PL B1. AKADEMIA MEDYCZNA IM. PIASTÓW ŚLĄSKICH WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL BUP 11/09

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 9/88 ( ) C12Q 1/527 ( ) C12N 11/00 ( ) (54) Sposób otrzymywania α-enolazy z nerki człowieka (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 11/09 (73) Uprawniony z patentu: AKADEMIA MEDYCZNA IM. PIASTÓW ŚLĄSKICH WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/12 (72) Twórca(y) wynalazku: JADWIGA PIETKIEWICZ, Wrocław, PL IRENEUSZ CEREMUGA, Brzeg, PL ANDRZEJ GAMIAN, Wrocław, PL PAWEŁ CHUDOBA, Wrocław, PL PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania α-enolazy z nerki człowieka uzyskanej jako organ niewykorzystany do przeszczepu ze względu na brak odpowiedniego biorcy, znajdującej zastosowanie w diagnostyce klinicznej do monitorowania obecności przeciwciał anty-α-enolazowych w surowicach patologicznych i wykorzystywanej w biochemii do badań podstawowych. Enolaza jest enzymem szlaku glikolizy, przemiany powszechnie występującej w komórkach eukariota i prokariota, dostarczającej energii dla utrzymywania procesów życiowych. W ustroju człowieka i niższych ssaków enolaza występuje w formie izoenzymów tkankowo-specyficznych. W mięśniach poprzecznie prążkowanych dominuje izoenzym β, w neuronach i tkance endokrynnej - izoforma γ, ale najbardziej pospolita jest α-enolaza. Występuje ona w komórkach wątroby, nerek, płuc, śledziony, trzustki, w erytrocytach. Wiele nowych doniesień wskazuje, że α-enolaza jest białkiem wielofunkcyjnym i poza funkcją katalityczną spełnia inne, nieenzymatyczne zadania. Po wyeksponowaniu na powierzchni różnych komórek, α-enolaza jest białkiem receptorowym dla plazminogenu. Aktywacja tego zymogenu do plazminy nadaje komórkom powierzchniową aktywność proteolityczną, co może być przez nie wykorzystywane nie tylko do rozkładania fibryny w procesie fibrynolizy, ale również do degradacji białek macierzy zewnątrz-komórkowej. Układ α-enolaza/plazminogen, wykorzystują komórki systemu obronnego w migracji do rejonów zapalnych, komórki nowotworowe w procesach rozrostu guza i przerzutowaniu, a komórki patogenów do kolonizacji tkanek gospodarza. Wykazano, że w różnych stanach chorobowych wynikających z infekcji lub wskutek niekontrolowanego wzrostu i proliferacji komórek zmienionych nowotworowo, pojawiają się w układzie krążenia przeciwciała skierowane przeciwko α-enolazie. Mogą one reagować z rodzimą α-enolazą wyeksponowaną na powierzchni własnych komórek ustroju człowieka, co prowadzi do rozwoju chorób autoimmunoagresyjnych. Wykrywanie takich przeciwciał w surowicach pacjentów daje podstawy klinicystom na monitorowanie rozwoju choroby i sprawdzanie skuteczności stosowanej terapii. Wydzielona z tkanki ludzkiej α-enolaza jest predestynowana do wykorzystana jako specyficzny antygen do wykrywania w surowicach patologicznych obecności przeciwciał anty-α-enolazowych. Opisywane w doniesieniach metody oczyszczania różnych izoenzymów enolazy z tkanek człowieka i ssaków oparte są na ekstrakcji białek z frakcji cytosolowej, częściowym usuwaniu białek balastowych w etapach denaturacji termicznej i wysalania, a następnie frakcjonowaniu chromatograficznym w kolumnach wypełnionych różnymi nośnikami. Alfa-enolazę z nerki człowieka otrzymano dotychczas tylko jako wstępnie oczyszczone białko w metodzie opisanej przez: Pratesi F., Moscato S., Sabbatini A., Chimenti D., Bombardieri S., Migliorini P., J. Rheumatol. (2000) 27 : Autoantibodies specific for α-enolase in systemic autoimmune disorders. Mrożoną tkankę zawieszano w 0.05M buforze Tris-HCl ph 6.8 zawierającym inhibitory proteaz : M PMSF i leupeptynę -10 μg/ml. Materiał sonikowano w łaźni lodowej i wirowano przy g przez 15 minut w 4 C. Białka ekstraktu rozdzielano w kolumnie wypełnionej CM-celulozą (Whatman). Związaną z kationitem α-enolazę eluowano gradientem NaCl. Brak jest danych o czystości otrzymanego czystego enzymu, jego aktywności i wydajności procesu. Dokładniej opisano sposoby otrzymywania α-enolazy z nerki wieprzowej. W sposobie przedstawionym w publikacji: Wakui H., Imai H., Komatsuda A., Miura A.B., Clin. Exp. Immunol. (1999) 118: Circulating antibodies against α-enolase in patients with primary membranous nephropathy (MN). Ekstrakcję białek z nerki wieprzowej wykonywano w buforze Tris-HCl ph 7,4 o słabej sile jonowej, a białka z ekstraktu wysalano siarczanem amonowym w zakresie 50-80% nasycenia. W dalszych etapach oczyszczania zastosowano chromatografię kolumnową wykorzystując anionit DEAE-celulozę, kationit CM-celulozę oraz złoże hydrofobowe w postaci hydroksyapatytu. W publikacji nie podano bilansu preparacji, co powoduje, że brak jest danych o wydajności procesu, natomiast pokazany rozdział elektroforetyczny uzyskanego preparatu wskazuje na otrzymanie homogennej α-enolazy z nerki wieprzowej. Inna metoda wydzielania α-enolazy z nerki wieprzowej została opisana w publikacji: Oh S.K., Brewer J.M., Arch. Biochem. Biophys. (1973) 157: Purification and properties of enolase from swine kidney, z podaniem pełnego bilansu oczyszczania. Porcję tkanki homogenizowano w podwójnej objętości wody destylowanej przez 3 minuty, mieszano w temperaturze 4 C przez 1 godzinę, po czym wirowano przy g przez 30 minut. Do uzyskanego supernatantu dodano 0,01 M MgSO 4 i 0,001 M EDTA, a następnie denaturowano część białek w temperaturze 55 C przez 3 minuty. Po wirowaniu zawartości przy g przez 30 minut, osad zdenaturowanych białek

3 PL B1 3 odrzucono, a denaturację termiczną powtórzono po dodaniu do supernatantu 0,1 mm 2-fosfoglicerynianu jako substratu enolazy. Następnie wysalano z supernatantu frakcję białek zawierającą aktywną enolazę, stosując stały siarczan amonowy w zakresie nasycenia 55-75%. Wytrącone białka wirowano przy g przez 30 minut, zebrany osad rozpuszczono w 100 ml wody i odsalano w kolumnie Sephadex G-75, zrównoważonej 0,01 M buforem imidazol-hcl ph 7,0 z 0,002 M MgCh. Frakcje z aktywną enolazą zebrano, doprowadzono do ph 8,0 za pomocą 1 M Tris i frakcjonowano w kolumnie wypełnionej DEAE-celulozą, zrównoważoną buforem 0,01 M Tris-HCl ph 8,0 zawierającym 0,002 M MgCl 2. Związaną w tych warunkach enolazę eluowano liniowym gradientem 0,01-0,1 M Tris-HCl ph 8,0. Zebrane frakcje z aktywnym enzymem zagęszczano i nanoszono na kolumnę DEAE-Sephadex A-50. Z reguły enolaza nie była wiązana w tych warunkach, ale jeśli adsorbcja zachodziła, związane białko eluowano gradientem 0,00-0,05 M NaCl w 0,01 M Tris-HCl ph 8,0 z 0,002 M MgCl 2. Zebrane po tym etapie frakcje z aktywnym enzymem zagęszczano, doprowadzano do ph 7,0 roztworem 1 M imidazolu i oczyszczano w kolumnie CM-Sephadex C-50, zrównoważonej buforem 0,01 M imidazol-hcl ph 7,0 z M MgCl 2. Związaną w tych warunkach enolazę eluowano w liniowym gradiencie 0,00-0,05 M NaCl. Uzyskane białko odsalano w kolumnie Sephadex G-100. Z ok. 550 g nerki wieprzowej uzyskano w ten sposób 15,4 mg homogennej α-enolazy o aktywności specyficznej 90 U/mg, z wydajnością 6%. Znane sposoby wydzielania homogennej α-enolazy z nerki wieprzowej wymagają zastosowania wielu etapów, zaś stosowane bufory używane do ekstrakcji mogą narazić białka ekstraktu na degradację proteolityczną ze względu na brak inhibitorów proteaz. W metodzie opisanej przez Oh'a i Brewer'a etap homogenizacji tkanki wykonywano w wodzie destylowanej, a sole magnezu dodawano dopiero w kolejnym etapie. Przed etapem wysalania białek wprowadzano dodatkowo denaturację termiczną, a dalsze oczyszczanie wymagało zastosowania pięcioetapowej chromatografii. Wydłużało to czas preparacji, zwiększało jej koszty, generowało straty aktywności, co powodowało, że wydajność procesu nie była wysoka. Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania α-enolazy z nerki człowieka poprzez ekstrakcję buforem Tris-HCl, wysalanie siarczanem amonowym oraz oczyszczanie metodą chromatografii kolumnowej. Istota wynalazku polega na tym, że w etapie ekstrakcji stosuje się bufor Tris-HCl o stężeniu 0,02 M i ph 7,2, zawierający 0,003 M siarczanu magnezowego, 0,01% objętościowych 2-merkaptoetanolu i inhibitory proteaz, a mianowicie PMSF o stężeniu 4 μl/ml oraz aprotyninę o stężeniu 2 μl/10 ml i homogenizuje, miesza i ponownie homogenizuje, po czym homogenat poddaje się wirowaniu, zaś otrzymany supernatant oddziela się i przesącza. Następnie prowadzi się wysalanie siarczanem amonowym w zakresie nasycenia 45-67% masowych, zaś otrzymany po wirowaniu osad z aktywną α-enolazą rozpuszcza się w buforze ekstrakcyjnym i dializuje do 0,02 M buforu Tris-HCl o ph 9,0 zawierającego 0,003 M siarczanu magnezowego i 0,001 M 2-merkaptoetanolu. Oczyszczanie prowadzi się najpierw na anionicie z użyciem DEAE-Sephadex A-50 zrównoważonym buforem Tris-HCl o ph 9,0, a następnie na kationicie CM-Sephadex C-50 zrównoważonym buforem fosforanowym (Na + ) o ph 6,0, zawierającym 0,003M siarczanu magnezowego i 0,001 M 2-merkaptoetanol. Korzystne jest, gdy wysalanie prowadzi się stałym siarczanem amonowym do nasycenia 45%, a po odwirowaniu do supernatantu dodaje się siarczan amonowy, aż do uzyskania nasycenia 67%. Korzystne jest, gdy po oczyszczaniu na anionicie zebrane frakcje z aktywnym enzymem zagęszcza się przez wirowanie w falkonach z błoną półprzepuszczalną, a następnie dializuje do buforu równoważącego kolumnę w następnym etapie oczyszczania. Korzystne jest, gdy po oczyszczaniu na kationicie zebrane frakcje z aktywnym enzymem zagęszcza się przez wirowanie w falkonach z błoną półprzepuszczalną, a następnie dializuje do buforu stabilizującego zawierającego 0,02 M imidazol ph 7,0, 0,003 M siarczan magnezu i 10% glicerol. Korzystne jest, jeżeli wszystkie etapy prowadzi się w temperaturze około 4 C. Sposobem według wynalazku wydziela się α-enolazę z nerki ludzkiej, zwłaszcza odrzuconej po przeszczepie, w której występuje ona w dużych stężeniach, nadającą się do wykorzystania jako specyficzny antygen pozwalający na wykrycie w patologicznych surowicach, między innymi w surowicach pacjentów cierpiących na toczeń trzewny, reumatoildalne zapalenie stawów czy retinopatię cukrzycową, obecności przeciwciał anty-α-enolazowych testem immunoenzymatycznym ELISA. Na tej podstawie możliwe jest skonstruowanie testu immunologicznego przydatnego w diagnostyce wielu różnych schorzeń autoimmuno-agresyjnych.

4 4 PL B1 Ponadto otrzymywana tym sposobem czysta α-enolaza jest przeznaczona do badań podstawowych w biochemii jako białko modelowe do analizy procesów modyfikacji potranslacyjnych i w badaniach interakcji z innymi białkami. Ludzka α-enolaza służy także jako antygen do immunizacji zwierząt w celu otrzymywania przeciwciał na to białko i wykorzystania ich w badaniach immunochemicznych i immunohistochemicznych w skrawkach tkankowych i liniach komórkowych. W sposobie według wynalazku zastosowano do ekstrakcji bufor Tris-HCl o niskiej sile jonowej, ale zawierający jony magnezowe, stabilizujące aktywność α-enolazy oraz odpowiednie inhibitory proteaz w celu ochrony białek przed degradacją proteolityczną. Korzystne warunki ekstrakcji białek oraz wyeliminowanie denaturacji termicznej zmniejszyło straty aktywności α-enolazy na wstępnych etapach oczyszczania, natomiast wysalanie α-enolazy w zawężonym zakresie nasycenia siarczanu amonowego, w porównaniu do znanych sposobów, oraz wykorzystanie do zagęszczania roztworów białek metody ultrafiltracji z użyciem falkonów z błoną półprzepuszczalną, pozwoliło na usuwanie z supernatantów dużej ilości białek balastowych. Zastosowanie w pierwszej kolejności DEAE Sephadex A-50 do frakcjonowania białek pozwoliło na zaadsorbowanie znacznej ilości białek barwnych, co ułatwiło dalsze oczyszczanie α-enolazy. W rezultacie sposób według wynalazku pozwala uzyskać homogenny enzym z dobrą wydajnością, a mianowicie około 21%, o dużej aktywności specyficznej, około 80 U/mg i o wysokim stopniu oczyszczenia równym 220. Przedmiot wynalazku przedstawiono w przykładzie wykonania. Etap 1 - Ekstrakcja. Porcję nerki ludzkiej zadano trzema objętościami schłodzonego do 4 C buforu ekstrakcyjnego, dalej oznaczanego jako bufor A, o składzie 0,02 M Tris-HCl i ph 7,0, zawierającego 0,003 M MgSO 4, 0,01% (v/v) 2-merkaptoetanolu i inhibitory proteaz: PMSF o stężeniu 4 μl/ml oraz aprotyninę o stężeniu 2 μl/10 ml. Tkankę homogenizowano w czasie 5 minut i po delikatnym mieszaniu w ciągu następnych 5 minut, ponownie homogenizowano przez 4 minuty. Homogenat wirowano przy 4 500g przez 45 minut, a uzyskany supernatant sączono przez wyjałowioną gazę w celu usunięcia tłuszczów. Wszystkie czynności wykonywano w temperaturze 4 C. Etap 2 - Wysalanie. Z klarownego przesączu wysalano α-enolazę stałym siarczanem amonowym. Osad białek wytrącony przy nasyceniu 45% siarczanu amonowego odwirowano przy g przez 45 minut i usuwano. Do supernatantu zawierającego aktywną α-enolazę dodawano siarczan amonowy do uzyskania nasycenia 67%. Po wirowaniu zawiesiny przy g przez 45 minut zebrano osad zawierający aktywną α-enolazę, rozpuszczano go w 4 ml buforu A i dializowano do buforu 0,02 M Tris-HCl i ph 9,0, zawierającego 0,003 M MgSO 4 i 0,001 M 2-merkaptoetanol, dalej oznaczanego jako bufor B. Etap 3 - Oczyszczanie metodą chromatografii kolumnowej na anionicie. Klarowny roztwór białek frakcjonowano w kolumnie (4x30 cm) wypełnionej złożem DEAE-Sephadex A-50, produkowanym przez firmę Pharmacia, zrównoważonym buforem B. W tych warunkach duża część białek barwnych wiązała się z wymieniaczem. Alfa-enolaza nie absorbowała się i była eluowana buforem równoważącym. Zebrane frakcje z aktywnym enzymem łączono, zagęszczano metodą wirowania w falkonach z błoną półprzepuszczalną, firmy Amicon Ultra 15,30 kda, a następnie dializowano do 0,02 M buforu fosforanowego (Na + ) ph 6,0 zawierającego 0,003 M MgSO 4 i 0,001 M 2-merkaptoetanolu, dalej oznaczanego jako bufor C. Etap 4 - Oczyszczanie metodą chromatografii kolumnowej na kationicie. Uzyskany materiał nanoszono na kolumnę (4x20 cm) z CM-Sephadex C-50, zrównoważoną buforem C. W tych warunkach α-enolaza wiązała się z złożem i eluowano ją gradientem o ph 6,0-8,0 buforu C. Zebrane frakcje z aktywną α-enolazą łączono, zagęszczano w falkonach i dializowano do buforu stabilizującego zawierającego 0,2 M imidazol o ph 7,0, oraz 0,03 M MgSO 4 i 10% glicerol. Otrzymany enzym przechowywano w temperaturze -80 C. Wszystkie czynności wykonywano w temperaturze 4 C. Przykładowym sposobem z masy 1745 mg białka zawartego w ekstrakcie tkankowym nerki człowieka uzyskano 7,23 mg jednorodnej α-enolazy o aktywności specyficznej 78,3 U/mg i stopniu oczyszczenia 220. Wydajność metody wyniosła 21,3%. Bilans oczyszczania α-enolazy z 62 g nerki człowieka przedstawia poniższa tabela.

5 PL B1 5 Etapy Masa białka (mg) Aktywność całkowita (U) Aktywność specyficzna (U/mg) Stopień oczyszczenia Wydajność % 1. Ekstrakcja , Wysalanie (45-67)% (NH 4 ) 2 SO 4 3. DEAE-Sephadex A CM-Sephadex C , , , , ,3 PIŚMIENNICTWO 1. Merkulova T., Lucas M., Jabet C, Lamande N., Rouzeau J.D., Gros F., Lazar M., Keller A.., Biochem. J. (1997) 323: Biochemical characterization of the mouse muscle-specific enolase: developmental changes in electrophoretic variants and selective binding to other proteins. 2. Pancholi V., Cell. Mol. Life Sci. (2001) 58: Multifunctional α-enolase: its role in diseases. 3. Liu K.J., Shih N.Y., J. Cancer Mol. (2007) 3: The role of enolase in tissue invasion and metastasis of pathogens and tumor cells. 4. Terrier B., Degand N., Guilpain P., Servettaz A., Guillevin L., Mouthon L., Autoimmunity Reviews (2007) 6: Alphaenolase: a target of antibodies in infectious and autoimmune diseases. 5. Pratesi F., Moscato S., Sabbatini A., Chimenti D., Bombardieri S., Migliorini P., J. Rheumatol. (2000) 27: Autoantibodies specific for α-enolase in systemic autoimmune disorders 6. Wakui H., Imai H., Komatsuda A., Miura A.B., Clin. Exp. Immunol. (1999) 118: Circulating antibodies against α-enolase in patients with primary membranous nephropathy (MN) 7. Oh S.K., Brewer J.M., Arch. Biochem. Biophys. (1973) 157: Purification and properties of enolase from swine kidney. 8. Rider C.C., Taylor C.B., Biochim. Biophys. Acta (1974) 365: Enolase isoenzymes from rat tisues. Electrophoretic, chromatographic, immunological and kinetic properties. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania α-enolazy z nerki człowieka poprzez ekstrakcję buforem Tris-HCl, wysalanie siarczanem amonowym oraz oczyszczanie metodą chromatografii kolumnowej, znamienny tym, że w etapie ekstrakcji stosuje się bufor Tris-HCl o stężeniu 0,02 M i ph 7,2, zawierający 0,003 M siarczanu magnezowego, 0,01% objętościowych 2-merkaptoetanolu i inhibitory proteaz, a mianowicie PMSF o stężeniu 4 μl/ml oraz aprotyninę o stężeniu 2 μl/10 ml i homogenizuje, miesza i ponownie homogenizuje, po czym homogenat poddaje się wirowaniu, zaś otrzymany supernatant oddziela się i przesącza, po czym prowadzi się wysalanie siarczanem amonowym w zakresie nasycenia 45-67% masowych, zaś otrzymany po wirowaniu osad z aktywną α-enolazą rozpuszcza się w buforze ekstrakcyjnym i dializuje do 0,02 M buforu Tris-HCl o ph 9,0 zawierającego 0,003 M siarczanu magnezowego i 0,001 M 2-merkaptoetanolu, natomiast oczyszczanie prowadzi się najpierw na amonicie z użyciem DEAE-Sephad6ex A-50 zrównoważonym buforem Tris-HCl o ph 9,0, a następnie na kationicie CM- Sep-hadex C-50 zrównoważonym buforem fosforanowym (Na + ) o ph 6,0, zawierającym 0,003M siarczanu magnezowego i 0,001 M 2-merkaptoetanol. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wysalanie prowadzi się stałym siarczanem amonowym do nasycenia 45%, a po odwirowaniu do supernatantu dodaje się siarczan amonowy, aż do uzyskania nasycenia 67%. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po oczyszczaniu na anionicie zebrane frakcje z aktywnym enzymem zagęszcza się przez wirowanie w falkonach błoną półprzepuszczalną, a następnie dializuje do buforu równoważącego kolumnę w następnym etapie oczyszczania.

6 6 PL B1 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po oczyszczaniu na kationicie zebrane frakcje z aktywnym enzymem zagęszcza się przez wirowanie w falkonach z błoną półprzepuszczalną, a następnie dializuje do buforu stabilizującego zawierającego 0,02 M imidazol ph 7,0, 0,003 M siarczan magnezu i 10% glicerol. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wszystkie etapy prowadzi się w temperaturze około 4 C. Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)