Otrzymanie ekstraktu zawierającego tyrozynazę. Wstęp teoretyczny 1. Otrzymywanie ekstraktów białek Celem badania białek enzymatycznych jest określenie jakiego rodzaju reakcję chemiczną katalizują. Dodatkowo poszukuje się związków chemicznych, które są substratami lub inhibitorami katalizowanej reakcji, określa się szybkośd reakcji prowadzonej przez enzym, a także określa jak wysokie jest powinowactwo enzymu do danego substratu. Izolacja i otrzymywanie czystych preparatów białek pozwala na przeprowadzenie szeregu eksperymentów biologicznych, biochemicznych oraz strukturalnych. Na przykład, żeby otrzymad kryształy białka pozwalające wyznaczyd jego przestrzenną strukturę należy stosowad czyste i homogenne preparaty. Uzyskanie białka z materiału biologicznego przebiega etapowo: białko zostaje wyekstrahowane z komórek, błon komórkowych lub ścian komórkowych, w ten sposób uzyskane homogenaty zostają zwirowane - z preparatu usuwane są fragmenty tkanek i nieuszkodzone komórki, w dalszym etapie prowadzi się oczyszczanie poprzez wysalanie, wytrącanie przy pomocy rozpuszczalników organicznych czy podwyższonej temperatury, w kolejnych eksperymentach wykorzystywane są techniki chromatograficzne: chromatografia kolumnowa, filtracja żelowa, chromatografia jonowymienna, chromatografia hydrofobowa czy chromatografia powinowactwa. Metody umożliwiające rozdrobnienie tkanek i uszkodzenie komórek to: metody mechaniczne: rozdrabnianie, powtarzane zamrażanie-rozmrażanie, homogenizacja, mrożenie, działanie ultradźwiękami lub wysokim ciśnieniem (prasa French a) metody enzymatyczne: enzymy proteolityczne (celulaza, chitynaza, lizozym, mannoza etc.). metody chemiczne: rozpuszczalniki organiczne (np. alkohole, etery, chloroform), EDTA. W przypadku kiedy badane białko występuje w komórkach w niewielkich ilościach i uzyskanie odpowiednich ilości białka jest trudne stosuje się techniki nadprodukcji białka w komórkach bakterii, grzybów lub w komórkach ssaków. Specjalnie zaprojektowane komórki programuje się do nadprodukcji badanego białka, a potem je oczyszcza zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej. Należy jednak pamiętad, że w przypadku kiedy produkujemy białka organizmów wyższych w systemach bakteryjnych właściwości uzyskanego białka i białka izolowanego z naturalnego źródła mogą byd inne. Główną przyczyną takiej sytuacji są modyfikacje potranslacyjne. W ostatnich latach opracowano również systemy ekspresji białek bez wykorzystania komórek tzw. cell-free protein expression systems. dr Katarzyna Kurpiewska 2017/2018 Strona 1 z 6
2. Stabilność preparatów białkowych Białka są to biopolimery szczególnie wrażliwe na działanie podwyższonej temperatury, zbyt wysokiego i niskiego ph, związków utleniających i redukujących. Zarówno czynniki chemiczne jak i fizyczne mogą zniszczyd natywną strukturę białka i zablokowad jego funkcje biologiczne. W przypadku białek enzymatycznych nawet niewielkie zmiany ph czy temperatury istotnie wpływają na szybkośd reakcji enzymatycznej. Białka globularne są rozpuszczalne w wodzie. W roztworach soli o wysokich stężeniach można je wytrącid z roztworu- taką procedurę nazywamy wysalaniem białek. Jony soli konkurują z cząsteczkami białka o cząsteczki wody, tym samym dochodzi do zaburzenia otoczki wodnej białka, zmniejszenia jego rozpuszczalności i wytrącania z roztworu. W pewnym zakresie stężeo wysalanie białek jest procesem odwracalnym. Po obniżeniu stężenia soli białko z powrotem przechodzi w formę rozpuszczalną. 3. Białko enzymatyczne- tyrozynaza Tyrozynaza (EC 1.14.18.1) jest enzymem szeroko rozpowszechnionym w organizmach żywych. Obecnośd tego enzymu stwierdza się zarówno w mikroorganizmach, jak i komórkach roślinnych. W organizmach ssaków największą aktywnośd tyrozynazy wykrywa się w melanocytach, gdzie jest ona kluczowym enzymem szlaku syntezy melaniny. Część praktyczna Cel dwiczenia: Otrzymanie aktywnego ekstraktu tyrozynazy z pieczarek. Odczynniki i materiały: 1) 100 g świeżych pieczarek 2) lejek oraz bibuła filtracyjna 3) blender, mikser, homogenizator 4) wirówka 5) zlewki 6) probówki typu eppendorf na 1.5 ml (lub 2 ml) i typu Falcon na 15 ml 7) nasycony (NH 4 ) 2 SO 4 (4.1 M w 25 C) 8) 0.1 M buforu cytrynianowego o ph 4.8 9) 0.1 M NaF 10) lód 11) pisaki wodoodporne Uwagi organizacyjne: Koocówkę miksującą blendera/homogenizatora i zlewki z pozostałym preparatem myjemy w łazience. Wykorzystywany plastik (głównie koocówki i eppendorfy po NaF) zbieramy w pojemnikach otrzymanych od prowadzącego. Wszystkie probówki, które nie miały kontaktu z NaF myjemy. Wykonanie doświadczenia: Częśd 1. Otrzymywanie enzymu z preparatów roślinnych. Z kapeluszy pieczarek zdjąd skórkę. Pokroid około 100 g kapeluszy na drobne kawałki (nie kroimy nóżek). Pokrojone pieczarki umieścid w zlewce i dokładnie zmiksowad. dr Katarzyna Kurpiewska 2017/2018 Strona 2 z 6
*UWAGA! dalsze czynności należy wykonywać w rękawiczkach ze względu na toksyczny NaF Wszystkie następne czynności wykonywad w temperaturze 2-4 C (w łaźni lodowej). Odważyd 10 g rozdrobnionej próbki w zlewce na 100 ml i dodad 10 ml porcjami po 1ml 0.1 M NaF. Dokładnie wymieszad. Preparat przesączyd przez bibułę filtracyjną (sączek karbowany) umieszczoną w lejku do zlewki na 50 ml. OBSERWACJA 1: Co się stało w zlewce po dodaniu NaF? Dodatkowo po przesączeniu pobrad z roztworu 100 µl do czystej probówki eppendorf i podpisad (NR 1). Pozostały na bibule osad wraz z bibułą wyrzucid do kosza. Oszacowad objętośd przesączu wykorzystując skalę na zlewce, zanotowad tę objętośd i dodad delikatnie po ściance zlewki taką samą objętośd nasyconego (NH 4 ) 2 SO 4. Po zapisaniu obserwacji otrzymany w ten sposób roztwór wymieszad i przenieśd pipetą do probówek typu eppendorf 1.5-2 ml (maksymalnie 12 sztuk) lub probówek na 15 ml typu Falcon (2-4 sztuki). Wirowanie wymaga użycia parzystej liczby próbek o porównywalnych masach. Probówki włożyd do wirówki i wirowad przez 5 minut z prędkością 3,000 x g. OBSERWACJA 2: Co się stało w zlewce po dodaniu (NH 4 ) 2 SO 4? Po zwirowaniu pobrad z dowolnej probówki 100 µl nadsączu do czystej probówki eppendorf i podpisad (NR 2). Ze wszystkich probówek usunąd nadsącz za pomocą pipety. Zanotowad całkowitą objętośd nadsączu. Pozostałe w próbówkach osady rozpuścid dodając po 500 µl 0,1 M buforu cytrynianowego ph 4.8 do każdego małego eppendorfa (w przypadku dużych probówek dodad po 2.5 ml buforu). Wytrząsad na wytrząsarce przez około 30 sekund, tak by wszystkie grudki osadu się rozpuściły. Następnie dodad 0,1 M buforu cytrynianowego ph 4.8 (objętośd dodawanego buforu uzgodnid z prowadzącym zajęcia). Maksymalna objętośd próbek to 12 ml. Delikatnie wymieszad i wirowad przez 5 minut z prędkością 1,400 x g. Otrzymany nadsącz jest ekstraktem zawierającym badany enzym!!! Pobrad 100 µl ekstraktu tyrozynazy do czystej probówki eppendorf i podpisad (NR 3). dr Katarzyna Kurpiewska 2017/2018 Strona 3 z 6
Delikatnie przenieśd ekstrakt do próbówki na 15 ml i podpisad (imię i nazwisko, data). Zanotowad objętośd preparatu. Próbkę oddad opiekunowi- zostanie przechowana w stanie zamrożonym do czasu wykonania eksperymentów w ramach dwiczenia Badanie właściwości ekstraktu zawierającego tyrozynazę. Kinetyka enzymatyczna. Wpływ ph na aktywność enzymu. OBSERWACJA 3: Jakiego koloru jest otrzymany preparat, czy jest przezroczysty? Częśd 2. Sprawdzenie aktywności enzymatycznej otrzymanego preparatu. Tyrozynaza działa niespecyficznie na związki o podobnej budowie do naturalnego substratu jakim jest tyrozyna. W celu sprawdzenia aktywności enzymu w otrzymanych preparatach wykorzystany zostanie katechol (1,2-dihydroksybenzen), który zostaje przekształcony w barwny o-chinonu (benzochinon). H 2 O Odczynniki i materiały: 1) ekstrakt tyrozynazy z części 1 2) bufor cytrynianowy ph 4.8 3) 0.09 M katechol 4) probówki typu eppendorf 5) pipety automatyczne, koocówki do pipet Wykonanie: do trzech opisanych probówek odmierzyd podane w poniższej tabeli objętości odpowiednich roztworów: Nr bufor cytrynianowy ph 4.8 ekstrakt enzymu tyrozynaza substrat katechol A 0.15 ml 1.15 ml - 5 minut 10 minut 15minut B 1.15 ml - 0.15 ml C 1.00 ml 0.15 ml 0.15 ml zapisad obserwacje odnośnie zmiany barwy w poszczególnych eksperymentach. dr Katarzyna Kurpiewska 2017/2018 Strona 4 z 6
Częśd 3. Oznaczenie stężenia białka metodą pomiaru absorbancji Większośd białek dzięki obecności tyrozyny i tryptofanu wykazuje maksimum absorpcji w =280 nm. Związkami mogącymi wpływad na wielkośd absorbancji w =280 nm są kwasy nukleinowe. Maksimum absorpcji dla kwasów nukleinowych występuje przy =260 nm. Ze względu na wpływ wszystkich składników roztworu otrzymanego białka poniższa metoda pozwala na oszacowanie przybliżonej zawartości białka w preparacie. Odczynniki i materiały: 1) roztwory Nr 1, Nr 2 i Nr 3 2) nasycony (NH 4 ) 2 SO 4 3) 0.1 M bufor cytrynianowy ph 4.8 4) 0.1 M NaF 5) spektrofotometr UV-vis, kuwety, pipety automatyczne, koocówki do pipet Wykonanie: ustawid spektrofotometr na pomiar przy długościach = 280 nm i =260 nm skalibrowad aparat względem próbki referencyjnej umieścid 2x990 µl roztworu stosowanego jako próbka referencyjna w kuwecie i dodad 20 µl badanego roztworu Nr 1, delikatnie wymieszad zmierzyd trzykrotnie absorbancję przy = 280 nm i = 260 nm i zanotowad w tabeli Probówka 1 2 3 = 280 nm = 260 nm Średnia białko *mg/ml+ białko *mg+ obliczyd stężenie białka ze wzoru (szerokośd kuwety 1cm): stężenie białka *mg/ml+ = (1.55 x A 280 ) (0.76 x A 260 ) pomiary wykonad również dla w roztworów Nr 2 i 3. OPRACOWANIE SPRAWOZDANIA: Sprawozdanie proszę przygotowad w grupach i oddad wydrukowane najpóźniej tydzieo po wykonaniu dwiczenia. Sprawozdanie proszę przygotowad w edytorze tekstu wg formularza (w wyjątkowych sytuacjach napisane odręcznie) zmieszczonego na stronie: http://www2.chemia.uj.edu.pl/~kurpiews/chem_med.html W sprawozdaniu proszę umieścid obserwacje i krótkie odpowiedzi na poniższe pytania dotyczące wykonania dwiczenia: 1. W jakim celu dodajemy do rozdrobnionego materiały roślinnego NaF? dr Katarzyna Kurpiewska 2017/2018 Strona 5 z 6
2. W jakim celu dodajemy do homogenatu roztwór (NH 4 ) 2 SO 4? Jakich innych substancji można użyd w tym samym celu? 3. Wyjaśnij co oznacza numer EC 1.14.18.1. 4. Dlaczego ekstrakcję enzymu prowadzimy w możliwie najniższej temperaturze? Zaproponuj inny, niż obniżenie temperatury, sposób zminimalizowania tego niekorzystnego zjawiska. 5. Wyjaśnij w jakim celu w części 2 dwiczenia przeprowadzono trzy eksperymenty. Czy wyniki doświadczenia zmieniły się w czasie? Krótko opisz w jaki sposób. 6. Podaj obliczone stężenia białka w roztworach Nr 1-3 w mg/ml. 7. Znając objętości otrzymanych preparatów na każdym z etapów i wyznaczone w nich stężenie białka *mg/ml+ porównaj całkowitą zawartośd białka *mg] w preparatachwyjaśnij otrzymane wyniki. 8. Mając do dyspozycji 1L buforu cytrynianowego (ph 4.8) o stężeniu 0.4 M, wykonaj obliczenia i napisz jak otrzymad 250 ml buforu cytrynianowego o stężeniu 0.15 M. LITERATURA: Dwiczenia z Biochemii red. L. Kłyszejko-Stefanowicz Analiza instrumentalna w biochemii. Wybrane problemy i metody instrumentalnej biochemii analitycznej A. Kozik, M. Rąpała-Kozik, I. Guevara-Lora Praktikum z biochemii dla studentów biologii i biotechnologii red. A. Dubin i B. Turyna dr Katarzyna Kurpiewska 2017/2018 Strona 6 z 6