Izolacja RNA metodą kolumienkową protokół

Transkrypt

1 Izolacja RNA metodą kolumienkową protokół Istnieją dwa główne sposoby izolacji RNA. Izolacja przez ekstrakcję odczynnikiem zawierającym fenol i izotiocyjanian guanidyny oraz izolacja wykorzystująca powinowactwo kwasu nukleinowego do odpowiednio modyfikowanych chemicznie złóż silikonowych. Ze względu na łatwość zastosowania, obecnie dominuje metoda kolumienkowa. Poniżej przedstawiamy szczegółowy protokół takiej izolacji. Cel Szybka, pozwalająca na automatyzację, minimalizująca ryzyko kontaminacji metoda izolacji RNA z tkanek, kultur komórkowych, płynów ustrojowych i innych świeżych materiałów biologicznych Konieczne zasoby 1. Mikrowirówka na próbówki typu eppendorf 1,5 i 2ml 2. Pipety o zmiennej obiętości 3. Zestawy komercyjne do izolacji RNA dostosowane do izolowanego materiału i warunków w naszym laboratorium 4. Odczynniki lub akcesoria niedodawane do zestawu, a często niezbędne: *alkohol etylowy (co najmniej 96%) *woda DEPC *próbówki typu eppendorf do ostatecznej elucji *rękawice lateksowe

2 *inne, opisane w poszczególnych zestawach (bufory, odczynniki organiczne, plastiki) Metodyka Każdy zestaw posiada odrębny protokół postępowania, wymaga specyficznej ilości wirowań, odpowiednich ich parametrów, dodatku kilku różnych buforów o nieznanym nam składzie (tajemnica producenta) itd. Poszczególne etapy mogą wyglądać inaczej, ale odczynniki i plastiki są zawsze podobne, bo idea jest niezmienna od lat. Każda izolacja kolumienkowa, czy to DNA czy RNA, opiera się na kilku stałych etapach, przedstawionych poniżej. 1. Homogenizacja tkanki i jej upłynnienie 2. Efekt chaotropowy: zniszczenie komórek i inaktywacja enzymów 3. Związanie ze złożem kwasów nukleinowych i ich wytrącenie 4. Odpłukanie ciał komórek 5. Wypłukanie związków organicznych innych niż kwasy nukleinowe 6. Odsolenie złoża kolumny, wypłukanie resztek poprzednich buforów 7. Wysuszenie złoża z alkoholu 8. Elucja złoża, czyli rozpuszczenie RNA i odwirowanie z wodą lub buforem do świeżej próbówki. Szczegółowa procedura 1-2. Izolacja i liza komórek odbywa się w agresywnym buforze z rozpuszczalnikami organicznymi i/lub enzymami. W przypadku RNA nie stosuje się za to podwyższonej temperatury. Czasami kultury zawiesinowe, krew lub inne tkanki płynne są od razu przepuszczane przez wstępną kolumnę szatkującą (np: Qiagen Shredder Column w zestawach QiaQuick), w innych etap wstępny przypomina ekstrakcję fenolową (np. mirvana z Ambionu). Jeszcze inne korzystają z homogenizacji z kulkami szklanymi lub silikonowymi czy też z sonikacji. Opcji jest wiele. 3. Kwasy nukleinowe nie rozpuszczają się w alkoholu, za to mają powinowactwo do silikonowych złóż modyfikowanych polikationami (DNA jest polianionem) w wysokiej sile jonowej buforu do izolacji.

3 4. Teraz wykonuje się pierwsze wirowanie. Kwasy nukleinowe zostają w złożu, bufor i zlizowane komórki lądują w przesączu na dole i są do wyrzucenia. 5. Na złożu mamy bardzo zanieczyszczone solami i związkami organicznymi RNA. Kolejne bufory, zawierajace spadajace stężenie soli i wysokie stężenie etanolu (kwasy nukleinowe się w nim nie rozpuszczają i zostają na kolumnie!) są nakładane na kolumnę i przepuszczane przez nią dzięki wirowaniu. Eluaty w dalszym ciągu wyrzucamy. 6. Ostatnie wirowania, bez dodatku buforu osuszają złoże. Kolumnę przekłada się następnie do próbówki typu eppendorf, chwilę przetrzymuje otwartą do dosuszenia, po czym dodaje się buforu bez etanolu, w celu uzyskania wodnego roztworu kwasu nukleinowego. Ten eluat jest celem naszych starań. Kolumnę wyrzucamy a na eluacie wykonujemy dalsze zabiegi po spektrofotometrycznym sprawdzeniu ilości i jakości RNA. Uwagi: Ważne podczas izolacji kolumienkowej jest przede wszystkim stosowanie się do instrukcji producenta. Zwróćmy uwagę na: dodatek etanolu do buforów, które tego wymagają [patrz punkt 1], uważne nakrapianie buforów i próbek na kolumnę tak, by nie zachlapać wewnętrznej powierzchni wieczka [patrz punkt 2], wysuszenie złoża przed ostateczną elucją [patrz punkt 3], ogólna czystość pracy z RNA [patrz punkt 4]. [1] Bardzo często popełniany błąd, zdarzający się zarówno początkującym, jak i weteranom. Może Was kosztować sporo cennych próbek i zmarnowany zestaw do izolacji! Zawsze sprawdzajmy, czy na pudełku świeżo otwartego KITu nie ma informacji o dodatku alkoholu. Gdy go dodajemy, to tylko w odpowiedniej objętości, tylko stężonego. Zawsze odhaczamy na pudełku informację o dodanym alkoholu, by współpracownicy wiedzieli, że bufor jest gotowy do użycia. [2] Zachlapanie wieczka pogorszy nam czystość RNA, ponieważ sole i zanieczyszczenia organiczne mogą pozostać pod wieczkiem podczas wirowania aż do końcowego etapu elucji i razem z eluatem zostać wymyte. Nie jest to kwestia życia i śmierci, ale wpływa na jakość. [3] Resztki etanolu w izolacie zmniejszają wydajność reakcji opartych o PCR i

4 hybrydyzację. Najczęściej nie są to wielkie straty, ale w skrajnych przypadkach uniemożliwiają jakąkolwiek amplifikację. Szczególnie ważne jest to podczas przygotowywania mikromacierzy cdna czy też w diagnostyce in vitro. [4] Mowa głównie o rękawiczkach, używaniu wody DEPC, ogólnej higienie pracy z łatwo degradującym materiałem. Troubleshooting, czyli kiedy coś idzie niezgodnie z planem 1. Po wymyciu kolumienki nie otrzymuję w ogóle RNA lub jest go tyle, co nic. sprawdź bufory. Czy dodałeś etanol do buforów przemywających (wash)? Czy nie pomyliłeś buforu do elucji (ang. elution buffer) z buforem do przemywania? Spróbuj użyć zamiast buforu do elucji czystej wody. czy używasz zestawu odpowiedniego do twojej tkanki? Tkanki lite mogą nie strawić się w buforach do lizy przystosowanych np. do krwi czy używasz odpowiedniej ilości tkanki? czy użyto rękawiczek podczas izolacji? Czy tkanka była świeża i odpowiednio przechowywana? 2. Kolumna się zapycha i nie da się jej zwirować. czy używasz zestawu odpowiedniego do twojej tkanki? Tkanki lite mogą nie strawić się w buforach do lizy przystosowanych np. do krwi i zatykają kolumnę czy bufor do lizy jest dodany w odpowiedniej objętości i inkubowany zgodnie z zaleceniami producenta? czy kolumny są nowe, nieużywane? 3. Kolumny się zniekształcają/wybuchają/kruszą się podczas wirowania. czy parametry wirowania są odpowiednie? czy kolumny są nowe, nieużywane i nie są przeterminowane? 4. RNA jest paskudnej jakości. Nie nadaje się do żadnych oznaczeń. czy bufory były uważnie nakładane na kolumnę, czy moczyły wieczko kolumny? czy użyto buforów w odpowiedniej kolejności? czy bufor do elucji był niezanieczyszczony? Spróbuj elucji wodą DEPC. czy użyto odpowiedniej, nie za dużej ilości tkanki? czy zbiorniczek kolumny był opróżniany między wirowaniami? czy używano rękawiczek podczas izolacji? Czy tkanka była świeża i

5 odpowiednio przechowywana? czy używasz zestawu odpowiedniego do Twojej tkanki? Kolumienki do izolacji RNA pozwalają na szybką ekstrakcję RNA nawet z dużej ilości próbek Źródło: opracowanie własne Jeżeli powyższe opracowanie nie dało odpowiedzi na Wasze problemy, najlepszym wyjściem będzie kontakt z firmą, która wyprodukowała dane kolumienki. Nikt nie powinien lepiej orientować się niż ona we własnościach swojego towaru. Zdarzają się także wadliwe partie, które producent powinien wymienić, jeżeli zaistnieje taka sytuacja. Piśmiennictwo: Własne doświadczenie zawodowe Data publikacji: r.