PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika

Transkrypt

1 PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika Spis treści 1. Zawartość Składniki zestawu 2 2. Opis produktu Założenia metody Instrukcja Specyfikacja zestawu Przechowywanie próbek Procedury elucji 3 3. Warunki przechowywania i przygotowanie roztworów 3 4. Instrukcja bezpieczeństwa 4 5. Protokół 5 6. Załącznik Rozwiązywanie problemów Zamówienia 7 PathogenFree DNA Isolation Kit - zestaw do izolacji DNA, instrukcja użytkownika Strona 1 z 7

2 1. ZAWARTOŚĆ 1.1. Składniki zestawu Wielkość opakowania Odczynnik Zestaw na 50 izolacji Zestaw na 250 izolacji Bufor B1 10 ml 50 ml Odczynnik B2 2.5 ml 12.5 ml Bufor B5 (koncentrat)* 7 ml 2 x 20 ml Bufor BW 30 ml 2 75 ml Bufor BE 13 ml 60 ml Proteinaza K (liofilizowana)* 30 mg 2 x 75 mg Proteinaza - Bufor 1.8 ml 8 ml Kolumienki wiążące DNA (z probówkami) Probówki 2 ml Etykiety na bufor B3 1 1 *instrukcje przygotowania roztworów umieszczono w punkcie 3 2. OPIS PRODUKTU 2.1. Założenia metody W metodzie izolacji DNA GeneProof genomowy DNA może być ekstrahowany z próbek krwi, kultur komórkowych, surowicy, osocza i innych płynów ciała. Liza komórek odbywa się w trakcie inkubacji próbki z roztworem zawierającym duże ilości substancji chaotropowych i proteinazę K. Etanol dodany do lizatu tworzy specyficzne środowisko wiązania DNA do silikonowej membrany kolumienki. Proces wiązania jest odwracalny i specyficzny dla kwasu nukleinowego. Podczas etapów przemywania kolumny zanieczyszczenia są efektywnie wymywane. Czysty genomowy DNA jest eluowany w warunkach niskiej siły jonowej przy użyciu lekko zasadowego buforu elucyjnego Instrukcja Doświadczeni użytkownicy korzystający z zestawu do izolacji GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit mogą skorzystać ze skróconej wersji instrukcji. Użytkownikom używającym zestawu po raz pierwszy zaleca się dokładne przeczytanie pełnej wersji podręcznika Specyfikacja zestawu Zestaw do izolacji DNA GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit przeznaczony jest do szybkiej izolacji czystego genomowego DNA z krwi pełnej, surowicy, osocza i innych płynów ciała, a także DNA wirusowego bądź bakteryjnego z próbek klinicznych. Do izolacji wirusowego DNA zaleca się stosowanie próbek pozbawionych komórek (surowica lub osocze) ze względu na fakt, że wirusowy DNA jest oczyszczany razem z DNA komórkowym. Zaleca się pobieranie krwi na antykoagulant EDTA, cytrynian lub heparynę. Jeśli próbka jest bogata w leukocyty (np. kożuszek leukocytarny), należy pobrać mniejszą objętość i rozcieńczyć próbkę sterylnym PBSem (rozpuścić 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4 i 0.24 g KH2PO4 w 800 ml H2O. Ustalić ph na 7.4 za pomocą HCl. Uzupełnić H2O do 1 litra) Zestaw umożliwia oczyszczenie genomowego DNA ze stosunkiem A260/280 pomiędzy 1,6 a 1,9 i średnim stężeniem ng/μl. PathogenFree DNA Isolation Kit - zestaw do izolacji DNA, instrukcja użytkownika Strona 2 z 7

3 DNA otrzymany w procesie izolacji jest gotowy do użycia i może być poddawany kolejnym procedurom (PCR, Southern blotting, reakcje enzymatyczne). Objętość próbki Średnia ilość otrzymanego DNA Objętość elucyjna Zdolność wiązania DNA Czas procedury do 200 μl płynu 4-6 μg 100 μl 60 μg 30 min 2.4. Przechowywanie próbek Próbki przeznaczone do izolacji DNA mogą być przechowywane przez kilka dni w temperaturze +4 C. Dłuższe przechowywanie skutkuje spadkiem wydajności izolacji. Przy dłuższym przechowywaniu zaleca się mrożenie próbek w temp. -20 C Procedury elucji Istnieje możliwość dostosowania metody elucji i objętości buforu elucyjnego w zależności od dalszego przeznaczenia DNA. Metoda standardowa pozwala odzyskać % związanego DNA. Możliwe modyfikacje protokołu: 1. Bufor elucyjny podgrzany do temperatury 70 C Wysoka wydajność (90-100%): Etap elucji wykonać 2 razy, dodać objętość buforu wskazaną w protokole. Wysokie stężenie: Na etapie elucji dodać 60% objętości buforu wskazanej w protokole. Stężenie DNA po takiej elucji będzie wyższe niż po zastosowaniu metody standardowej (ok. 130%). Odzysk związanego DNA to maksymalnie 80%. Wysoka wydajność i wysokie stężenie: Dodać połowę objętości buforu elucyjnego wskazanej w protokole, inkubować 3min, a następnie zwirować. Ponownie dodać połowę objętości buforu, inkubować i zwirować. Elucji ulegnie ok % związanego DNA w standardowej objętości elucyjnej z zachowaniem wysokiego stężenia. Bufor elucyjny stosowany w temperaturze pokojowej umożliwia elucję około 20% związanego DNA. 2. Elucję można przeprowadzić także za pomocą buforu Tris-EDTA o ph 8 przyczynia się to do wzrostu stabilności DNA, szczególnie podczas długotrwałego przechowywania, przechowywania w temperaturze 4 C czy temperaturze pokojowej (inhibicja DNAz). Należy jednak pamiętać o tym, że w zależności od końcowego stężenia EDTA może mieć wpływ na niektóre procedury stosowane po izolacji DNA. Wielokrotne rozmrażanie i zamrażanie, długotrwałe przechowywanie w temperaturze 4 C lub temperaturze pokojowej może przyczynić się do fragmentacji dłuższych fragmentów DNA i adsorpcji do powierzchni, a co za tym idzie skutkować zmniejszoną wydajnością reakcji PCR i niższą czułością wykrywania śladowych ilości DNA. 3. WARUNKI PRZECHOWYWANIA Uwaga: Bufory B1, B3 i BW zawierają chlorowodorek guanidyny. Należy nosić okulary ochronne oraz jednorazowe rękawiczki! PathogenFree DNA Isolation Kit - zestaw do izolacji DNA, instrukcja użytkownika Strona 3 z 7

4 Wszystkie składniki zestawu mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej (20-25 C) i zachowują w takich warunkach stabilność przez 1 rok. Przed rozpoczęciem pracy należy dodać odpowiednią ilość buforu do proteinazy (Proteinase Buffer) by rozpuścić liofilizowaną proteinazę K. Roztwór proteinazy K jest stabilny przez 6 miesięcy, jeśli przechowywany jest w temperaturze +4 C. Dopuszczalne jest przechowywanie w temp. -20 C przez dłuższy okres czasu. Bufor B5: Należy dodać odpowiednia ilość etanolu ( %) do koncentratu buforu B5. Bufor należy przechowywać w temperaturze pokojowej (20-25 C) przez maksymalnie 1 rok. Bufor B3: Przenieść zawartość fiolki z buforem B1 do odczynnika B2 i dokładnie wymieszać. Roztwór jest stabilny przez rok (temp. pokojowa). Odczynnik Opakowanie 50 reakcji - zawartość Opakowanie 250 reakcji - zawartość Bufor B5 (koncentrat) 7 ml - dodać 28 ml etanolu 2 x 20 ml dodać do każdej z butelek 80 ml etanolu Proteinaza K (liofilizowana) 30 mg dodać 1.35 ml buforu do proteinazy 2 x 75 mg - dodać do każdej z butelek 3.35 ml buforu do proteinazy Podczas przechowywania buforów B3 i B1 (szczególnie w niskiej temperaturze) może wytrącić się biały osad. Osad należy przed użyciem rozpuścić przez inkubację butelek w temperaturze 70 C. 4. INSTRUKCJA BEZPIECZEŃSTWA Niektóre ze składników zestawu GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit zawierają substancje szkodliwe dla zdrowia. Podczas pracy z zestawem należy nosić okulary ochronne i jednorazowe rękawiczki. Składnik zestawu B1 BW Proteinase K Substancja niebezpieczna Chlorowodorek guanidyny Chlorowodorek guanidyny Proteinaza K, liofilizowana Symbol Xn Xn Xn Opis Działa szkodliwie po połknięciu.. Działa drażniąco na oczy i skórę Działa szkodliwie po połknięciu. Działa drażniąco na oczy i skórę Działa drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę, Może powodować uczulenie w następstwie narażenia drogą oddechową Zwroty ryzyka Zwroty bezpieczeństwa R 22-36/38 S 22 R 22-36/38 S 22 R 36/37/38-42 S /37 Zwroty ryzyka R 22 R 36/37/38 R 36/38 R 42 Zwroty bezpieczeństwa S 22 S 24 S 26 S 36/37 Działa szkodliwie po połknięciu Działa drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę Działa drażniąco na oczy i skórę Może powodować uczulenie w następstwie narażenia drogą oddechową Nie wdychać pyłu Unikać zanieczyszczenia skóry Zanieczyszczone oczy przemyć natychmiast dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza Nosić odpowiednią odzież ochronną i odpowiednie rękawice ochronne PathogenFree DNA Isolation Kit - zestaw do izolacji DNA, instrukcja użytkownika Strona 4 z 7

5 5. PROTOKÓŁ Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować inkubator lub łaźnię wodną i podgrzać bufor BE do temperatury 70 C. Przygotować bufory B3, B5 oraz roztwór proteinazy K (patrz: punkt 3). 1. Liza komórek Dodać 25 ul proteinazy K do 200 ul próbki w probówce o pojemności 1,5 ml. W przypadku próbek o objętości mniejszej niż 200 μl dopełnić PBSem do 200 μl.w przypadku izolacji DNA wirusowego należy rozpocząć procedurę z 200 μl surowicy lub osocza.jesli używane są komórki z hodowli, należy zawiesić do 5 x 10 6 komórek w PBSie (końcowa objętość: 200 μl) Dodać 200 ul buforu B3 i zworteksować sekund. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 70 C. Lizat podczas inkubacji z buforem B3 powinien lekko zbrązowieć. W przypadku próbek starych bądź ze skrzepami należy wydłużyć czas inkubacji z proteinazą K (do 30min.), zworteksować 1-2 razy podczas inkubacji. 2. Przygotowanie warunków do wiązania DNA 200µl próbki + 25µl proteinazy K + 200µl B3 70 C, 30 min + Dodać 210 ul etanolu (96-100%) do każdej próbki i ponownie zwirować. 210µl etanolu, wymieszać 3. Wiązanie DNA Dla każdej próbki należy przeznaczyć jedną kolumnę wiążącą DNA; umieścić ją w 2 ml probówce wirówkowej i nakropić do niej próbkę. Maksymalna objętość roztworu na 1 kolumnę wynosi 650 μl. Wirować 1 minutę w 11,000 g. Jeśli po wirowaniu próbka nie została całkowicie przesączona przez filtr, należy powtórzyć wirowanie przy wyższych obrotach (< 15,000 g). Nakropić lizat 1min, g Usunąć przesącz razem z próbówką. 4. Przemywanie membrany Pierwsze przemywanie: Umieścić kolumienkę w nowej probówce 2 ml i dodać 500 ul buforu BW Wirować 1 minutę przy 11,000 g. Usunąć przesącz razem z próbówką. Drugie przemywanie: Umieścić kolumienkę w nowej probówce 2 ml i dodać 600 ul buforu B5 Wirować 1 minutę przy 11,000 g. Usunąć przesącz razem z próbówką. PathogenFree DNA Isolation Kit - zestaw do izolacji DNA, instrukcja użytkownika Strona 5 z 7

6 5. Suszenie membrany Umieścić kolumienkę w nowej probówce 2 ml i wirować 1 minutę przy 11,000 g. Na tym etapie usuwane są resztki etanolu. 6. Elucja DNA Umieścić kolumienkę w nowej probówce 1,5 ml i dodać 50 ul podgrzanego w temp. 70 C buforu elucyjnego BE Bufor BE należy nakropić bezpośrednio na membranę nie dotykając jej powierzchni tipsem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Zwirować 1 minutę w 11,000 g, a następnie dodać 50 ul podgrzanego buforu elucyjnego BE (70 C). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Zwirować 1 minutę przy 11,000 g. Końcowa objętość wynosi 100µl. 6. ZAŁĄCZNIK 6.1. Rozwiązywanie problemów Problem Możliwa przyczyna Rozwiązanie problemu Mało leukocytów w Zwirować krew pełną (3,300 g; 10 min) w temperaturze próbce pokojowej, wyizolować kożuszek leukocytarny (środkowa warstwa po wirowaniu). Niska wydajność procesu izolacji Słaba jakość uzyskanego DNA Niecałkowita liza komórek Niewłaściwe przygotowanie odczynników Złe warunki elucji Niewłaściwe przygotowanie odczynników Niecałkowita liza komórek Jeśli przyczyną było niedokładne zmieszanie próbki z buforem lizującym/proteinazą K, należy dobrze zworteksować mieszaninę natychmiast po dodaniu tych odczynników. Innym problemem mogą być złe warunki trawienia proteinazą K. Nie należy dodawać proteinazy bezpośrednio do buforu lizującego. Inkubować min w 70 C / 56 C. Bufory i roztwór proteinazy K przygotować zgodnie z instrukcją (punkt 3). Przed nakropieniem lizatów na kolumny dodać do nich etanolu. Przed elucją ogrzać BE do 70 C, nakrapiać dokładnie na środek membrany silikonowej. Wydajność elucji spada dramatycznie przy zastosowaniu buforów o ph< 7.0. należy używać lekko zasadowych buforów, np. BE (ph 8.5). Jeśli mamy do czynienia z próbkami starymi bądź zawierającymi skrzep, podczas inkubacji 70 C/ 56 C mieszaninę należy energicznie mieszać. Bufory i roztwór proteinazy K przygotować zgodnie z instrukcją (punkt 3). Przed nakropieniem lizatów na kolumny dodać do nich etanolu. Jeśli przyczyną było niedokładne zmieszanie próbki z buforem lizującym/proteinazą K, należy dobrze PathogenFree DNA Isolation Kit - zestaw do izolacji DNA, instrukcja użytkownika Strona 6 z 7

7 Słaba jakość uzyskanego DNA Problemy z DNA w procedurach poizolacyjnych (reakcje enzymatyczne) Obecność RNA w próbce Stara próbka lub próbka zawierająca skrzep Przeniesienie etanolu Zanieczyszczenie DNA substancjami interferującymi zworteksować mieszaninę natychmiast po dodaniu tych odczynników. Innym problemem mogą być złe warunki trawienia proteinazą K. Nie należy dodawać proteinazy bezpośrednio do buforu lizującego. Inkubować min w 70 C / 56 C. Jeśli obecność RNA jest niepożądana, należy przed dodaniem buforu lizującego dodać 20μl roztworu RNAzy A (20 mg/ml). Należy wydłużyć czas inkubacji z proteinazą K do 30 min i kilkukrotnie zworteksować próbkę w trakcie inkubacji. Należy dokładnie usunąć całą zawartość buforu B5 przed etapem elucji. Jeśli podczas drugiego przemywania doszło do zanieczyszczenia wylotu kolumienki buforem B5, należy usunąć przesącz, a kolumnę przenieść do nowej probówki i ponownie zwirować. Jeśli DNA eluowano buforem TE (Tris/EDTA), należy upewnić się, że EDTA nie wpływa na przebieg kolejnych procedur; oczyścić ponownie DNA i eluować buforem BE. Jeśli DNA był izolowany ze starej lub zakrzepionej próbki, należy wydłużyć czas inkubacji do 30 min i worteksować (1-2x) podczas inkubacji. Jeśli stosunek A260/280 eluatu wynosi mniej niż 1.6, należy powtórzyć oczyszczanie: dodać 1 objętość buforu B3 i 1 objętość etanolu do eluatu, nakropić na kolumienkę i kontynuować poczynając od punktu 3 protokołu Zamówienia Nazwa zestawu Nr kat. Wielkość opakowania PathogenFree DNA Isolation Kit IDNA izolacji PathogenFree DNA Isolation Kit IDNA izolacji Producent: GeneProof a.s. Vinicni 235, Brno, Czech Republic info@geneproof.com Phone/Fax: Orders: sales@geneproof.com Customer service: support@geneproof.com Wyłączny dystrybutor na Polskę: Imogena Os. Przemysława 12a/ Poznań www. imogena.pl biuro@imogena.pl Tłumaczenie z języka angielskiego: Imogena Wersja 1.0. Wszystkie prawa zastrzeżone. PathogenFree DNA Isolation Kit - zestaw do izolacji DNA, instrukcja użytkownika Strona 7 z 7