Genomic Maxi AX Direct

Transkrypt

1 Genomic Maxi AX Direct Uniwersalny zestaw o zwiększonej wydajności do izolacji genomowego DNA z różnych materiałów. Procedura bez etapu precypitacji. wersja izolacji Nr kat D Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 500 µg. Produkt przeznaczony wyłącznie do badań naukowych. 1

2 Skład zestawu Składnik Ilość Temp. Przechowywania Kolumny Spin 500AX 10 szt. +4 do +8 C Probówki o poj. 50 ml typu Falcon 20 szt. Temp. Pok. Kolumna równoważąca 1 szt. Temp. Pok. L1.4 roztwór lizujący 60 ml Temp. Pok. W1G pierwszy roztwór płuczący 120 ml Temp. Pok. W2 drugi roztwór płuczący 60 ml Temp. Pok. Bufor TE 60 ml Temp. Pok. Proteinaza K 2 x 1,1 ml +4 do +8 C E bufor elucyjny 15 ml +4 do +8 C N bufor zobojętniający 1 ml Temp. Pok. Roztwór T 400 µl +4 do +8 C Wyposażenie i materiały niezbędne do izolacji DNA, które nie wchodzą w skład zestawu 1. Materiał do izolacji DNA 2. Enzymy (opcjonalnie w zależności od rodzaju materiału): Lizozym - 10 mg/ml, 400 U/µl (nr kat , ) Lizostafyna - 0,4 U/µl (nr kat , ) Mutanolizyna - 10 U/µl (nr kat , , ) 3. RNAza - 10 mg/ml (nr kat , ) (opcjonalnie) 4. Probówki o poj. 1,5 ml typu Eppendorf 5. Probówki o poj. 50 ml typu Falcon 6. Termoblok lub inny inkubator 37 C, 50 C 7. Wirówka z rotorem do wirowania probówek o poj. 50 ml typu Falcon UWAGA: Przed przystąpieniem do pracy zalecamy oczyszczenie powierzchni roboczej używając produktu LabZAP (nr kat ). Ilustracje zamieszczone w niniejszym protokole mają jedynie charakter poglądowy. Ich rzeczywisty wygląd, w tym kolor, może odbiegać od prezentowanych w grafice. Firma A&A Biotechnology udziela rocznej gwarancji na niniejszy zestaw. Firma nie gwarantuje poprawnego działania zestawu do izolacji DNA w przypadku: odstępstwa od dostarczonego wraz z zestawem protokołu braku zalecanego w niniejszym protokole wyposażenia i materiałów użycia innych odczynników niż zalecane lub które nie wchodzą w skład zestawu użycia przeterminowanych lub niewłaściwie przechowywanych odczynników oraz kolumn 2

3 Przygotowanie materiału Krew świeża lub mrożona 1. Przenieść 5 ml krwi do probówki o poj. 50 ml typu Falcon. Uwaga: w przypadku mniejszej ilości krwi niż 5 ml należy dodać buforu TE do całkowitej objętości 5 ml. 2. Dodać po 5 ml buforu lizującego L 1.4 oraz 200 µl Proteinazy K. 3. Całość wymieszać. Inkubować 20 min w temp. 50 C. Uwaga: Nie przedłużać inkubacji 4. Po inkubacji intensywnie worteksować próbkę przez 20 s. 5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. Bakterie 1. Przenieść 5-20 ml hodowli bakteryjnej do probówki o poj. 50 ml typu Falcon. 2. Odwirować. Usunąć supernatant. 3. Osad zawiesić w 5 ml buforu TE. Dodać po 50 µl lizozymu (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat , ). Inkubować 15 min w temp. 37 C. Uwaga: dla S.aureus zalecamy traktowanie lizostafyną (nie ma w zestawie, nr kat , ); dla Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Listeria zalecamy traktowanie mutanolizyną (nie ma w zestawie, nr kat , , ) lub lizozymem i mutanolizyną. 4. Dodać po 5 ml buforu lizującego L1.4 oraz 200 µl Proteinazy K. 5. Całość wymieszać przez odwracanie probówki. Inkubować w temp. 50 C do osiągnięcia całkowitej klarowności mieszaniny (zwykle 60 min). Opcjonalne usuwanie RNA: do próbki należy dodać 10 µl RNAzy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat , ). Następnie całość wymieszać i pozostawić próbkę na 5 min w temp. pokojowej. 6. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. Hodowle komórkowe 1. Przenieść 1,5 x x 10 7 hodowli komórkowych do probówki o poj. 50 ml typu Falcon. Odwirować. Usunąć supernatant. 2. Osad zawiesić w 5 ml buforu TE. Dodać po 5 ml buforu lizującego L 1.4 oraz 200 µl Proteinazy K. 3. Całość wymieszać przez odwracanie probówki. Inkubować w przez 30 min w temp. 50 C. Opcjonalne usuwanie RNA: do próbki należy dodać 10 µl RNAzy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat , ). Następnie całość wymieszać i pozostawić próbkę na 5 min w temp. pokojowej. 4. Całość wirować 10 min przy x g. Przenieść supernatant do nowej probówki o poj. 50 ml typu Falcon. 5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. Tkanki 3

4 1. Pociąć ok mg tkanki na małe fragmenty lub rozetrzeć w ciekłym azocie i przenieść do probówki o poj. 50 ml typu Falcon. 2. Dodać po 5 ml buforu TE, 5 ml buforu lizującego L 1.4 oraz 200 µl Proteinazy K. 3. Całość wymieszać przez odwracanie probówki. Inkubować w temp. 50 C do całkowitego strawienia tkanki (zwykle min). Próbkę należy mieszać od czasu do czasu. Opcjonalne usuwanie RNA: do próbki należy dodać 10 µl RNAzy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat , ). Następnie całość wymieszać i pozostawić próbkę na 5 min w temp. pokojowej. 4. Całość wirować 10 min przy x g. Przenieść supernatant do nowej probówki o poj. 50 ml typu Falcon. 5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. Protokół izolacji Uwagi: Bufor elucyjny E traci aktywność przy dłuższym kontakcie z powietrzem. Bezpośrednio po użyciu należy szczelnie zakręcić pojemnik zawierający bufor elucyjny E. 1. Przygotowane próby nanieść na kolumny Spin 500AX umieszczone w probówkach o poj. 50 ml typu Falcon. W przypadku nieparzystej ilości próbek należy użyć do zrównoważenia kolumny równoważącej, dodając do niej odpowiednie ilości wody lub dowolnego roztworu równoważącego. 2. Wirować w rotorze uchylnym 2 min przy 3000 RPM. 3. Kolumny Spin 500AX przenieść do nowych probówek 50 ml typu Falcon (w zestawie). Nanieść na kolumny po 10 ml pierwszego buforu płuczącego W1G. 4. Wirować w rotorze uchylnym 2 min przy 3000 RPM. A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, Gdynia NIP

5 5. Następnie nanieść na kolumny Spin 500AX po 5 ml drugiego roztworu płuczącego W2. 6. Wirować w rotorze uchylnym 2 min przy 3000 RPM. 7. Przygotować probówki elucyjne 50 ml typu Falcon (w zestawie). Dodać na ich dno po 25 µl buforu zobojętniającego N. Zobojętnianie próbek DNA. Patrz Zobojętnianie próbek DNA - str Przed użyciem buforu elucyjnego E, zalecamy przeprowadzenie testu funkcjonalności. Patrz Test funkcjonalności buforu elucyjnego E - str. 6. Kolumny Spin 500AX przenieść do przygotowanych w pkt 7. probówek elucyjnych. Nanieść na kolumny po 1000 µl buforu elucyjnego E. Po użyciu buforu elucyjnego E należy zawsze szczelnie zakręcać pojemnik. Składniki buforu elucyjnego E ulegają rozkładowi przy długotrwałym kontakcie z powietrzem. Bufor elucyjny E należy zawsze przechowywać w temp. +4 do +8 C. 9. Inkubować 2 min w temp. pokojowej. temp. pok. 10. Wirować 2 min przy 3000 RPM. 11. Usunąć kolumny Spin 500AX. Eluaty DNA przenieść do probówek typu Eppendorf. DNA przechowywać w temp. +4 ºC lub -20 ºC do czasu dalszych analiz. A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, Gdynia NIP

6 Zobojętnianie próbek DNA Bufor elucyjny E jest silnie alkaiczny i po zamrożeniu może powodować degradację DNA. Z tego powodu konieczne jest stosowanie buforu zobojętniającego N. Z naszej praktyki laboratoryjnej wynika, że najwygodniej jest dodać bufor zobojętniający N przed elucją DNA, do pustej probówki elucyjnej (punkt 7. protokołu izolacji). W trakcie elucji, zawieszone w buforze elucyjnym DNA wymiesza się z buforem zobojętniającym N i ulegnie natychmiastowej neutralizacji. Po dodaniu buforu zobjętniającego N - DNA będzie zawieszone w roztworze 10 mm Tris ph 8,5. Tak przygotowane DNA może zostać bezpośrednio użyte do dalszych aplikacji, m.in. reakcji sekwencjonowania, PCR, klonowania. Jeżeli bufor zobojętniający N nie został dodany w punkcie 7. protokołu, to można dodać go po zakończonej izolacji - przed zamrożeniem próbek DNA. Test funkcjonalności buforu elucyjnego E Bufor elucyjny E ma kluczowy wpływ na wydajność elucji DNA. Jego prawidłowe działanie można sprawdzić za pomocą roztworu T wchodzącego w skład zestawu. Kiedy przeprowadzić test funkcjonalności: Bufor E nie był używany przez min. 2 miesiące Bufor E był przechowywany w temp. pokojowej przez min. 2 tygodnie Fiolka zawierająca bufor E nie została szczelnie zamknięta po użyciu Protokół 1. Przenieść 20 µl buforu E do nowej probówki PCR 2. Dodać po 2 µl roztworu T. Całość wymieszać 3. Poczekać 2 min 4. Porównać kolor mieszaniny ze zdjęciem obok przedstawiającym kolory referencyjne Bufor E nie działający poprawnie Bufor E działający poprawnie 6

7 Elementy do zamówień dodatkowych Nazwa Ilość Nr kat. Proteinaza K roztwór (20 mg/ml) 1,1 ml mg L Proteinaza K liofilizat 100 mg L 250 mg L 1000 mg L Bufor TE 100 ml Lizozym roztwór (10 mg/ml, 400 U/µl) Lizostafyna roztwór (0,4 U/µl) Mutanolizyna roztwór (10 U/µl) RNAza roztwór (10 mg/ml) 1 ml ml U U U U U ml ml

8 Informacje bezpieczeństwa NIEBEZPIECZEŃSTWO Proteinaza K H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P261 Unikać wdychania pyłu. P305+P351+P338 W przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P342+P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego skontaktować się z Ośrodkiem Zatruć lub lekarzem. UWAGA L1.4 roztwór lizujący H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. P305+P351+P338 W przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. UWAGA W1G pierwszy roztwór płuczący H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. P305+P351+P338 W przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. NIEBEZPIECZEŃSTWO E bufor elucyjny H314 Powoduje poważne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu/ ochronę twarzy. P305+P351+P338 W przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P310 Natychmiast skontaktować się z Ośrodkiem Zatruć lub lekarzem. 8