typ I Typ II Typ III Restrykcja i modyfikacja Jedno białko obie aktywności Rozdzielone podjednostki metylazy i endonukleazy Oddzielne enzymy wymieniające się jedną podjednostką Struktura Heterodimer Homodimer Heterodimer Kofaktory ATP; Mg 2+ ; SAM Mg 2+ Mg 2+ ; SAM Rozpoznawane sekwencje Dwie w dowolnej orientacji Jedna (palindromowa) 4-8nt Miejsce cięcia przypadkowe W obrębie lub blisko rozpoznanej sekwencji Miejsce metylacji W obrębie rozpoznanej sekwencji W obrębie rozpoznanej sekwencji Dwie w przeciwnej orientacji 20-30nt od rozpoznanej sekwencji po stronie 3 W obrębie rozpoznanej sekwencji 2

3 ROZPOZNAWANE SEKWENCJE Sekwencje czteronukleotydowe statystycznie, pojedynczy enzym rozpoznający sekwencję np. 5 -TATA-3 może trawić DNA co 256pz (4 4 ) Sekwencje sześcionukleotydowe statystycznie, pojedynczy enzym rozpoznający sekwencję np. 5 -GATTAG-3 może trawić DNA co ok 4096pz (4 6 ) Sekwencje ośmionukleotydowe wykazują znacznie mniej (co 4 8 pz)miejsc restrykcyjnych niż enzymy rozpoznające krótsze sekwencje Sekwencje niespecyficzne: 5 -GATSAG-3 5 -GATRAG-3 5 -GATNNNAG-3 wykazują znacznie więcej miejsc restrykcyjnych niż enzymy rozpoznające sekwencje specyficzne UNIWERSALNE NAZEWNICTWO NUKLEOTYDÓW IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) SYMBOL OPIS NUKLEOTYD A Adenina A C Cytozyna C G Guanina G T Tymina T U Uracyl U W Weak A T S Strong C G M amino A C K Keto G T R puryna A G Y pirymidyna C T B nie A (B występuje po A) C G T 1 2 D nie C (D występuje po C) A G T H nie G (H występuje po G) A C T 3 V niet (V występuje pot i U) A C G N No idea (ale nie miejsce puste = gap) A C G T 4 ROZPOZNAWANE SEKWENCJE Izoschizomery- enzymy izolowane z różnych organizmów, ale rozpoznające te same sekwencje SphI -Streptomyces phaeochromogenes BbuI- Bacillus species, szczep Bu1709 PaeI- Pseudomonas aeruginosa (5 -CGTACG-3 ) (5 -CGTACG-3 ) (5 -CGTACG-3 ) 3

4 MIEJSCE HYDROLIZY Enzymy hydrolizujące obie nici DNA w tym samym miejscupowstają tępe końce (blunt ends) HaeIII- Haemophilus aegyptius GG CC 5 -GGCC-3 5 -GG-3 5 -CC-3 3 -CC GG-5 3 -CC-5 3 -GG-5 Enzymy hydrolizujące każdą z nici DNA w innym miejscupowstają lepkie końce 3 (sticky ends) PstI- Providencia stuartii CTGCA G G ACGTC 5 -CTGCAG-3 5 -CTGCA-3 5 -G-3 3 -GACGTC-5 3 -G-5 3 -ACGTC-5 MIEJSCE HYDROLIZY Enzymy hydrolizujące każdą z nici DNA w innym miejscupowstają lepkie końce 5 (sticky ends) EcoRI- Escherichia coli szczep RY13 G AATTC CTTAA G 5 -GAATTC-3 5 -G-3 5 -AATTC-3 3 -CTTAAG-5 3 -CTTAA-5 3 -G-5 Neoschizomery- rozpoznają taką samą sekwencję DNA lecz przecinają ją w inny sposób SmaI- Serratia marcescens XmaI- Xanthomonas campestris CCC GGG GGG CCC C CCGGG GGGCC C ENZYMY RESTRYKCYJNE WRAŻLIWE NA METYLACJĘ Enzymy nie rozpoznające zasady po przyłączeniu grupy metylowej CH 3 np. Eco RI (niewrażliwy na metylację dam i dcm ale wrażliwy na metylację CpG) Enzymy ignorujące grupę metylową w każdym rodzaju metaylacji CH 3 np. MspI 4

5 Combined bisulfite restriction analysis- COBRA Dodatek dwusiarczanu sodu NaHSO 3 powoduje dwustopniowy proces przekształcający cytozynę w uracyl- TYLKO gdy zasada nie jest wcześniej połączona z grupą metylową Ciąg zasad replikowany jest w reakcji PCR z użyciem datp, dgtp, dctp i dttp, w ten sposób uracyl zamieniany jest na tyminę Nowa sekwencja (zamienione zasady na skutek braku metylacji), poddana jest trawieniu wybranym enzymem restrykcyjnym Stopień metylacji będzie oznaczany wprost (lub odwrotnie proporcjonalnie) do ilości uzyskanych fragmentów restrykcyjnych Combined bisulfite restriction analysis- COBRA 5 -CG CG-3 3 -GC GC Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 12 NIESPESYFICZNA AKTYWNOŚĆ Aktywność niespecyficzna (Star activity) pojawia się w przypadku, gdy warunki reakcji znacznie różnią się od optymalnych. Efektem jest zmiana (utrata) specyficzności enzymu Wysoka koncentracja glicerolu w mieszaninie reakcyjnej (>5% obj) Wysokie stężenie enzymu (pow. 100u) Niezoptymalizowany bufor (zasadowe ph; za wysoka zawartość jonów) Przedłużony czas reakcji enzymatycznej Obecność związków organicznych takich jak: DMSO, etanol, glikol etylenowy Zastąpienie (lub zwiększona koncentracja) jonów magnezu innymi dwudodatnimi jonami Mn 2+, Cu 2+, Co 2+ lub Zn 2+ EcoRI- rozpoznawalna sekwencja to 5 -GAATTC-3 zmienione trawione sekwencje to np. CAATTC, GAATTG, GTATTC 5

6 STANDARDY/MARKERY WIELOŚCI MASY CZĄSTECZKOWEJ Plazmidy trawione jedną lub kilkoma restryktazami do uzyskania szeregu fragmentów o różnej (znanej) długości Wykorzystywane w elektroforezie do wyznaczania długości migrujących cząsteczek Występują pod nazwami: standard masy; drabinka; marker masy cząsteczkowej STANDARDY/MARKERY WIELOŚCI MASY CZĄSTECZKOWEJ Fosfataza alkaliczna CIP Calf Intestine Phosphatase- pochodzenie: jelito cielęce BAP Bacterial Alcaline Phosphatase- pochodzenie: E. coli SAP Shrimp Alcaline Phosphatase- pochodzenie: krewetki Pandalus borealis Enzym standardowo oznaczany w surowicy krwi (ALP) pochodzący z kości; wątroby i jelit Kinaza polinukleotydowa T4 (PNK) Terminalna deoksynukleotydo- Transferaza (TdT) 6

7 Fosfataza alkaliczna (hydrolaza o aktywności fosfatazy- hydrolizuje wiązanie fosfomonoestrowe powodując defosforylację cząsteczki) CIP jest termolabilnym glikoproteidem złożonym z dwóch identycznych podjednostek o masie 96kDa (inaktywowana w 68 o C) BAP jest termostabilnym monomerem (47kDa) odpornym na działanie zw. organicznych (fenoli) usuwa grupę 5 fosforanową w obecności Mg 2+ i Zn 2+ pozostawiając w tym miejscu grupę OH Stosowana do defosforylacji wszystkich rodzajów cząstek kwasów nukleinowych w przypadku cząstek jednoniciowych zapobiega autoligacji (tworzeniu się struktury spinki do włosów) w przypadku dwuniciowych cząstek służy do zamiany reszty fosforanowej na znacznik fluorescencyjny 5 p-dna lub 5 p-rna alkaliczna fosfataza 5 OH-DNA lub 5 OH-RNA Kinaza polinukleotydowa T4 (transferaza; katalizuje transfer reszty fosforanowej z ATP na 5 koniec DNA i RNA) pochodzenie: E.coli zakażone fagiem T4 tetramer złożony z identycznych podjednostek o masie 33kD aktywna w stosunku do (5 oraz 3 ) wszystkich rodzajów cząsteczek kwasów nukleinowych katalizuje transfer fosforanu z ATP na koniec 5 cząsteczki DNA (lub RNA), która nie posiada reszty fosforanowej, ponieważ powstała w procesie chemicznej syntezy, lub uległa defosforylacji reakcja podstawienia "forward reaction" katalizuje przeniesiene reszty fosforanowej z 5 końca cząsteczki DNA (lub RNA) na ADP a następnie przeniesienie fosforanu na inną cząsteczkę DNA (lub RNA), która nie posiada na 5 końcu reszty fosforanowej reakkcja wymiany exchange reaction stosowana głównie do fosforylacji syntetycznych oligonukleotydów (starterów) do reakcji PCR 7

8 Terminalna deoksynukleotydo Transferaza (TdT) (katalizuje przyłączanie nukleotydów do końca 3 OH DNA w cząsteczkach jednoniciowych lub dwuniciowych przy lepkich końcach; nie wymaga obecności starterów!!!) pochodzenie: trzustka cielęca dimer złożony z podjednostek o masie 26 i 80kD wykazuje bardzo małą aktywność w stosunku do rybonukleotydów niezbędne do aktywności tego enzymu są jony Co 2+ (CoCl 2 ) stosowana do tworzenia homopolimerowych końców na nici DNA (ogonków) w metodzie TUNEL polegającej na znakowaniu wolnych końców DNA z dwóch stron (Terminal deoxynucleotidyl transferase biotindutp nick end labelling) służącej do identyfikacji apoptozy 8

9 TOPOIZOMERAZY Odpowiadają za stopień skręcenia superheliksu; biorą czynny udział w replikacji rozplatając podwójną helisę DNA (helikazy) DNA Topoizomeraza I o rozcina jedną nić DNA w szkielecie cukrowo-fosforanowym; (odpowiada za usuwanie z cząsteczki DNA skrętów relaksacja) DNA Topoizomeraza II (DNA gyraza) o rozcina obie nici DNA i łączy je ponownie wiązaniem fosodiestrowym (odpowiada za silniejsze skręcenie cząsteczki DNA) Topoizomerazy klasy A- łączą się z resztą fosforanową 5 DNA Topoizomerazy klasy B -resztą 3 DNA TOPOIZOMERAZY DNA Topoizomeraza I pozyskiwana z trzustki cielęcej pojedynczy polipeptyd o masie 105kDa może tworzyć cząsteczki koliste OC z superheliksu CCC wymaga obecności jonów Mg2+ DNA Topoizomeraza II izolowana z bakterii Micrococcus luteus białko złożone z dwóch identycznych podjednostek o masie 400kDa daje efekt odwrotny do Topoizomerazy I- może skręcać plazmidy OC do formy CCC lub odwracać skręty w formie CCC na ujemne lub negatywne praktyczne zastosowanie w terapii nowotworowej!!!! TOPOIZOMERAZY Topoizomeraza II w kompleksie z DNA zmienia skręt helisy 9

10 METYLAZY Transferazy katalizujące metylację DNA (kowalencyjne przyłączenie grupy metylowej CH 3 ) dam Metylaza przenosi z S-adenozylometioniny (SAM) resztę metylową do Adeniny w pozycji N-6 w sekwencji 5 -GATC-3 dcm Metylaza dodaje grupę metylową (metyluje) do wewnętrznej cytozyny w sekwencji 5 -CC(A/T)GG-3 METYLAZY 10