(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2012/46 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/22 ( ) C07K 16/28 ( ) C07K 16/32 ( ) C07K 16/42 ( ) A61K 39/00 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Przeciwciała wieloswoiste (30) Pierwszeństwo: US P US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2009/21 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/04 (73) Uprawniony z patentu: Genentech, Inc., South San Francisco, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 GERMAINE FUH, Pacifica, US JENNY M. BOSTROM, South San Francisco, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Mirosława Ważyńska JAN WIERZCHOŃ & PARTNERZY BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. ul. Żurawia 47/ Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 15662/12/P-RO/MW/KM EP PRZECIWCIAŁA WIELOSWOISTE Opis ODWOŁANIE DO POWIĄZANYCH ZGŁOSZEŃ PATENTOWYCH [0001] Niniejsze zgłoszenie korzysta z amerykańskich zgłoszeń patentowych o numerach 60/841,350 zgłoszonego 30 sierpnia 2006 r. i 60/937,814, zgłoszonego 28 czerwca 2007 r. DZIEDZINA WYNALAZKU [0002] Niniejszy wynalazek dotyczy wieloswoistych przeciwciał, i sposobów wytwarzania i stosowania takich przeciwciał. TŁO WYNALAZKU [0003] Przeciwciała to swoiste polipeptydy immunoglobulin, wytwarzane przez układ immunologiczny kręgowców, w odpowiedzi na zagrożenie, jakim są obce białka, glikoproteiny, komórki, lub inne antygenowe substancje obce. Ważną częścią tego procesu jest generowanie przeciwciał, które wiążą się swoiście do określonej obcej substancji. Swoistość wiązania takich polipeptydów do określonego antygenu jest wysoce dopracowana, a wiele swoistości, które mogą być wygenerowane przez poszczególnego kręgowca jest godna uwagi, co do swojej złożoności i zmienności. Tysiące antygenów jest zdolnych do wzbudzania odpowiedzi, z czego każda jest niemal wyłącznie nakierowana na określony antygen, który ją wzbudził. [0004] Swoiste rozpoznawanie antygenów jest kluczowe dla przeciwciał, przy funkcjonowaniu w adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Kombinatoryczne łączenie łańcucha ciężkiego (HC) i łańcucha lekkiego (LC) jest zachowane u wszystkich kręgowców, w generowaniu repertuaru przeciwciał. Występuje, jednakże, asymetria w zróżnicowaniu dwóch łańcuchów. Domena zmienna HC (V H ) ma znacząco wyższe zróżnicowanie sekwencji i częściej wnosi determinanty rozpoznawania antygenów niż domena zmienna LC (V L ). Rola LC w determinowaniu swoistości antygenu jest wskazywana procesem nazywanym edytowaniem receptora. Trwająca rekombinacja genów V L w celu edytowania receptora limfocytów B to główny mechanizm korygowania autoreaktywnych prekursorów przeciwciał, które zdają się stanowić znaczną część wyjściowego repertuaru (-75%). Wykazano, że zmienianie łańcucha lekkiego niszczy niepożądaną swoistość wiązania lub wieloswoistość. [0005] Swoistość przeciwciał i fragmentów przeciwciał dla określonego antygenu lub antygenów czyni przeciwciała pożądanymi środkami terapeutycznymi. Przeciwciała i fragmenty przeciwciał można stosować do nakierowywania do określonych tkanek, na przykład, nowotworu, i tym sposobem minimalizować potencjalne niepożądane działania nakierowywania nieswoistego. Jako takie, występuje bieżące i ciągłe zapotrzebowanie na identyfikowanie i charakteryzowanie terapeutycznych przeciwciał, szczególnie przeciwciał, ich fragmentów i pochodnych, użytecznych w leczeniu raka i innych zaburzeń namnażania. KRÓTKI OPIS WYNALAZKU

3 - 2 - [0006] Niniejszy wynalazek zapewnia sposób wytwarzania wieloswoistego przeciwciała, obejmujący etapy (1) różnicowania sekwencji aminokwasowej domeny zmiennej łańcucha lekkiego (V L ) przeciwciała, w którym przed różnicowaniem, przeciwciało składało się z V L i domeny zmiennej łańcucha ciężkiego (V H ) zdolnych do wiązania się do pierwszego epitopu i (2) wybierania różnicowanego przeciwciała zdolnego do wiązania się do pierwszego epitopu i drugiego epitopu, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach patentowych. Przed różnicowaniem, przeciwciało jest monoswoiste na etapie 1. Według jednej z postaci wykonania, V L /V H przeciwciała po zastosowaniu sposobów według wynalazku, jest dwuswoiste. W jednej z postaci wykonania, sekwencja aminokwasowa V L jest różnicowana przez zmienianie sekwencji kwasu nukleinowego kodującego V L i eksprymowanie różnicowanej V L. W dalszym przykładzie wykonania, różnicowanie zachodzi przez zmienianie wielu określonych z góry pozycji reszt aminokwasowych. Według jednej z postaci wykonania, reszty są różnicowane na podstawie zróżnicowania wielu naturalnie występujących sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego. Dodatkowo lub alternatywnie, reszty są różnicowane na podstawie dostępu do rozpuszczalnika. Według jednej z postaci wykonania, różnicowane V L są prezentowane na fagu z V H podczas etapu selekcji. Według dalszego przykładu wykonania, powinowactwo wiązania wieloswoistego przeciwciała można poprawić, przez poddawanie przeciwciała dojrzewaniu powinowactwa (np. skanowanie homologów lub inne mutacje V L i/lub V H ). [0007] Według jednej z postaci wykonania pozycje różnicowanych reszt wybiera się z grupy obejmującej: (1) pozycje 28, 30-32, 66-70, 92-93, opcjonalnie w pozycjach 30a-e i 93(a)-(b); (2) pozycje 28, 30-32, 66-70, 92-93, opcjonalnie w pozycjach 30a-f; (3) pozycje 28-32, 50-53, 92-93, opcjonalnie w pozycjach 30a-f i 93a-b; (4) pozycje 28, 30-32, 50-53, 92-93, opcjonalnie w pozycjach 30a-f i 93a-b; (5) pozycje 28-32, 50-53, 92-93; (6) pozycje 28-32, 50-53, 92-93, opcjonalnie 30a-b (7) pozycje 28-32, 50-53,91-93, 94, opcjonalnie 30a-f i 93ab; i (8) pozycje 29-32, 50-53, 66-67, 69-70, 92-93, 94, opcjonalnie 30a-f. Według jednej z korzystnych postaci wykonania, reszty V L są różnicowane według dowolnego ze schematów biblioteki opisanego na Figurze 1. [0008] Według jednej z postaci wykonania, etap selekcji o wiązanie do pierwszego epitopu lub selekcja o wiązanie do drugiego epitopu zachodzi w obecności obu różnicowanych V L i V H. Według kolejnej postaci wykonania, różnicowane V L i V H mogą wiązać pierwszy epitop i drugi epitop równocześnie. W alternatywnym przykładzie wykonania, różnicowane V L i V H wiążą pierwszy epitop i drugi epitop wzajemnie się wykluczając. W jednej z postaci wykonania, pierwszy epitop pochodzi z jednej cząsteczki biologicznej a drugi epitop pochodzi z tej samej cząsteczki biologicznej. W kolejnej postaci wykonania, pierwszy epitop pochodzi z jednej cząsteczki biologicznej, a drugi epitop pochodzi z drugiej cząsteczki biologicznej. Według jednej z postaci wykonania pierwsza cząsteczka biologiczna i druga cząsteczka biologiczna są strukturalnie niepodobne. [0009] Według jednej z postaci wykonania, pary pierwszej cząsteczki biologicznej i drugiej cząsteczki biologicznej wybiera się z poniższej grupy par: VEGF/HER2, VEGF-A/HER2, HER2/DR5, VEGF-A/PDGF, HER1/HER2, CD20/BR3, VEGF-A/VEGF-C, VEGF-

4 - 3 - C/VEGF-D, TNFalfa/TGF-beta, 1-NFalfa/IL-2, TNF alfa/il-3, TNFalfa/IL-4, TNFalfa/IL-5, TNFalfa/IL6, TNFalfa/IL8, TNFalfa/IL-9, TNFalfa/IL-10, TNFalfa/IL-11, TNFalfa/IL-12, TNFalfa/IL-13, TNFalfa/IL-14, TNFalfa/IL-15, TNFalfa/IL-16, TNFalfa/IL-17, TNFalfa/IL- 18, TNFalfa/IL-19, TNFalfa/IL-20, TNFalfa/IFNalfa, TNFalfa/CD4, VEGF/IL-8, VEGF/MET, VEGFR/MET receptor, HER2/Fc, HER2/HER3; EGFR/HER2, EGFR/HER3, EGFR/HER4, TNFalfa/IL-3, TNFalfa/IL-4, IL-13/CD40L, IL4/CD40L, TNFalfa/ICAM-1, TNFR1/IL-1R, TNFR1/IL-6R i TNFR1/IL-18R. W szczególnych przykładach wykonania, pierwsza cząsteczka biologiczna i druga cząsteczka biologiczna oznaczają VEGF/HER2, HER2/DR5 lub HER2/Fc. [0010] Według jednej z postaci wykonania, jedna z cząsteczek biologicznych oznacza cząsteczkę, która może zwiększyć okres półtrwania wieloswoistego przeciwciała po związaniu do przeciwciała in vivo. W kolejnej postaci wykonania, cząsteczka biologiczna oznacza albuminę surowicy lub neonatalny receptor Fc (FcRn). [0011] Według kolejnej postaci wykonania, jedna z cząsteczek biologicznych oznacza cząsteczkę, która może zwiększyć czynność efektorową wieloswoistego przeciwciała po związaniu do przeciwciała in vivo. W jednej z postaci wykonania, cząsteczka biologiczna wiąże się do białka powierzchniowego komórki na komórkach naturalnych zabójcach lub makrofagach. Białko powierzchniowe komórki może oznaczać C1q lub receptor Fc. [0012] Niniejszy wynalazek zapewnia również wieloswoiste przeciwciała wykonane sposobami według wynalazku. Rozważa się to, że wieloswoiste przeciwciało według wynalazku może zawierać jedną lub wiele domen V 1 /V H utworzonych sposobami według wynalazku, samodzielnie lub w kombinacji z domenami hiperzmiennymi przeciwciał, których nie utworzono sposobami według wynalazku. Wieloswoiste przeciwciało według wynalazku może występować w wielu postaciach (np. fragmenty przeciwciał, multimeryczne, itp). Według jednej z postaci wykonania, wieloswoiste przeciwciało oznacza dowolne z przeciwciał z Figur 5-10, 13-16, Figury 34, Figury 39 i Tabeli 2. W określonym przykładzie wykonania, wieloswoiste przeciwciało oznacza przeciwciało bh1 z Figury 34 lub jego fragment. [0013] Wieloswoiste przeciwciała wytwarzane sposobami według wynalazku można stosować na szereg sposobów, np. w terapiach do leczenia schorzeń lub chorób, w badaniach lub w oczyszczaniu. Na przykład, można je stosować w sposobie leczenia nowotworu (np. rakowatego guza) u pacjenta. Ten sposób wymaga podawania pacjentowi wieloswoistego przeciwciała spośród dowolnych przeciwciał z Figur 5-10, 13-16, Figury 34, Figury 39 i Tabeli 2, ich fragmentów, przeciwciała otrzymanego sposobami według wynalazku, przy czym podawanie prowadzi się przez okres czasu i w ilości wystarczającej do leczenia lub zapobiegania nowotworowi u pacjenta. W określonym sposobie, wieloswoiste przeciwciało oznacza przeciwciało bh1 z Figury 34 lub jego fragment. [0014] W kolejnym aspekcie, wieloswoiste przeciwciało można stosować w sposobie leczenia pacjenta obarczonego ryzykiem rozwinięcia się nowotworu. Sposób według wynalazku jest również korzystny w redukowaniu lub zapobieganiu nawrotowi nowotworu, na przykład,

5 - 4 - uśpionego nowotworu, który utrzymuje się po usunięciu pierwotnego nowotworu, lub w redukowaniu lub zapobieganiu nawrotowi lub namnażaniu guzów przerzutowych. Ten sposób wymaga podawania pacjentowi wieloswoistego przeciwciała spośród dowolnych przeciwciał z Figur 5-10, 13-16, Figury 34, Figury 39 i Tabeli 2, ich fragmentów lub przeciwciała otrzymanego sposobami według wynalazku. [0015] W dalszym przykładzie, wieloswoiste przeciwciało można stosować w metodzie leczenia pacjenta mającego lub obarczonego ryzykiem wystąpienia choroby autoimmunologicznej. Ta metoda wymaga podawania pacjentowi wieloswoistego przeciwciała spośród dowolnych przeciwciał z Figur 5-10, 13-16, Figury 34, Figury 39 i Tabeli 2, ich fragmentów lub przeciwciała otrzymanego sposobami według wynalazku, przy czym podawanie prowadzi się przez czas i w ilości wystarczającej do leczenia lub zapobiegania chorobie autoimmunologicznej u pacjenta. [0016] Również rozważa się zestawy, kompozycje i artykuły przemysłowe zawierające wieloswoiste przeciwciała. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0017] Figura 1 przedstawia zaprojektowane zróżnicowanie w różnych bibliotekach LC. Figura 2 przedstawia zestawienie czterech bibliotek łańcuchów lekkich, stosowane do zmieniania przeciwciał anty-vegf lub anty-her2 dla uzyskania wiązania do dodatkowego celu. Pisane kursywą NNK i XYZ dotyczą zestawów kodonów. Ys, Ds, Ts i Ss dotyczą miękkich randomizacji przez wykorzystanie tyrozyny, kwasu asparaginowego, treoniny i seryny, odpowiednio, występujących przez 50% czasu i dowolnych 20 aminokwasów występujących przez pozostałe 50% czasu. D/Ds i T/Ts dotyczą miękkiej randomizacji przez wykorzystanie D lub T, odpowiednio, występujących przez 75% czasu i dowolnych 20 aminokwasów występujących przez 25% czasu. Figura 3 przedstawia sekwencje reszt HC, LC CDR matryc łańcucha lekkiego (SEQ ID NOS:1-6 i 53-63). Figura 4 przedstawia warunki sortowania i wzbogacania biblioteki C i D. Figura 5 przedstawia czynniki wiążące VEGF (SEQ ID NOS:64-105). Reszty 28, 30, 30a, 31, 92, 93, i 93a były w pełni zróżnicowane. Reszty 32, 50, 53, 91 i 94 były ograniczane. Reszty 29, 33, i 51 były limitowane (<3). Figura 6 przedstawia czynniki wiążące DR5 (SEQ ID NOS: ). Figura 7 przedstawia czynniki wiążące ludzki VEGF, łączną selekcję na płytkach i w roztworze (SEQ ID NOS:4-6 i ). Figury 8A i 8B przedstawiają klony, które wiążą zarówno VEGF, jak i HER2 (SEQ ID NOS: ).

6 - 5 - Figura 9 przedstawia klony, które wiążą jedynie VEGF i tracą aktywność wiązania przy HER2 (SEQ ID NOS: ). Figura 10 przedstawia czynniki wiążące DR5, sortowane bezpośrednio na płytkach na HER2 (SEQ ID NOS:4-6 i ). Figura 11 przedstawia klony wiążące się do VEGF. Figury 12A i 12B przedstawiają klony, które blokują VEGF do VEGFR1-D2 lub D1. Figury 13A i 13B przedstawiają powinowactwa czynników wiążących VEGF (SEQ ID NOS:4-6 i ) z biblioteki L1/L2/L3-C,D. Figura 14 przedstawia zestawienie swoistych czynników wiążących z biblioteki LC (SEQ ID NOS:4-6 i ). Figura 15 przedstawia klony, które może mogą wiązać zarówno (Figura 15A) hvegf i HER2 lub (Figura 15B) DR5 i HER2 (SEQ ID NOS:4-6 i ). Figura 16 przedstawia czynniki wiążące z biblioteki LC, stosowane w tworzeniu i prezentowaniu na fagu scfv'2 (SEQ ID NOS:4-6 i ). Figura 17 przedstawia eksprymowanie różnych klonów w postaci Fab lub higg. Figury 18A i 18B przedstawiają testy ELISA klonów w postaci higg, wiążących się do hvegf165. Figura 19 przedstawia testy ELISA klonów w postaci higg wiążących się do immobilizowanych docelowych białek. Figura 20 przedstawia kompetycyjne testy ELISA klonów w postaci higg w obecności Her2 i VEGF lub DR5. Figura 21 przedstawia analizę Biacore wiązania do VEGF lub HER2. Figura 22 przedstawia wiązanie do HER2-ECD lub hvegf przez IgG lub Fab o łańcuchu lekkim uzyskanym z innego klonu wiążącego. Figury 23A i 23B przedstawiają przeciwciało anty-vegf blokujące oddziaływanie VEGF z VEGFR1 D 1-3 i KDR D1-7. Figura 24 przedstawia przeciwciała blokujące wiązanie B i VEGF. Figura 25 przedstawia przeciwciała blokujące wiązanie przeciwciała Avastin i VEGF. Figura 26 przedstawia inhibicję indukowanej przez VEGF proliferacji komórek HUVEC za pomocą przeciwciał anty-vegf. Figura 27 przedstawia wiązanie dwuswoistych przeciwciał do HER2 eksprymowanego na komórkach NR6. Figura 28 przedstawia kodony H1, które skanowano metodą shotgun. Figura 29 przedstawia konstruowanie biblioteki (SEQ ID NOS: ).

7 - 6 - Figura 30 przedstawia klon przeciwciała z mutacjami skanowanymi metodą shotgun, badany przesiewowo przez wiązanie do VEGF. Figura 31 przedstawia klon przeciwciała z mutacjami skanowanymi metodą shotgun, badany przesiewowo przez wiązanie do HER2. Figura 32 przedstawia wyniki skanowania alaninami bh1 pod kątem wiązania VEGF (Figura 32A) lub wiązania HER2 (Figura 32B) i wyniki skanowania homologów bh1 pod kątem wiązania VEGF (Figura 32C) lub wiązania HER2 (Figura 32D). Figura 33 przedstawia wyniki skanowania alaninami mutantów przeciwciał bh1 lub Herceptin. Figura 34 przedstawia sekwencje klonów bh1 o dojrzałym powinowactwie do VEGF i powinowactwo wiązania do VEGF lub HER2 (SEQ ID NOS: ). Figury 35A do 35D przedstawiają struktury krystaliczne dwuswoistych bh1 Fab związanych do HER2 lub VEGF. Figura 35E to wykres przedstawiający, że przeciwciała anty-vegf blokują wiązanie hvegf do receptora 2 VEGF (VEGFR2). Figura 35F to seria wykresów kołowych przedstawiających wkład poszczególnych CDR w strukturalny paratop dla bh 1. Rozmiar paratopu dla VEGF to 730A 2 a dla HER2 to 690A 2. CDR-y łańcucha ciężkiego zaznaczono na szaro, a CDR-y łańcucha lekkiego na biało. Figury 36A do 36C przedstawiają energetycznie ważne miejsca wiązania bh1 do wiązania VEGF i HER2. Figury 37A i 37B przedstawiają skanowanie typu shotgun, alaninami i homologami bh1 Fab pod kątem wiązania do VEGF i HER2. Figura 38 przedstawia naturalne i zaprojektowane zróżnicowanie CDR-ów łańcucha lekkiego. W każdej pozycji, sekwencję przeciwciała Herceptin pokazano w nawiasach. * wskazuje insercję, która nie jest obecna w przeciwciele Herceptin. Figury 39A i 39B przedstawiają sekwencje klonów swoiście wiążących antygen, izolowanych z biblioteki łańcucha lekkiego (LC). Figura 39A przedstawia sekwencje CDR LC monoswoistych klonów fagowych, wiążących się do VEGF, DR5, i Fc (SEQ ID NOS:4-6 i ), a Figura 39B przedstawia dwuswoiste wiązanie Fabs do VEGF/HER2, DR5/HER2 i Fc/HER2 (SEQ ID NOS:4-6 i ). Sekwencje zrębowe łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego odpowiadają tym z przeciwciała Herceptin za wyjątkiem substytucji zrębowej LC R66G. Figura 40 to wykres przedstawiający swoistość wiązania przeciwciał pochodzących z biblioteki LC. Pokazano wyniki dla przeciwciał bh1; bh3, 3-1, bd1, bd2, 4-1 i 4-5. Związane przeciwciała IgG wykrywano spektrofotometrycznie (gęstość optyczna przy 450 nm, oś y). Białka zawarte w oznaczeniu to (od lewej do prawej dla każdego przeciwciała) ludzki czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego A (hvegf-a),

8 - 7 - hvegf-c, hvegf-d, domena pozakomórkowa hher2 (ECD), domena pozakomórkowa receptora naskórkowego czynnika wzrostu (hegfr), ludzki tzw. receptor śmierci 5 (hdr5), bydlęca albumina surowicy (BSA), kazeina, płodowa surowica bydlęca (FBS), lizat komórek WIL2 i lizat komórek NR6. Figura 41 przedstawia wyniki z doświadczeń dojrzewania powinowactwa, wskazujące, że biblioteki według opisu można stosować do poprawiania powinowactwa zarówno VEGF, jak i HER2. Figura 42 przedstawia wyniki doświadczeń wiązania kompetycyjnego dla bh1 do VEGF lub HER2. Figury 43A i 43B przedstawiają, że bh1 IgG inhibuje proliferację komórek regulowaną przez HER2 i VEGF. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0018] Niniejszy wynalazek zapewnia sposoby wytwarzania wieloswoistych przeciwciał i fragmentów przeciwciał, jak również przeciwciała identyfikowane przy użyciu tych sposobów i ich zastosowanie. Na ogół, sposoby według wynalazku wymagają różnicowania domeny zmiennej łańcucha lekkiego lub domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała, w celu generowania wariantów, które można stabilnie eksprymować w bibliotece. Różnicowane przeciwciała, które są zdolne do swoistego wiązania się do dwóch epitopów są następnie wybierane z tej biblioteki i dalej charakteryzowane. [0019] Przykładowe przeciwciała zidentyfikowane sposobami według wynalazku obejmują przeciwciała, które wiążą się zarówno z HER2 (receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2) i VEGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego), jak również przeciwciała, które wiążą się zarówno z HER2, jak i DR5 (receptor śmierci 5). W szczególności, dane z opisu, przykładowo, z poniższych Przykładów, przedstawiają, że mutacje w regionach determinujących komplementarność (CDR-y) łańcucha lekkiego przeciwciała HER2 nadają zdolność podwójnego wiązania dla niespokrewnionych białkowych antygenów, jak również HER2. Jedno dwuswoiste przeciwciało o wysokim powinowactwie HER2/VEGF jest szczegółowo scharakteryzowane. Dodatkowo, pokazano struktury krystaliczne tego dwuswoistego Fab w kompleksie z HER2 i VEGF i oszacowano wkład energetyczny reszt Fab poprzez mutagenezę. Miejsca wiązania dla dwóch antygenów w dużym stopniu zachodzą na siebie; większość reszt GDR kontaktujących się z HER2 wiąże również VEGF. Energetycznie, jednakże, reszty łańcucha ciężkiego determinują swoistość HER2, podczas gdy łańcuch lekki determinuje swoistość VEGF. [0020] Dwuswoiste przeciwciało HER2/VEGF inhibuje zarówno regulowaną przez HER2, jak i VEGF proliferację komórek. Te wyniki demonstrują, że zmienianie sekwencji domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciała może generować przeciwciała o podwójnej swoistości i funkcji. Na przykład, bh1 ma potencjał nakierowywania na dwa mechanizmy progresji nowotworu: proliferację komórek nowotworowych, regulowana przez HER2 i angiogenezę nowotworu regulowaną przez VEGF.

9 - 8 - I. Definicje [0021] Pojęcie wieloswoiste przeciwciało jest stosowane w najszerszym rozumieniu i swoiście obejmuje przeciwciało zawierające domenę zmienną łańcucha ciężkiego (V H ) i domenę zmienną łańcucha lekkiego (V L ), przy czym jednostka V H V L ma swoistość poliepitopową (tj. jest zdolna do wiązania do dwóch różnych epitopów na jednej cząsteczce biologicznej lub do każdego epitopu na różnych cząsteczkach biologicznych). Takie wieloswoiste przeciwciała obejmują, nieograniczająco, pełnej długości przeciwciała, przeciwciała mające dwie lub więcej domen V L i V H, fragmenty przeciwciał, takie jak Fab, Fv, dsfv, scfv, diaciała, dwuswoiste diaciała i triciała, fragmenty przeciwciał, które łączono kowalencyjnie lub niekowalencyjnie. Swoistość poliepitopowa dotyczy zdolności do swoistego wiązania do dwóch lub więcej różnych epitopów na tym samym lub różnych obiektach docelowych. Monoswoiste dotyczy zdolności do wiązania się jedynie z jednym epitopem. Według jednej z postaci wykonania wieloswoiste przeciwciało w postaci IgG 1 wiąże się do każdego epitopu z powinowactwem 5 µm do 0,001 µm, 3 µm do 0,001 pm, 1 µm do 0,001 pm, 0,5 µm do 0,001 pm lub 0,1 µm do 0,001 pm. [0022] Podstawowa jednostka 4-łańcuchowego przeciwciała to heterotetrameryczna glikoproteina złożona z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H) (przeciwciało IgM składa się z 5 podstawowych jednostek heterotetramerycznych, wraz z dodatkowym polipeptydem nazywanym łańcuchem J, i w następstwie czego zawiera 10 miejsc wiązania antygenu, podczas gdy wydzielane przeciwciała IgA mogą polimeryzować tworząc poliwalentne zgromadzenia, zawierające 2-5 podstawowych 4-łańcuchowych jednostek, wraz z łańcuchem J). W przypadku IgG, 4- łańcuchowa jednostka ma na ogół około 150,000 daltonów. Każdy łańcuch L jest powiązany z łańcuchem H przez jeden kowalencyjny mostek dwusiarczkowy, podczas gdy dwa łańcuchy H są powiązane ze sobą jednym lub więcej wiązaniami dwusiarczkowymi, zależnie od izotypu łańcucha H. Każdy łańcuch H i L ma również rozmieszczone w regularnych odstępach wewnątrz łańcuchowe mostki dwusiarczkowe. Każdy łańcuch H posiada, na końcu N, domenę zmienną (V H ), a za nią trzy domeny stałe (C H ) dla każdego z łańcuchów α i γ i cztery domeny C H dla izotypów µ i ε. Każdy łańcuch L ma, na końcu N, domenę zmienną (V L ) a za nią domenę stałą (C L ) na swoim drugim końcu. V L jest wyrównany z V H a C L jest wyrównany z pierwszą domeną stałą łańcucha ciężkiego (C H 1). Uważa się, że określone reszty aminokwasowe tworzą płaszczyznę międzyfazową pomiędzy domenami zmiennymi łańcucha ciężkiego i lekkiego. Parowanie ze sobą V H i V L tworzy pojedyncze miejsce wiązania antygenu. Dla zapoznania się ze strukturą i właściwościami różnych klas przeciwciał, patrz, np. Basic and Clinical Immunology, wydanie 8, Daniel P. Stites, Abba I. Terr i Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, strona 71 i Rozdział 6. [0023] Łańcuch L z dowolnego gatunku kręgowców można przypisać do jednego z dwóch wyraźnie odrębnych rodzajów, nazywanych kappa i lambda, na podstawie sekwencji aminokwasowych ich domen stałych. W zależności od sekwencji aminokwasowej domeny stałej ich łańcuchów ciężkich (C H ), immunoglobuliny można przypisać do różnych klas lub

10 - 9 - izotypów. Występuje pięć klas immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, o łańcuchach ciężkich oznaczonych α, δ, γ, ε, i µ, odpowiednio. Klasy γ i α są dalej dzielone na podklasy na podstawie względnie małych różnic w sekwencji i funkcji C H, np. u ludzi ekspresji ulegają poniższe podklasy: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. [0024] Pojęcie zmienny dotyczy faktu, iż niektóre segmenty domen zmiennych różnią się w znacznym stopniu co do sekwencji pomiędzy przeciwciałami. Domena V pośredniczy w wiązaniu antygenu i definiuje swoistość określonego przeciwciała dla jego określonego antygenu. Jednakże, zmienność nie rozkłada się równo pomiędzy 110-aminokwasowym ciągiem domen zmiennych. Zamiast tego, regiony V składają się z względnie niezmiennych ciągów, zwanych regionami zrębowymi (FRs) z aminokwasów, rozdzielanych przez krótsze regiony o skrajnej zmienności, nazywane regionami hiperzmiennymi, z których każdy ma 9-12 aminokwasy długości. Każda z domen zmiennych natywnych łańcuchów ciężkich i lekkich zawiera cztery FRs przyjmujące w dużej mierze konfigurację arkusza β, połączone przez trzy regiony hiperzmienne, które tworzą pętle łączące, i w niektórych przypadkach stanowiące część struktury arkusza β. Regiony hiperzmienne w każdym łańcuch są utrzymywane w bliskim sąsiedztwie przez FRs oraz, z regionami hiperzmiennymi z innego łańcucha, przyczyniają się do utworzenia miejsca wiązania antygenu przeciwciał (patrz Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Domeny stałe nie są bezpośrednio zaangażowane w wiązanie przeciwciała do antygenu, ale prezentują różne czynności efektorowe, takie jak uczestnictwo przeciwciała w zależnej od przeciwciał toksyczności komórkowej (ADCC). [0025] Pojęcie region hiperzmienny według opisu dotyczy reszt aminokwasowych przeciwciała, które odpowiadają za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny zawiera na ogół reszty aminokwasowe z regionu determinującego komplementarność lub CDR (tj. reszty około (L1), (L2) i (L3) w domenie V L i reszty około (H1), (H2) i (H3) w V H (w jednej z postaci wykonania, H1 oznacza reszty około 31-35); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) i/lub te reszty z pętli hiperzmiennej (tj. reszty (L1), (L2) i (L3) w V L i (H1), (H2) i (H3) w V H ; Chothia i Lesk J. Mol. Biol. 196: (1987)). [0026] Pojęcie przeciwciało monoklonalne według opisu dotyczy przeciwciała z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała tworzące populację są zasadniczo podobne i wiążą ten sam epitop, za wyjątkiem możliwych wariantów, które mogą powstać podczas produkcji przeciwciała monoklonalnego, przy czym takie warianty są na ogół obecne w mniejszych ilościach. Takie przeciwciało monoklonalne typowo obejmuje przeciwciało zawierające regiony zmienne, które wiążą się z obiektem docelowym, przy czym przeciwciało otrzymywano w procesie, który obejmuje selekcję przeciwciała spośród wielu przeciwciał. Na przykład, proces selekcji może oznaczać selekcję unikalnego klonu spośród wielu klonów, takich jak tworzące pulę klony hybrydom, klony fagowe lub klony rekombinowanego DNA. Należy rozumieć, że wybrane przeciwciało może być dodatkowo

11 zmienione, na przykład, dla poprawy powinowactwa do obiektu docelowego, w celu humanizowania przeciwciała, dla poprawy jego produkcji w hodowli komórkowej, dla zredukowania jego immunogenności in vivo, dla utworzenia wieloswoistego przeciwciała, itp., przy czym przeciwciało zawierające zmienioną sekwencję regionu zmiennego również oznacza przeciwciało monoklonalne według wynalazku. Poza swoją swoistością, preparaty przeciwciał monoklonalnych są korzystne pod tym względem, że typowo są nie zanieczyszczone przez inne immunoglobuliny. Modyfikator monoklonalne wskazuje na charakter przeciwciała, jako uzyskanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał, i nie należy go interpretować jako wymagającego wytwarzania przeciwciał w którykolwiek określony sposób. Na przykład, monoklonalne przeciwciała do stosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem mogą być otrzymywane różnymi technikami, w tym sposobem hybrydoma (np. Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, wydanie drugie. 1988); Hammerling et al., w: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas , (Elsevier, N.Y., 1981), sposobami rekombinowanego DNA (patrz, np. patent amerykański nr US 4,816,567), technologiami prezentacji fagowej (patrz, np. Clackson et al., Nature, 352: (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): (2004); Lee et al., J.Mol.Biol.340(5): (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101 (34): (2004); i Lee et al. J. Immunol. Methods 284(.1-2): (2004) i technologiami do produkowania ludzkich lub podobnych do ludzkich przeciwciał w zwierzętach, które mają część lub wszystkie z ludzkich loci immunoglobulin lub sekwencji genów kodujących ludzkie immunoglobuliny (patrz, np. WO98/24893, W0/ , WO/ , i WO/ , Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); patenty amerykańskie US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,591,669 (wszystkie dla GenPharm); US 5,545,807; WO 97/17852, patenty amerykańskie US 5,545,807; US 5,545,806; US 5,569,825; US 5,625,126; US 5,633,425; i US 5,661,016, i Marks et al., Bio/Technology, 10: (1992); Lonberg et al., Nature 368: (1994); Morrison, Nature, 368: (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); i Lonberg i Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: (1995). [0027] Nienaruszone przeciwciało oznacza takie, które zawiera miejsce wiązania antygenu jak również C L i co najmniej domeny stałe łańcucha ciężkiego, C H 1, C H 2 i C H 3. Domeny stałe mogą oznaczać natywne sekwencje domen stałych (np. ludzka natywna sekwencja domen stałych) lub wariant ich sekwencji aminokwasowej. Korzystnie, nienaruszone przeciwciało ma jedną lub więcej funkcji efektorowych. [0028] Fragmenty przeciwciał zawierają część nienaruszonego przeciwciała, korzystnie region wiązania antygenu lub region zmienny nienaruszonego przeciwciała. Przykłady fragmentów przeciwciał obejmują fragmenty Fab, Fab', F(ab') 2 i Fv; diaciała; przeciwciała liniowe (patrz patent amerykański nr 5,641,870, Przykład 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): (1995)); cząsteczki przeciwciał pojedynczo-łańcuchowych; i wieloswoiste przeciwciała utworzone z fragmentów przeciwciał. Fraza przeciwciała liniowe na ogół

12 dotyczy przeciwciał opisanych w Zapata et al., Protein Eng., 8(10): (1995). Pokrótce, przeciwciała te zawierają parę tandemowych odcinków Fd (V H -C H 1-V H -C H 1), które, wraz z polipeptydami komplementarnego łańcucha lekkiego tworzą parę regionów wiązania antygenu. Przeciwciała liniowe mogą być dwuswoiste lub monoswoiste. [0029] Trawienie przeciwciał papainą daje dwa identyczne fragmenty wiążące antygen, nazywane fragmentami Fab, i pozostały fragment Fc, którego nazwa odzwierciedla jego zdolność do łatwej krystalizacji. Fragment Fab składa się z całego łańcucha L wraz z domeną regionu zmiennego łańcucha H (V H ), i pierwszej domeny stałej jednego łańcucha ciężkiego (C H 1). Traktowanie przeciwciała pepsyną daje pojedynczy duży fragment F(ab') 2, który odpowiada z grubsza dwóm fragmentom Fab, powiązanym dwusiarczkiem, o dwuwalentnej aktywności wiązania antygenu, nadal zdolny do sieciowania antygenu. Fragmenty Fab różnią się od fragmentów Fab dodaniem kilku reszt na końcu karboksylowym domeny C H 1, w tym jednej lub więcej cystein z regionu zawiasowego przeciwciała. Fab -SH to oznaczenie według opisu dla Fab, w którym reszty cysteiny domen stałych mają wolną grupę tiolową. Fragmenty F(ab ) 2 przeciwciał były oryginalnie produkowane jako pary fragmentów Fab, które miały pomiędzy sobą zawiasowe cysteiny. Znane są także inne połączenia chemiczne fragmentów przeciwciał. [0030] Fragment Fc zawiera części końców karboksylowych obydwu łańcuchów H, utrzymywane razem przez dwusiarczki. Funkcje efektorowe przeciwciał są determinowane przez sekwencje w regionie Fc; region ten jest również częścią rozpoznawaną przez receptory Fc (FcR) znajdywane na niektórych typach komórek. [0031] Fv składa się z dimeru jednej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego i jednej domeny zmiennej łańcucha lekkiego, w ścisłym, niekowalencyjnym połączeniu. Z fałdowania tych dwóch domen wyłania się sześć pętli hiperzmiennych (po 3 pętle z każdego z łańcuchów H i L), które zapewniają reszty aminokwasowe do wiązania antygenu i nadają przeciwciału swoistość wiązania antygenu. Jednakże, nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv, zawierająca jedynie trzy regiony CDR swoiste dla antygenu) ma zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu, chociaż często z niższym powinowactwem, niż pełne miejsce wiązania. [0032] Pojedynczołańcuchowe Fv, skrótowo również nazywane sfv lub scfv to fragmenty przeciwciał, które zawierają domeny przeciwciał V H i V L, w których domeny te są połączone w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Korzystnie, polipeptyd sfv dodatkowo zawiera łącznik polipeptydowy pomiędzy domenami V H i V L, który umożliwia sfv utworzenie pożądanej struktury do wiązania antygenu. W celu zapoznania się z pracą przeglądową na temat sfv, patrz Pluckthun w Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg i Moore eds., Springer-Verlag, New York, str (1994); Borrebaeck [0033] Pojęcie diaciała dotyczy małych fragmentów przeciwciał, otrzymywanych przez łączenie fragmentów sfv (patrz poprzedzający akapit) z krótkimi łącznikami (około 5-10 reszt) pomiędzy domenami V H i V L tak, że osiąga się parowanie między-łańcuchowe, ale nie wewnątrz-łańcuchowe domen V, co prowadzi do uzyskania dwuwalentnego fragmentu, tj.

13 fragmentu mającego dwa miejsca wiązania antygenu. Dwuswoiste diaciała to heterodimery dwóch krzyżowanych fragmentów sfv, w których domeny V H i V L dwóch przeciwciał są obecne na różnych łańcuchach polipeptydowych. Diaciała opisano bardziej szczegółowo w, na przykład, EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: (1993). [0034] Humanizowanymi postaciami różnych od ludzkich (np. mysich) przeciwciał są chimeryczne przeciwciała, które zawierają minimalną sekwencję pochodzącą z przeciwciał różnych od ludzkich. W przeważającej części, humanizowane przeciwciała oznaczają ludzkie immunoglobuliny (przeciwciało biorcy), w których reszty regionu hiperzmiennego biorcy są zastępowane resztami regionu hiperzmiennego z gatunków różnych od ludzkiego (przeciwciało donorowe) takich jak mysz, szczur, królik lub naczelny inny od człowieka, mającymi pożądaną swoistość, powinowactwo i zdatność przeciwciała. W niektórych przypadkach, reszty regionu zrębowego (FR) ludzkiej immunoglobuliny są zastępowane przez odpowiadające różne od ludzkich reszty. Ponadto, humanizowane przeciwciała mogą zawierać reszty, które nie są znajdywane w przeciwciele biorcy lub w przeciwciele donorowym. Modyfikacje te poczyniono, aby dalej udoskonalić wydajność przeciwciała. Na ogół, humanizowane przeciwciało będzie zawierać zasadniczo wszystkie z co najmniej jednej, i typowo dwóch, domen zmiennych, w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie pętle hiperzmienne odpowiadają tym z immunoglobuliny różnej od ludzkiej, i wszystkie lub zasadniczo wszystkie FR są tymi o ludzkiej sekwencji immunoglobuliny. Humanizowane przeciwciało opcjonalnie będzie również zawierać co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), typowo tego z immunoglobuliny ludzkiej. Dla zapoznania się z dalszymi szczegółami, patrz Jones et al., Nature 321: (1986); Reichmann et al., Nature 332: (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: (1992). [0035] Według opisu; zestaw kodonów dotyczy zestawu różnych sekwencji trypletów nukleotydowych, stosowanych do kodowania pożądanych wariantów aminokwasów. Zestaw oligonukleotydów można syntetyzować, na przykład, przez syntezę w fazie stałej, w tym sekwencje, które reprezentują wszystkie możliwe kombinacje trypletów nukleotydowych, zapewniane przez zestaw kodonów i kodujące pożądaną grupę aminokwasów. Standardową postacią oznaczania kodonów jest kod według IUB, który jest znany ze stanu techniki i z opisu. Zestaw kodonów typowo jest reprezentowany przez 3 wielkie litery pisane kursywą, np. NNK, NNS, XYZ, DVK, i podobne (np. kodon NNK dotyczy N = A/T/G/C w pozycjach 1 i 2 w kodonie i K = G/T w stosunku równomolowym w pozycji 3 do kodowania wszystkich 20 naturalnych aminokwasów). Nielosowy zestaw kodonów, według opisu, dotyczy zatem zestawu kodonów, kodującego wybrane aminokwasy, które spełniają częściowo, korzystnie całkowicie, kryteria selekcji aminokwasów według opisu. Synteza oligonukleotydów z degeneracją wybranego nukleotydu w określonych pozycjach jest dobrze znana ze stanu techniki, na przykład podejście TRIM (Knappek et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 1999); Garrard i Henner, Gene 128:103, 1993). Takie zestawy oligonukleotydów mających określone zestawy kodonów można syntetyzować przy użyciu komercyjnych kwasów nukleinowych: syntetyzowanych (dostępne z, na przykład, Applied Biosystems, Foster City, CA), lub można otrzymywać komercyjnie (na przykład, z Life Technologies, Rockville, MD). W następstwie

14 czego, zestaw syntetyzowanych oligonukleotydów o określonym zestawie kodonów będzie typowo obejmować szereg oligonukleotydów o różnych sekwencjach, z różnicami ustanowionymi przez zestaw kodonów w obrębie ogólnej sekwencji. Oligonukleotydy, stosowane według wynalazku, mają sekwencje, które umożliwiają hybrydyzację do matrycy kwasu nukleinowego domeny zmiennej i mogą również, choć niekoniecznie, zawierać miejsca enzymów restrykcyjnych, użyteczne do, na przykład, celów klonowania. [0036] Przeciwciało według wynalazku, które wiąże antygen będący przedmiotem zainteresowania oznacza takie, które wiążą się z antygenem z wystarczającym powinowactwem, tak, że przeciwciało jest użyteczne jako środek diagnostyczny i/lub terapeutyczny w nakierowywaniu na białko lub eksprymowany w tkance lub komórce antygen, i nie reaguje krzyżowo w znacznym stopniu z innymi białkami. W takich przykładach wykonania, stopień wiązania przeciwciała do niedocelowego białka będzie mniejszy niż około 10% wiązania przeciwciała do jego określonego białka docelowego, jak wyznaczono za pomocą analizy aktywowanego przez fluorescencję sortowania komórek (FACS) lub radioimmunoprecypitacji (RIA) lub ELISA. W odniesieniu do wiązania przeciwciała do docelowej cząsteczki, pojęcie swoiste wiązanie lub swoiście wiąże się do lub jest swoisty dla określonego polipeptydu lub epitopu na określonym docelowym polipeptydzie oznacza wiązanie, które jest mierzalnie różne od oddziaływania nieswoistego. Swoiste wiązanie można mierzyć, na przykład, przez wyznaczanie wiązania cząsteczki w porównaniu do wiązania cząsteczki kontrolnej. Na przykład, swoiste wiązanie można określać kompetycyjnie, z cząsteczką kontrolną, która jest podobna do obiektu docelowego, na przykład, nadmiarem niewyznakowanego obiektu docelowego. W tym przypadku, wynik wskazuje na swoiste wiązanie, jeśli wiązanie wyznakowanego obiektu docelowego do sondy jest kompetycyjnie inhibowane przez nadmiar niewyznakowanego obiektu docelowego. Pojęcie swoiste wiązanie lub swoiście wiąże się do lub jest swoisty dla określonego polipeptydu lub epitopu na określonym docelowym polipeptydzie według opisu można prezentować, na przykład, za pomocą cząsteczki o Kd dla obiektu docelowego rzędu co najmniej około 10-4 M, alternatywnie co najmniej około 10-5 M, alternatywnie co najmniej około 10-6 M, alternatywnie co najmniej około 10-7 M, alternatywnie co najmniej około 10-8 M, alternatywnie co najmniej około 10-9 M, alternatywnie co najmniej około M, alternatywnie co najmniej około M, alternatywnie co najmniej około M lub większe. W jednej z postaci wykonania, pojęcie swoiste wiązanie dotyczy wiązania, w którym cząsteczka wiąże się do określonego polipeptydu lub epitopu na określonym polipeptydzie bez zasadniczo wiązania do jakiegokolwiek innego polipeptydu lub epitopu polipeptydowego. [0037] Biologicznie czynny i aktywność biologiczna i charakterystyka biologiczna w odniesieniu do polipeptydu według wynalazku oznacza polipeptyd mający zdolność wiązania się do cząsteczki biologicznej, chyba że wyszczególniono inaczej. [0038] Cząsteczka biologiczna dotyczy kwasu nukleinowego, białka, węglowodanu, lipidu i ich kombinacji. W jednej z postaci wykonania cząsteczka biologiczna występuje w naturze.

15 [0039] Izolowany stosowany do opisywania różnych przeciwciał ujawnianych według opisu, oznacza przeciwciało, które zostało zidentyfikowane i oddzielone i/lub odzyskane z komórki lub hodowli komórkowej, w której zachodziła jego ekspresja. Zanieczyszczającymi składnikami jego naturalnego środowiska są materiały, które typowo zakłócałyby diagnostyczne lub terapeutyczne zastosowania polipeptydu, i mogą obejmować enzymy, hormony i inne białkowe lub niebiałkowe soluty. W korzystnych przykładach wykonania, przeciwciało zostanie oczyszczone (1) w stopniu wystarczającym do otrzymania co najmniej 15 reszt N-końcowej lub wewnętrznej sekwencji aminokwasowej, poprzez użycie sekwenatora białek typu spinning cup lub (2) do homogenności, przy pomocy SDS-PAGE w warunkach redukcyjnych lub nieredukcyjnych, przy użyciu błękitu Coomassie go lub, korzystnie, barwienia srebrem. Izolowane przeciwciało obejmuje przeciwciało in situ w rekombinowanych komórkach, jako że co najmniej jeden składnik naturalnego środowiska polipeptydu nie będzie obecny. Jednakże zazwyczaj izolowany polipeptyd będzie otrzymywany przez co najmniej jeden etap oczyszczania. [0040] Pojęcie sekwencje kontrolne dotyczy sekwencji DNA koniecznych do eksprymowania połączonej funkcjonalnie sekwencji kodującej, w określonym organizmie gospodarza. Sekwencje kontrolne, które są odpowiednie dla organizmów prokariotycznych, na przykład, obejmują promotor, opcjonalnie sekwencję operatora i miejsce wiązania rybosomu. Komórki eukariotyczne są znane z wykorzystywania promotorów, sygnałów poliadenylacji i enhancerów. [0041] Kwas nukleinowy jest połączony funkcjonalnie, kiedy pozostaje w funkcjonalnym związku z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Na przykład, DNA kodujący presekwencję lub lider wydzielniczy jest połączony funkcjonalnie z DNA do polipeptydu, jeśli jest eksprymowany jako prebiałko, które uczestniczy w wydzielaniu polipeptydu; promotor lub enhancer jest połączony funkcjonalnie z sekwencją kodującą, jeśli wpływa na transkrypcję sekwencji; lub miejsce wiązania rybosomu jest połączone funkcjonalnie z sekwencją kodującą, jeśli jest położone w takiej pozycji, żeby ułatwiać translację. Na ogół, połączony funkcjonalnie oznacza, że połączone ze sobą sekwencje DNA sąsiadują ze sobą, a w przypadku lidera wydzielniczego, sąsiadują i są w zgodnej ramce odczytu. Jednakże, enhancery nie muszą być bezpośrednimi sąsiadami w sekwencji. Wiązanie jest dokonywane przez ligację w dogodnych miejscach restrykcyjnych. Jeśli takie miejsca nie istnieją, stosuje się syntetyczne adaptery lub łączniki oligonukleotydowe zgodnie z konwencjonalną praktyką. [0042] Procentową (%) identyczność sekwencji aminokwasowej w odniesieniu do sekwencji polipeptydu zidentyfikowanych według opisu definiuje się jako odsetek reszt aminokwasowych w sekwencji kandydującej, które są identyczne z resztami aminokwasowymi w porównywanym polipeptydzie, po dopasowaniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, o ile jest to konieczne, dla osiągnięcia maksymalnej procentowej identyczności sekwencji, i bez uznawania jakichkolwiek zachowawczych substytucji za część identyczności sekwencji. Dopasowanie do celów określenia procentowej identyczności sekwencji aminokwasowej można osiągać na różne sposoby, które są znane znawcom, przykładowo, przy użyciu publicznie dostępnego oprogramowania komputerowego, takiego

16 jak oprogramowanie BLAST, BLAST-2, ALIGN lub Megalign (DNASTAR). Znawcy mogą wyznaczyć odpowiednie parametry do pomiaru dopasowania, w tym wszelkie algorytmy, konieczne do osiągnięcia maksymalnego dopasowania na całej długości porównywanych sekwencji. Do celów według opisu, jednakże, wartości % identyczności sekwencji aminokwasowej są generowane przy użyciu programu komputerowego do porównywania sekwencji ALIGN-2. Program komputerowy do porównywania sekwencji ALIGN-2 został opracowany przez Genentech, Inc. a kod źródłowy został złożony wraz z dokumentacją użytkownika w Amerykańskim Urzędzie Ochrony Praw Autorskich, Washington D.C., 20559, gdzie został zarejestrowany pod numerem rejestracyjnym TXU Program ALIGN-2 jest publicznie dostępny za pośrednictwem Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornia. Program ALIGN-2 powinien być skompilowany do stosowania na systemie operacyjnym UNIX, korzystnie cyfrowym UNIX V4.0D. Wszystkie parametry porównywania sekwencji są wyznaczane przez program ALIGN-2 i nie podlegają zmianom. [0043] Sekwencje aminokwasowe według opisu są sąsiadującymi sekwencjami aminokwasowymi, o ile nie podano inaczej. [0044] Strukturalnie niepodobne cząsteczki biologiczne według wynalazku dotyczy cząsteczek biologicznych, które nie są w tej samej klasie (białko, kwas nukleinowy, lipid, węglowodany, itp.) lub, na przykład, w odniesieniu do białek, mających mniej niż 60% identyczności aminokwasów, mniej niż 50% identyczności aminokwasów, mniej niż 40% identyczności aminokwasów, mniej niż 30% identyczności aminokwasów, mniej niż 20% identyczności aminokwasów lub mniej niż 10% identyczności aminokwasów w porównaniu do siebie nawzajem. [0045] Rygorystyczność reakcji hybrydyzacji może być łatwo wyznaczona przez znawcę, i na ogół jest to wyliczenie empiryczne, zależne od długości sondy, temperatury odmywania i stężenia soli. Na ogół, dłuższe sondy wymagają wyższych temperatur do właściwej hybrydyzacji, podczas gdy krótsze sondy wymagają niższych temperatur. Hybrydyzacja na ogół zależy od zdolności zdenaturowanego DNA do ponownej hybrydyzacji, gdy komplementarne nici są obecne w środowisku, poniżej swojej temperatury topnienia. Im wyższy stopień pożądanej homologii pomiędzy sondą, a zdolną do hybrydyzacji sekwencją, tym względnie wyższych temperatur można użyć. W wyniku, w konsekwencji wyższe względne temperatury będą czynić warunki reakcji bardziej rygorystycznymi, podczas gdy niższe temperatury w mniejszym stopniu. Dla zapoznania się z dodatkowymi szczegółami i wyjaśnieniem rygorystyczności reakcji hybrydyzacji, patrz Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995). [0046] Warunki rygorystyczne lub warunki wysoce rygorystyczne, jak zdefiniowano według opisu, można zidentyfikować jako te, które: (1) wykorzystują niską siłę jonową i wysoką temperaturę odmywania, na przykład 0,015 M chlorek sodu/0,0015 M cytrynian sodu/0,1% dodecylosiarczan sodu w 50 C; (2) wykorzystują podczas hybrydyzacji środek denaturujący, taki jak formamid, na przykład, 50% (obj./obj.) formamid z 0,1% bydlęcą albuminą surowicy/0,1% Ficoll/0,1% poliwinylopirolidon/50 mm bufor fosforanu sodu w ph 6,5 z 750 mm chlorkiem sodu, 75 mm cytrynian sodu w 42 C; lub (3) hybrydyzację przez

17 noc w roztworze, który wykorzystuje 50% formamid, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M cytrynian sodu), 50 mm fosforan sodu (ph 6.8), 0,1% pirofosforan sodu, 5 x roztwór Denhardta, sonikowano DNA spermy łososia (50 mg/ml), 0,1% SDS, i 10% siarczan dekstranu w 42 C, z 10 minutowym odmywaniem w 42 C w 0,2 x SSC (chlorek sodu/cytrynian sodu) z następczym 10 minutowym wysoce rygorystycznym odmywaniem składającym się z 0,1 x SSC zawierającym EDTA w 55 C. [0047] Warunki umiarkowanie rygorystyczne można zidentyfikować jak opisano w Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, i obejmują one zastosowanie roztworu odmywającego i warunków hybrydyzacji (np. temperatura, siła jonowa i % SDS) mniej rygorystycznych, niż te opisane powyżej. Przykładem umiarkowanie rygorystycznych warunków jest inkubacja przez noc w 37 C w roztworze zawierającym: 20% formamid, 5 x SSC (150 mm NaCl, 15 mm cytrynian trójsodowy), 50 mm fosforan sodu (ph 7,6), 5 x roztwór Denhardta, 10% siarczan dekstranu, 15 i 20 mg/ml denaturowanego sonikowanego DNA ze spermy łososia, z następczym odmywaniem filtrów w 1 x SSC w około C. Znawca rozpozna, jak dostosowywać temperaturę, siłę jonową, itp. na miarę potrzeb, z uwzględnieniem czynników, takich jak długość sondy i podobne. [0048] Funkcje efektorowe przeciwciała dotyczą tych biologicznych aktywności, które przypisuje się regionowi Fc (natywnej sekwencji regionu Fc lub sekwencji aminokwasowej wariantu regionu Fc) przeciwciała, i różnią się zależnie od izotypu przeciwciała. Przykłady funkcji efektorowych przeciwciała obejmują: wiązanie C1q i cytotoksyczność zależną od układu dopełniacza (CDC); wiązanie receptora Fc; zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC); fagocytozę; obniżanie poziomu ekspresji receptorów na powierzchni komórki (np. receptorów limfocytów B); i aktywację limfocytów B. [0049] Zależna od przeciwciał cytotoksyczność komórkowa lub ADCC dotyczy postaci cytotoksyczności, w której wydzielane Ig, związane na receptorach Fc (FcRs), obecnych na niektórych komórkach cytotoksycznych (np. komórkach naturalnych zabójców (NK), neutrofilach i makrofagach) umożliwiają tym cytotoksycznym komórkom efektorowym swoiste wiązanie się do komórki docelowej niosącej antygen i późniejsze zabijanie komórki docelowej cytotoksynami. Przeciwciała uzbrajają komórki cytotoksyczne i są bezwzględnie konieczne do takiego zabijania. Pierwotne komórki pośredniczące w ADCC, komórki NK, eksprymują wyłącznie FcγRIII, podczas gdy monocyty eksprymują FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresję FcR na komórkach krwiotwórczych podsumowano w Tabeli 3 na stronie 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: (1991). W celu dokonania oceny aktywności ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania można wykonać oznaczenie ADCC in vitro, takie jak opisano w patencie amerykańskim US 5,500,362 lub US 5,821,337. Użyteczne komórki efektorowe do takich oznaczeń obejmują komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i komórki naturalnych zabójców (NK). Alternatywnie, lub dodatkowo, aktywność ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania można oceniać in vivo, np. w modelu zwierzęcym, takim jak ten ujawniany w Clynes et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 95: (1998).

18 [0050] Pojęcia receptor Fc i FcR są stosowane do opisu receptora, który wiąże się do regionu Fc przeciwciała. Korzystny FcR oznacza natywną sekwencję ludzkiego FcR. Ponadto, korzystny FcR oznacza taki, który wiąże przeciwciało IgG (receptor gamma) i obejmuje receptory podklas FcγRI, FcγRII i FcγRIII, w tym warianty alleliczne i poddane alternatywnemu splicingowi postaci tych receptorów. Receptory FcγRII obejmują FcγRIIA ( aktywujący receptor ) i FcγRIIB ( inhibujący receptor ), które mają podobne sekwencje aminokwasowe, które różnią się głównie co do swoich domen cytoplazmatycznych. Aktywujący receptor FcγRIIA zawiera motyw aktywujący immunoreceptora tyrozyny (ITAM) w swojej domenie cytoplazmatycznej. Inhibujący receptor FcγRIIB zawiera motyw inhibujący immunoreceptora tyrozyny (ITIM) w swojej domenie cytoplazmatycznej (praca przeglądowa M. w Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15: (1997)). FcRs omówiono w Ravitph i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457: (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); i de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: (1995). Inne FcRs, w tym te do identyfikacji w przyszłości, są objęte pojęciem FcR według opisu. Pojęcie obejmuje również receptor neonatalny, FcRn, który odpowiada za przenoszenie macierzystych IgGs do płodu (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976); i Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). [0051] Ludzkie komórki efektorowe oznaczają leukocyty, które eksprymują jeden lub więcej FcRs i wykonują czynności efektorowe. Korzystnie, komórki eksprymują co najmniej FcγRIII i wykonują czynność efektorową ADCC. Przykłady ludzkich leukocytów, które pośredniczą w ADCC obejmują komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), komórki naturalnych zabójców (NK), monocyty, cytotoksyczne komórki T i neutrofile; przy czym korzystne są komórki PBMC i NK. Komórki efektorowe można izolować z natywnego źródła, np. z krwi. [0052] Cytotoksyczność zależna od układu dopełniacza lub CDC dotyczy lizy komórki docelowej w obecności układu dopełniacza. Szlak aktywacji klasycznego układu dopełniacza jest inicjowany przez wiązanie pierwszego składnika układu dopełniacza (C1q) do przeciwciała (odpowiedniej podklasy) związanego z odpowiednim antygenem. W celu przeprowadzenia oceny aktywacji układu dopełniacza, można wykonać oznaczenie CDC, np. jak opisano w Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). [0053] Pojęcie ilość skuteczna terapeutycznie dotyczy ilości przeciwciała lub fragmentu przeciwciała do leczenia choroby lub zaburzenia u danego osobnika. W przypadku nowotworu (np. rakowego guza), ilość skuteczna terapeutycznie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała (np. wieloswoistego przeciwciała lub fragmentu przeciwciała dla HER2 i VEGF lub HER2 i DR5) może redukować liczbę komórek rakowych; redukować rozmiar pierwotnego nowotworu; inhibować (tj. spowalniać do pewnego stopnia i korzystnie zatrzymywać) infiltrację komórek raka do narządów obwodowych; inhibować (tj. spowalniać do pewnego stopnia i korzystnie zatrzymywać) przerzuty nowotworu; inhibować, do pewnego stopnia, wzrost nowotworu; i/lub łagodzić do pewnego stopnia jeden lub więcej objawów powiązanych z zaburzeniem. Co do stopnia, w jakim przeciwciało lub fragment przeciwciała może zapobiegać wzrostowi i/lub zabijać istniejące komórki rakowe, może ono być cytostatyczne i/lub cytotoksyczne. Co do terapii raka, skuteczność in vivo można, na

19 przykład, mierzyć przez szacowanie czasu przeżycia, czasu do progresji choroby(ttp), szybkości odpowiedzi (RR), czasu trwania odpowiedzi i/lub jakości życia. [0054] Przez redukować lub inhibować rozumie się zdolność do wywoływania ogólnego spadku, korzystnie o 20% lub więcej, korzystniej o 50% lub więcej, i najkorzystniej o 75%, 85%, 90%, 95% lub więcej. Redukowanie lub inhibowanie mogą dotyczyć objawów leczonego zaburzenia, obecności lub rozmiaru przerzutów, rozmiaru pierwotnego nowotworu, lub rozmiaru lub liczby naczyń krwionośnych w zaburzeniach angiogenicznych. [0055] Pojęcia rak i rakowy dotyczą lub opisują stan fizjologiczny u ssaków, który jest typowo charakteryzowany przez niekontrolowany wzrost komórek. W definicji tej ujęto łagodne i złośliwe nowotwory. Przez wczesne stadium raka rozumie się raka, który nie jest inwazyjny lub przerzutowy lub jest sklasyfikowany jako rak w stadium 0, I lub II. [0056] Pojęcie przedrakowy dotyczy stanu lub wzrostu, który typowo poprzedza lub rozwija się w raka. [0057] Przez nie-przerzutowy rozumie się raka, który jest łagodny lub który pozostaje w pierwotnym miejscu i nie penetruje do systemu naczyń limfatycznych lub krwionośnych, ani do tkanek innych niż pierwotne miejsce. Na ogół, nie-przerzutowy rak oznacza dowolnego raka, który jest w stadium 0, I, lub II i okazjonalnie w stadium III raka. [0058] Choroba autoimmunologiczna według opisu to choroba lub zaburzenie powstałe z i skierowane przeciwko własnym tkankom danego osobnika lub ich ko-segregacja lub manifestacja lub powstały w wyniku tego stan. Przykłady autoimmunologicznych chorób lub zaburzeń obejmują, nieograniczająco zapalenie stawów (reumatoidalne zapalenie stawów, takie jak ostre zapalenie stawów, przewlekłe reumatoidalne zapalenie stawów, dnawe zapalenie stawów, ostre dnawe zapalenie stawów, przewlekłe zapalne zapalenie stawów, zwyrodnieniowe zapalenie stawów, infekcyjne zapalenie stawów, zapalenie stawów w chorobie z Lyme, reumatoidalne zapalenie stawów, artropatia łuszczycowa, zapalenie stawów kręgosłupa, i młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, postępujące przewlekłe zapalenie stawów, zniekształcające zapalenie stawów, gościec pierwotnie przewlekły zniekształcający, reaktywne zapalenie stawów, i zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa), zapalne hiperproliferacyjne choroby skóry, łuszczyca, taka jak łuszczyca plackowata, łuszczyca kropelkowata, łuszczyca krostkowa, i łuszczyca paznokci, zapalenie skóry, w tym kontaktowe zapalenie skóry, przewlekłe kontaktowe zapalenie skóry, alergiczne zapalenie skóry, alergiczne kontaktowe zapalenie skóry, zapalenie skóry opryszczkowate, i atopowe zapalenie skóry, zespół IgM sprzężony z chromosomem X, pokrzywka, taka jak przewlekła alergiczna pokrzywka i przewlekła idiopatyczna pokrzywka, w tym przewlekła autoimmunologiczna pokrzywka, zapalenie wielomięśniowe/zapalenie skórno-mięśniowe, młodzieńcze zapalenie skórno-mięśniowe, toksyczna nekroliza naskórka, twardzina (w tym twardzina układowa), twardzina, taka jak twardzina układowa, stwardnienie rozsiane (MS) takie jak MS kręgosłupowo-oczne, pierwotnie postępujące MS (PPMS) i zaostrzająco zwalniające MS (RRMS), postępująca twardzina układowa, miażdżyca tętnic, stwardnienie tętnic, stwardnienie rozsiane, i postać ataktyczna stwardnienia, nieswoiste

20 zapalenie jelit (IBD) (na przykład, choroba Crohna, choroby układu pokarmowego na podłożu autoimmunologicznym, zapalenie okrężnicy, takie jak zapalenie okrężnicy wrzodziejące, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, mikroskopowe zapalenie jelita grubego, kolagenowe zapalenie jelita grubego, zapalenie okrężnicy polipowe, martwicze zapalenie jelit, i przezścienne zapalenie okrężnicy, i autoimmunologiczne nieswoiste zapalenie jelit), ropne zgorzelinowe zapalenie skóry, rumień guzowaty, pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych, zapalenie blaszki nadtwardówkowej), zespół zaburzeń oddychania, w tym dorosłych lub zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), zapalenie opon mózgowych, stan zapalny całej lub części jagodówki, zapalenie tęczówki, zapalenie naczyniówki, autoimmunologiczne zaburzenie hematologiczne, reumatoidalne zapalenie kręgosłupa, nagła utrata słuchu, choroby regulowane przez IgE, takie jak anafilaksja i alergiczny i atopowy nieżyt nosa, zapalenie mózgu, takie jak zapalenie mózgu Rasmussena i zapalenie układu limbicznego i/lub zapalenie pnia mózgu, zapalenie jagodówki, takie jak zapalenie przedniej jagodówki, ostre zapalenie przedniej jagodówki, ziarniniakowate zapalenie jagodówki, nieziarniniakowate zapalenie jagodówki, fakoantygenowe zapalenie jagodówki, zapalenie tylnej jagodówki, lub autoimmunologiczne zapalenie jagodówki, zapalenie kłębuszków nerkowych (GN) z oraz bez zespołu nerczycowego takie jak przewlekłe lub ostre zapalenie kłębuszków nerkowych, taki jak pierwotne GN, o podłożu immunologicznym GN, błoniaste GN (nefropatia błoniasta), idiopatyczne błoniaste GN lub idiopatyczna nefropatia błoniasta, błoniasto- lub błoniaste rozrostowe GN (MPGN), w tym typu I i typu II, i gwałtownie postępujące GN, stany alergiczne, reakcja alergiczna, egzema, w tym alergiczna lub atopowa egzema, astma, taka jak dychawica oskrzelowa, astma oskrzelowa, i astma autoimmunologiczna, stany przebiegające z infiltracją limfocytów T i przewlekłe odpowiedzi zapalne, przewlekła zapalna choroba płuc, autoimmunologiczne zapalenie mięśnia sercowego, niedobór leukocytarnych cząstek adhezyjnych, toczeń rumieniowaty układowy (SLE) lub liszaj rumieniowaty układowy, taki jak skórny SLE, podostry skórny toczeń rumieniowaty, toczeń neonatalny (NLE), toczeń układowy trzewny, toczeń (w tym zapalenie nerek, zapalenie mózgu, dziecięcy, nienerkowy, pozanerkowy, krążkowy, łysienie), cukrzyca młodzieńcza (typu I), w tym dziecięca cukrzyca insulinozależna (IDDM), cukrzyca dorosłych (cukrzyca typu II), autoimmunologiczna cukrzyca, idiopatyczna moczówka prosta, odpowiedzi immunologiczne powiązane z ostrą i opóźnioną nadwrażliwością regulowaną przez cytokiny i limfocyty T, gruźlica, sarkoidoza, ziarniniakowatość, w tym ziarniniakowatość limfoidalna, ziarniniakowatość Wegenera, agranulocytoza, zapalenia naczyń, w tym zapalenie naczyń (w tym zapalenie dużych naczyń (w tym polimialgia reumatyczna i olbrzymiokomórkowe zapalenie tętnic (choroba Takayasu)), zapalenie średnich naczyń (w tym choroba Kawasaki i guzkowate zapalenie tętnic), mikroskopowe zapalenie naczyń, zapalenie naczyń OUN, martwicze, skórne, lub związane z nadwrażliwością zapalenie naczyń, układowe martwicze zapalenie naczyń, i związane z ANCA zapalenie naczyń, takie jak zapalenie naczyń Churga-Straussa lub zespół (CSS)), zapalenie tętnic skroniowych, niedokrwistość aplastyczna, autoimmunologiczna niedokrwistość aplastyczna, niedokrwistość z dodatnim odczynem Coombsa, wrodzona niedokrwistość hipoplastyczna, niedokrwistość hemolityczna lub immunologiczna niedokrwistość hemolityczna, w tym