(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP00/03259 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP00/03259 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO00/65060 PCT Gazette nr 44/00 (51) Int.Cl. C12N 15/29 ( ) C07K 14/415 ( ) A61K 39/36 ( ) (54) Sekwencja DNA oraz sposób rekombinacyjnego otrzymywania alergenów graminae (30) Pierwszeństwo: ,DE, (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 12/04 (73) Uprawniony z patentu: MERCK PATENT GMBH,Darmstadt,DE (72) Twórca(y) wynalazku: Roland Suck,Hamburg,DE Helmut Fiebig,Schwarzenbek,DE Oliver Cromwell,Wentorf,DE Arnd Petersen,Bad Segeberg,DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 05/09 (74) Pełnomocnik: Szymon Łukaszyk, Kancelaria Patentowa Łukaszyk PL B1 (57) 1. Rekombinowana molekuła DNA, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową alergenu Phl p 13 z Phleum pratense jak przedstawiono na rysunku fig. 1 (SEQ ID No. 1) i koduje alergen Phl p 13 z Phleum pratense. 2. Molekuła DNA, znamienna tym, że ma sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej alergenu Phl p 13 z Phleum pratense zdefiniowanej w zastrz Rekombinowany wektor ekspresyjny DNA lub system klonowania zawierający rekombinowaną molekułę DNA, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową alergenu Phl p 13 z Phleum pratense przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID No. 1) i zdefiniowaną w zastrz. 1, funkcjonalnie połączoną z kontrolną sekwencją ekspresyjną.

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest identyfikacja oraz charakterystyka alergenów pyłków traw jak również kodujących ich rekombinantów DNA. Jako naturalnego surowca używa się pyłków Phleum pratense. Wynalazek obejmuje także fragmenty i części sekwencji oraz mutacje. Rekombinanty DNA oraz wywodzące się z nich polipeptydy, ich fragmenty oraz warianty mogą być stosowane w terapii chorób, których przyczyną jest uczulenie na pyłki kwiatowe. Rekombinacyjnie otrzymywane białka oraz ich fragmenty mogą być ponadto stosowane w diagnostyce alergii na pyłki kwiatowe. Alergie typu 1 stanowią istotny problem o skali światowej. Do 20% ludności krajów uprzemysłowionych cierpi na dolegliwości związane z alergicznym katarem, zapaleniem spojówek lub astmą oskrzelową. Alergie te wywoływane są przez alergeny znajdujące się w powietrzu (aeoroalergeny), które uwalniane są z różnych źródeł takich jak pyłki roślinne, roztocza, koty lub psy. W przypadku pyłków traw do 40% alergików typu 1 wykazuje specyficzną reaktywność względem immunoglobuliny lge (Freidhoff et al., 1986, J Allergy Clin Immunol 78, ). W przypadku substancji wyzwalających alergie typu 1 chodzi o białka, glikoproteiny lub polipeptydy. Alergeny te po wniknięciu do organizmu przez błony śluzowe u osób uczulonych reagują na powierzchni komórek tucznych ze związanymi molekułami immunoglobuliny IgE. W wypadku kiedy alergen doprowadzi do utworzenia połączenia między dwoma molekułami IgE, komórki efektorowe uwalniają mediatory (np. histaminę lub prostaglandyny) oraz cytokiny, doprowadzając do powstawania symptomów klinicznych. W zależności od względnej częstości występowania poszczególnych grup alergików, czego dowodzą przeciwciała IgE względem określonych alergenów, zalicza się je do alergenów głównych (majorallergen) lub alergenów rzadkich (minorallergen). W wypadku traw tymotki (Phleum pratense) jako główne alergeny scharakteryzowano dotychczas Phl p 1 (Peterson et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92, ), Phl p 5 (Matthiesen und Löwenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21, , Petersen et al., 1992), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54) oraz Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3), ), a jako alergeny rzadkie-phl p 4 (Löwenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1-62) jak również grupa 10 i 11 z Lolium perenne (Ansari et al., 1987, J. Allergy Clin Immunol. 80, ). W związku z omawianym wynalazkiem szczególne znaczenie ma alergen Phl p 4, ponieważ posiada on podobną masę cząsteczkową ok. 55 kda (Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin Immunol. 98(1), ) jak nowy alergen i ze względu na to jest najbardziej zbliżony do nowego alergenu otrzymanego według wynalazku, przy czym jednak biochemicznie i immunologicznie wyraźnie różnią się one od siebie. W przeciwieństwie do innych alergenów w/w Phi p 4 jest jedynym, którego genomiczna i traskrypcyjna sekwencja (c-dna) nie została dotąd zidentyfikowana. Dane dotyczące sekwencji przedstawione zostały między innymi dla Phl p 1 (Laffer et al., 1994, J. Allergy Clin Immunol. 94, ; Petersen et al., 1995, J. Allergy Clin Immunol. 95(5), ), Phl p 5 (Vrtala et al., 1993, J. Immunol. 151(9), ), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108(1), 55-59) oraz Phl p 2 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335(3), ). Za pomocą sekwencji c-dna możliwe jest otrzymanie rekombinowanych alergenów, które mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce i terapii (Scheiner i Kraft, 1995, Allergy 50, ). Klasycznym punktem wyjściowym aktywnego leczenia alergii jest specyficzna immunoterapia lub odczulanie (Fiebig, 1995, Allergo J. 4(6), , Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin Immunol. 102(4), ). W takim wypadku pacjentom podaje się rosnące dawki podskórnych iniekcji naturalnych ekstraktów alergenów. Jednakże w metodzie takiej występuje zagrożenie reakcji alergicznych lub nawet szoku anafilaktycznego. W celu zminimalizowania tego ryzyka stosuje się nowe preparaty alergoidów. Chodzi w tym wypadku o chemicznie modyfikowane ekstrakty alergenów, które w porównaniu do niemodyfikowanych ekstraktów wykazują oczywiście obniżoną reaktywność względem IgE, przy czym posiadają identyczną reaktywność względem komórek T (Fiebig, 1995, Allergo J. 4(7), ). Dalsza optymalizacja terapii możliwa jest z zastosowaniem alergenów otrzymywanych technikami rekombinacyjnymi. Określone koktajle z wysoko oczyszczonych rekombinowanych alergenów ustalone dla indywidualnych pacjentów zastąpić mogą ekstrakty z naturalnych źródeł alergenów, ponieważ zawierają one poza różnymi alergenami dużą liczbę towarzyszących immunogenicznych lecz nie alergenicznych białek. Realne perspektywy niezawodnego odczulania produktami ekspresji dają poddane mutacji rekombinowane alergeny o ściśle określonym celu działania, w których epitopy IgE

3 PL B1 3 poddaje się specyficznej delecji bez naruszania, posiadającego podstawowe znaczenie dla terapii, epitopu komórki T (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162, ). Inną możliwością terapeutycznego oddziaływania na zakłóconą równowagę komórki Th u alergików jest leczenie DNA, które wykazuje zdolność ekspresji, kodując przy tym odpowiednie alergeny. Pierwsze eksperymentalne dowody alergospecyficznego wpływu na odpowiedź immunologiczną otrzymano u gryzoni przez podanie iniekcji DNA kodującego alergen (Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2(5), ). Wynalazek może być korzystnie stosowany w diagnostyce chorób alergicznych in vitro oraz in vivo, a w szczególności kataru siennego. W tym celu klonowane kwasy nukleinowe umieszcza się w wektorze ekspresji (ligacja), a konstrukt taki poddaje się ekspresji w odpowiednim typie komórki. Po oczyszczeniu biochemicznym rekombinowany alergen używany może być do wykrywania przeciwciał IgE. Z drugiej strony podstawowe zastosowania według wynalazku w postaci rekombinowanych preparatów zawierających alergeny lub kwasy nukleinowe mogą być stosowane w specyficznej immunoterapii. W omawianym aspekcie występuje wiele różnych możliwości. Z jednej strony część białka stanowić może niezmieniona pierwszorzędowa struktura białka. Z drugiej zaś strony w celu uniknięcia działań ubocznych w terapii stosowane mogą być hipoalergiczne (alergoidalne) formy według wynalazku, otrzymane przez specyficzną delecję w epitopach IgE całej cząsteczki lub konstrukcję pojedynczych fragmentów, które kodują epitopy komórki T. W końcu stosując kwasy nukleinowe jako takie, w wypadku kiedy umieszczane są one poprzez ligację w eukariotycznym wektorze ekspresji, otrzymuje się preparaty, których bezpośrednie zastosowanie zmienia w sensie terapeutycznym alergiczny stan immunologiczny. Przedmiotem wynalazku jest rekombinowana molekuła DNA, która składa się z sekwencji kwasu nukleinowego przedstawionej na rysunku fig. 1 i koduje alergen. Jako naturalny surowiec służą ziarna pyłków graminae, jak np. Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus i inne. Po oczyszczeniu i wyizolowaniu naturalnych alergenów przeprowadza się N-terminalne sekwencjonowanie białka. W oparciu o wydedukowaną na tej podstawie sekwencję kwasu nukleinowego konstruuje się primer. Za pomocą tego primeru z populacji c-dna techniką PCR otrzymuje się odpowiednie c-dna, klonuje się je oraz charakteryzuje. Według wynalazku fragmenty i częściowe sekwencje otrzymuje się z molekuły DNA kodującej ten alergen. Po ekspresji rekombinowanej molekuły DNA względnie fragmentu i częściowej sekwencji za pomocą odpowiedniego wektora ekspresji w systemie komórkowym oczyszcza się alergen względnie warianty hipoalergiczne względnie fragmenty. Oczyszczanie naturalnych alergenów z pyłków traw tymotki przeprowadza się w procesie dwuetapowym. Ekstrakt otrzymany po wodnej ekstrakcji pyłku rozdziela się za pomocą chromatografii z oddziaływaniami hydrofobowymi na dwie frakcje; frakcję przesączu oraz eluat. Przesącz zawiera trzy alergeny, Phl p1 (30-35 kda), Phl p 2/3 (11-14 kda) oraz nieznany alergen (55-60 kda). Białka te rozdziela się od siebie techniką chromatograficzną przez filtrację żelową, stosując wypełnienie Superdex 75. Wymieniony nowy alergen Phl p 13 (roboczo oznaczony p55) wydziela się za pomocą SDS- PAGE, nanosi się na błonę z difluorku poliwinylu (PVDF) oraz izoluje się w postaci ściśle zdefiniowanej frakcji. Następnie molekułę poddaje się N-terminalnemu sekwencjonowaniu aminokwasów metodą degradacji Edmana (rysunek fig. 2). W celu otrzymania i klonowania c-dna odpowiadającego p55 według wynalazku w oparciu o sekwencję N-terminalną (rysunek fig. 3) konstruuje się specyficzny primer DNA (21 członowy mer). Jako drugi primer używa się sekwencji kotwiczącej, która zlokalizowana jest w primerze oligo-dt używanym do odwrotnej transkrypcji. Stosując c-dna, które otrzymuje się z reprezentatywnej populacji m-rna z pyłków Phleum pratense oraz primerów według wynalazku oraz primerów kotwiczących przeprowadza się reakcję PCR w ściśle kontrolowanych warunkach. Amplifikat otrzymany w reakcji PCR poddany analizie w analitycznym urządzeniu do elektroforezy żelowej wykazuje rozmiar 1,65 kb. Amplifikat ten umieszcza się (przez ligację) w wektorze pcr2.1 oraz poddaje się transformacji. Sekwencjonowanie insercji przez dwa różne klony dają identyczne wyniki sekwencji. W wymienionym pierwszorzędowym amplifikacie zidentyfikowano ramkę odczytu (ORF) o rozmiarze 1492 bp (por. rysunek fig. 1). W celu otrzymania z wymienionego kwasu nukleinowego odpowiedniego rekombinowanego białka (rysunek fig. 4) przeprowadza się następnie klonowanie wektora pcr2.1 za pomocą enzymów restrykcyjnych do wektora ekspresji pproex Htb. Po ekspresji oraz oczyszczaniu biochemicznym produktów ekspresji przeprowadza się wiele analiz otrzymanych białek pod kątem ich właściwości alergo-

4 4 PL B1 logicznych. Przeprowadzone analizy np. Western Blot i Dot blot wykazały, że rekombinowane białka reagują specyficznie z IgE pacjentów, u których stwierdzono kliniczne symptomy alergii na pyłki traw. Jako kontrolę stosuje się naturalne p55. Tak więc bez wątpienia w przypadku rekombinowanego białka chodzi o alergen. Ten produkt ekspresji stosowany może być w ulepszonej wysoce specyficznej diagnostyce alergii pyłków traw. Ściśle zdefiniowane fragmenty oraz kombinacje częściowych sekwencji opracowano według wynalazku wychodząc z kwasów nukleinowych klonowanych w wektorach ekspresji. Celem było otrzymanie hipoalergicznych wariantów do ulepszonych zastosowań terapeutycznych. Ponadto wprowadzano selektywne względem miejsca punktowe mutacje, przeważnie w tryplecie kodującym cysteinę. Preparaty według tej części wynalazku wyróżniają się więc względem części wynalazku, która dotyczy celów diagnostycznych, obniżoną reaktywnością względem IgE lub też całkowitym brakiem takiej reaktywności. Tak więc opracowano preparaty do odczulania, w których w oczywisty sposób obserwuje się niższe efekty uboczne, lub też efektów takich w ogóle nie obserwuje się. W wypadku kiedy hipoalergiczne warianty białek kodujących kwasy nukleinowe lub niemodyfikowane kwasy nukleinowe, które kodują p55, podda się ligacji z ludzkim wektorem ekspresji, otrzymane konstrukty mogą również być stosowane jako preparaty do specyficznej immunoterapii. Istotą wynalazku jest: a) Rekombinowana molekuła DNA, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową alergenu Phl p 13 z Phleum pratense jak przedstawiono na rysunku fig. 1 (SEQ ID No. 1) i koduje alergen Phl p 13 z Phleum pratense; b) Molekuła DNA, charakteryzująca się tym, że ma sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej alergenu Phl p 13 z Phleum pratense zdefiniowaną powyżej; c) Rekombinowany wektor ekspresyjny DNA lub system klonowania zawierający rekombinowaną molekułę DNA, charakteryzujący się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową alergenu Phl p 13 z Phleum pratense przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID No. 1), funkcjonalnie połączoną z kontrolną sekwencją ekspresyjną; d) Naturalny alergen Phl p 13 z Phleum pratense, charakteryzujący się tym, że jest kodowany przez kwas nukleinowy zdefiniowany w punkcie a); e) Rekombinowany alergen Phl p 13 z Phleum pratense, charakteryzujący się tym, że jest kodowany przez kwas nukleinowy zdefiniowany w punkcie a); f) Sposób otrzymywania rekombinowanego alergenu Phl p 13 z Phleum pratense, charakteryzujący się tym, że hoduje się komórki prokariotyczne lub eukariotyczne, które poddano transformacji z wykorzystaniem wektora ekspresyjnego zdefiniowanego w punkcie c), a rekombinowany alergen Phl p 13 wyodrębnia się z kultury komórek; g) Sposób diagnozy alergii na pyłki kwiatowe in vitro, charakteryzujący się tym, że obejmuje zastosowanie naturalnego bądź rekombinowanego alergenu Phl p 13 z Phleum pratense zdefiniowanego w punkcie d) lub e); h) Preparat farmaceutyczny, charakteryzujący się tym, że zawiera naturalny bądź rekombinowany alergen Phl p 13 z Phleum pratense, do terapii alergii na pyłek u ludzi lub zwierząt zdefiniowanego w punkcie d) lub e); i) Zastosowanie rekombinowanego wektora ekspresyjnego DNA lub systemu klonowania zdefiniowanego w punkcie c) do wytwarzania leku do przeprowadzania szczepienia DNA w terapii alergii na pyłek u ludzi lub zwierząt. Wynalazek odnosi się więc do ulepszenia diagnostyki in vitro w ramach identyfikacji (wraz z wyjaśnieniem komponentów alergenowych) widma uczuleniowego specyficznego dla pacjenta. Ponadto wynalazek odnosi się do otrzymywania zdecydowanie ulepszonych preparatów do specyficznej immunoterapii alergii na pyłki traw.

5 PL B1 5

6 6 PL B1

7 PL B1 7

8 8 PL B1

9 PL B1 9

10 10 PL B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Rekombinowana molekuła DNA, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową alergenu Phl p 13 z Phleum pratense jak przedstawiono na rysunku fig. 1 (SEQ ID No. 1) i koduje alergen Phl p 13 z Phleum pratense. 2. Molekuła DNA, znamienna tym, że ma sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej alergenu Phl p 13 z Phleum pratense zdefiniowanej w zastrz Rekombinowany wektor ekspresyjny DNA lub system klonowania zawierający rekombinowaną molekułę DNA, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową alergenu Phl p 13 z Phleum pratense przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID No. 1) i zdefiniowaną w zastrz. 1, funkcjonalnie połączoną z kontrolną sekwencją ekspresyjną. 4. Naturalny alergen Phl p 13 z Phleum pratense, znamienny tym, że jest kodowany przez kwas nukleinowy zdefiniowany w zastrz Rekombinowany alergen Phl p 13 z Phleum pratense, znamienny tym, że jest kodowany przez kwas nukleinowy zdefiniowany w zastrz Sposób otrzymywania rekombinowanego alergenu Phl p 13 z Phleum pratense, zdefiniowanego w zastrzeżeniu 5, znamienny tym, że hoduje się komórki prokariotyczne lub eukariotyczne, które poddano transformacji z wykorzystaniem wektora ekspresyjnego zdefiniowanego w zastrz. 3, a rekombinowany alergen Phl p 13 wyodrębnia się z kultury komórek. 7. Sposób diagnozy alergii na pyłki kwiatowe in vitro, znamienny tym, że obejmuje zastosowanie naturalnego bądź rekombinowanego alergenu Phl p 13 z Phleum pratense zdefiniowanego w zastrz. 4 lub Preparat farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera naturalny bądź rekombinowany alergen Phl p 13 z Phleum pratense zdefiniowany w zastrz. 4 lub 5, do terapii alergii na pyłek u ludzi lub zwierząt. 9. Zastosowanie rekombinowanego wektora ekspresyjnego DNA lub systemu klonowania zdefiniowanego w zastrz. 3 do wytwarzania leku do przeprowadzania szczepienia DNA w terapii alergii na pyłek u ludzi lub zwierząt. Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,00 zł.