Metody Kinetyki Biomolekularnej in vitro i in vivo

Metody Kinetyki Biomolekularnej in vitro i in vivo ósma seria zadań 9 listopada 016 Zadanie 1. Wiązanie tlenu przez hemoglobinę - model tertameryczny. Stosując opis stanu wiązania tlenu przez hemoglobinę wykorzystywany w poprzednich zadaniach, rozważ wiązanie tlenu gdy a) miejsca wiążące nie oddziałują ze sobą; b) wprowadzając energię oddziaływania związanych cząsteczek tlenu (modelpaulinga); c) dodając energię oddziaływania trzech i czterech cząsteczek tlenu (model Adaira). Rozwiązanie: Rysunek 1 przedstawia modele proponowane do rozważenia w tym zadaniu. Rysunek 1: Modele wiązania tlenu przez hemoglobine, które można wykorzystać do zbadania roli kooperatywności w procesie wiązania. Wprowadźmy σ 1, σ, σ 3 i σ 4 jako parametry stanu naszego układu. Gdy miejsce i jest obsadzone przez cząsteczkę tlenu to σ i = 1, w przeciwnym przypadku σ i = 0. W każdym modelu mamy pięć rozróżnialnych stanów makroskopowych hemoglobiny, zdefiniowanych przez liczbę związanych cząsteczek tlenu. Po jednym stanie mikroskopowym, w którym wszystkie miejsca albo są puste, abo są obsadzone. Cztery stany mikroskopowe dla stanu makroskopowego polegającego na związaniu jednej cząsteczki tlenu. Cztery stany mikroskopowe dla stanu makroskopowego polegającego na związaniu trzech cząsteczek tlenu. Sześć stanów mikroskopowych dla stanu makroskopowego polegającego na związaniu dwóch cząsteczek tlenu. Określimy energie tych mikrostanów, dla różnych modeli wiązania tlenu przez hemoglobinę. Zerem na skali energii będzie hemoglobina z pustymi miejscami wiążącymi. 1

W modelu wiązania przez niezależne miejsca, mamy następujące wkłady do sumy stanów (numerowanie stanów liczbą związanych tlenów): 0 1 1 4e β(ɛ µ) 6e β(ɛ µ) 3 4e 3β(ɛ µ) 4 e 4β(ɛ µ) Energia danego stanu Suma stanów Z = Ponieważ wyrazy są niezależne, to Z = 4 E = ɛ σ α α=1 1 1 1 1 e β(ɛ µ) 4 α=1 σα σ 1 =0 σ =0 σ 3 =0 σ 4 =0 1 1 1 1 e β(ɛ µ)σ 1 e β(ɛ µ)σ e β(ɛ µ)σ 3 e β(ɛ µ)σ 4 σ 1 =0 σ =0 σ 3 =0 σ 4 =0 Każda z sum daje więc 1 + e β(ɛ µ) Z = ( 1 + e β(ɛ µ)) 4 Średnie obsadzenie cząsteczki hemoglobiny przez tlen policzymy z pochodnej Stąd mamy N = 1 β ln Z µ N bound = 4e β(ɛ µ) 1 + e β(ɛ µ) Możemy zapisać ten wynik w funkcji stężenia tlenu wykorzystując wzór µ = µ o + kt ln(c/c o ), co daje N bound = 4 c c o e β(ɛ µo ) 1 + c c o e β(ɛ µo ) Wynik ten to cztery razy średnie obsadzenie białka z jednym miejscem wiążącym. W modelu wiązania zaproponowanego przez Paulinga, mamy następujące wkłady do sumy stanów (numerowanie stanów liczbą związanych tlenów): 0 1

1 4e β(ɛ µ) 6e β(ɛ µ) βj 3 4e 3β(ɛ µ) 3βJ 4 e 4β(ɛ µ) 6βJ gdzie J jest energią oddziaływania pary związanych tlenów. Energia danego stanu 4 E = ɛ σ α + J α=1 σ α σ γ α,γ gdzie sumowanie po α i γ w drugiej sumie przebiega od 1 do 4, oznacza wyłączenie takich samych indeksów, a J jest podzielone przez, bo pojawiają się wyrazy takie jak σ 1 σ i σ σ 1. Suma stanów 1 1 1 1 Z = e β(ɛ µ) 4 α=1 σα β(j/) α,γ σασγ W postaci analitycznej σ 1 =0 σ =0 σ 3 =0 σ 4 =0 Z = 1 + 4e β(ɛ µ) + 6e β(ɛ µ) βj + 4e 3β(ɛ µ) 3βJ + e 4β(ɛ µ) 6βJ Średnie obsadzenie cząsteczki hemoglobiny przez tlen policzymy z pochodnej Stąd mamy N = 1 β ln Z µ N bound = 4e β(ɛ µ) + 1e β(ɛ µ) βj + 1e 3β(ɛ µ) 3βJ + 4e 4β(ɛ µ) 6βJ 1 + 4e β(ɛ µ) + 6e β(ɛ µ) βj + 4e 3β(ɛ µ) 3βJ + e 4β(ɛ µ) 6βJ Możemy zapisać ten wynik w funkcji stężenia tlenu wykorzystując wzór µ = µ o + kt ln(c/c o ). Aby uprościc zapis wprowadzimy oznaczenia: j = e βj i x = (c/c o )e β(ɛ µo) co daje N bound = 4x + 1x j + 1x 3 j 3 + 4x 4 j 6 1 + 4x + 6x j + 4x 3 j 3 + x 4 j 6 Wynik ten sprowadza się do poprzedniego gdy J = 0 czyli j = 1. W modelu wiązania zaproponowanego przez Adaira, mamy następujące wkłady do sumy stanów (numerowanie stanów liczbą związanych tlenów): 0 1 1 4e β(ɛ µ) 6e β(ɛ µ) βj 3 4e 3β(ɛ µ) 3βJ βk 4 e 4β(ɛ µ) 6βJ 4βK βl 3

gdzie J jest energią oddziaływania pary związanych tlenów, K energią oddziaływania trzech tlenów, a L energią oddziaływania czterech tlenów. Energia danego stanu 4 E = ɛ σ α + J α=1 σ α σ γ + K σ α σ γ σ ζ + L σ α σ γ σ ζ σ δ α,γ 3! α,γ,ζ 4! α,γ,ζ,δ gdzie sumowanie po α i γ, ζ i δ w odpowiednich sumach przebiega od 1 do 4, oznacza wyłączenie takich samych indeksów, J jest podzielone przez, bo pojawiają się wyrazy takie jak σ 1 σ i σ σ 1 i podobne argumenty dla podzielenia K/3! i L/4!. Sumę stanów zapiszemy od razu w postaci analitycznej Z = 1 + 4e β(ɛ µ) + 6e β(ɛ µ) βj + 4e 3β(ɛ µ) 3βJ βk + e 4β(ɛ µ) 6βJ 4βK βl Średnie obsadzenie cząsteczki hemoglobiny przez tlen policzymy z pochodnej Stąd mamy N = 1 β ln Z µ N bound = 4e β(ɛ µ) + 1e β(ɛ µ) βj + 1e 3β(ɛ µ) 3βJ βk + 4e 4β(ɛ µ) 6βJ 4βK βl 1 + 4e β(ɛ µ) + 6e β(ɛ µ) βj + 4e 3β(ɛ µ) 3βJ βk + e 4β(ɛ µ) 6βJ 4βK βl Możemy zapisać ten wynik w funkcji stężenia tlenu wykorzystując wzór µ = µ o + kt ln(c/c o ). Aby uprościc zapis wprowadzimy oznaczenia: j = e βj, k = e βk, l = e βl i x = (c/c o )e β(ɛ µo ) co daje N bound = 4x + 1x j + 1x 3 j 3 k + 4x 4 j 6 k 4 l 1 + 4x + 6x j + 4x 3 j 3 k + x 4 j 6 k 4 l Wynik ten sprowadza się do poprzednich gdy wyłączamy odpowiednie oddziaływania. Na koniec popatrzmy na porównaie wyników rozważanych modeli z wynikami doświadczalnymi. Rysunek : Wiązanie tlenu przez hemoglobinę w funkcji parcjalnego ciśnienia tlenu, dla rozważanych modeli, porównane z wynikami doświadczalnymi Imai, Biophys. Chem., tom 37, str. 1, 1990 Zadanie. Ciśnienie osmotyczne w zatłoczonych roztworach. Na wykładzie poznaliśmy (lub też zostało przypomniane) pojęcie ciśnienia osmotycznego i jego związek ze stężeniem molowym (równanie van t Hoffa): Π = crt 4

gdzie c jest stężeniem molowym składnika roztworu nieprzechodzącego przez półprzepuszczalną błonę, R jest stałą gazową, a T temperaturą bezwzględną. Powyższe równanie zostało wyprowadzone dla niewielkich stężeń c. W zakresie wyższych stężeń związek jest nieliniowy i można go otrzymać posługując się klatkowym modelem roztworu, obliczając pracę objętościową potrzebną do zmniejszenia objętości całkowitej V o objętość jednej komórki v. Praca ta jest równa zmianie energii swobodnej Gibbsa roztworu w tym procesie, a energię Gibbsa możemy otrzymać ze związku G = kt ln Z słusznego dla energii swobodnej Helmholtza (to powinni Państwo wiedzieć z wcześniejszych lat studiów), a w przypadku energi swobodnej Gibbsa stanowiącego dość dobre przybliżenie, gdy rozważamy zmiany energii swobodnej towarzyszące różnym procesom w układach znajdujących się w stanie ciekłym. Zadaniem naszym jest więc wyznaczenie ciśnienia p ze związku pv = G(Ω 1) G(Ω) występujące w powyższym równaniu p jest szukanym ciśnieniem osmotycznym Π. Rozwiązanie: Punktem wyjścia jest równanie na funkcję rozkładu wyprowadzone przy rozwiązywaniu podobnych problemów na poprzednich ćwiczeniach. Mamy roztwór C cząsteczek makromolekuły zatłaczającej w objętości V, którą przedstawiamy jako Ω komórek o objętości v każda. Funkcja rozkładu naszego roztworu, związana z solwatowaniem cząsteczek C przez rozpuszczalnik, ma postać a więc ( ) Ω! Z sol = (Ω C)!C! exp C ɛsol C kt [ ( )] Ω! G(Ω) = kt ln Z sol = kt ln (Ω C)!C! exp C ɛsol C kt Dokonajmy teraz zmniejszenia objętości roztworu o objętość jednej komórki elementarnej, nie zmieniając liczby makrocząsteczek C, ani temperatury T : [ ( Ω! G = kt [ln Z sol (Ω 1) ln Z sol (Ω)] = kt ln (Ω C)!C! exp ( ) (Ω 1)! ] ln (Ω 1 C)!C! exp C ɛsol C = kt ln kt C ɛsol C kt ) Ω Ω C Ta zmiana energii swobodnej jest równa pracy objętościowej wykonanej na układzie pv = kt ln Ω Ω C p = kt v ln Ω Ω C więc jest to ciśnienie osmotyczne, gdyż wywodzimy je z funkcji rozkładu związanej z solwatowaniem cząsteczek C. Możemy dalej wprowadzić stężenie substancji C do wyprowadzonego równania p = kt v ln Ωv Ωv Cv = kt v ln V V Cv = kt v ln 1 1 [C]v = kt v ln(1 [C]v) 5

gdzie [C] = C/V jest stężeniem cząsteczek C w liczbie cząsteczek na jednostkę objętości roztworu. W ostatnim wyrażeniu v możemy traktować jako parametr modelu i określać zależności ciśnienia osmotycznego od stężenie [C] dla różnych wartości tego parametru. Dostaniemy monotonicznie rosnące zależności nieliniowe, co jest zgodne z obserwacjami doświadczalnymi, lecz ilościowy przebieg tych zależności w funkcji stężenia dla żadnej wartości v nie jest taki jak w doświadczeniu. Jak widać model klatkowy ma spore ograniczenia. Zadanie 3. Dyfuzja cząsteczek w obecności zatłaczacza. Wykorzystaj model przypadkowych skoków w jednym wymiarze, rozważany na pierwszych ćwiczeniach, wprowadzając prawdopodobieństwo niemożności wykonania przeskoku z powodu zajęcia klatki przez inną molekułę (zatłaczaczem są więc molekuły tego samego rodzaju co ta, której dyfuzję obserwujemy). Dla uproszczenia przyjmij, że prawdopodobieństwo przeskoku do pustej klatki jest w obu kierunkach równe 1/. Rozwiązanie: Przyjmijmy, że ułamek objętości układu zajęty przez nasze molekuły wynosi φ. Następnie przyjmujemy, że żadne dwie cząsteczki nie mogą zajmować tej samej pozycji, co dla nas oznacza, że nie mogą być w tej samej jednowymiarowej klatce o długości a. Błądzenie przypadkowe wygląda więc następująco. W przedziale czasu τ cząsteczka wykonuje skok w prawo lub lewo, z takim samym prawdopodobieństwem. Skok się udaje tylko gdy odbywa sieę do miejsca, które nie jest już zajęte. Zatem prawdopodobieństwo zakończonego powodzeniem przeskoku w prawo lub lewo wynosi p r = p l = 1 (1 φ) gdzie 1/ to prawdopodobieństwo podjęcia skoku w prawo lub w lewo, a 1 φ to prawdopodobieństwo, że komórka będzie wolna. Z kolei prawdopodobieństwo, że cząsteczka pozostanie tam gdzie była wynosi p s = φ To prawdopodobieństwo jest równe 1 p jump = 1 1 (1 φ) 1 (1 φ) = φ. Aby obliczyć współczynnik dyfuzji odpowiadający takiemu błądzeniu przypadkowemu, oszacujemy średnie kwadratowe przemieszczenie x jako funkcję czasu. Dla t = τ trajektoria składa się z pojedynczego kroku x (τ) = a p r + a p l + 0p s = a (1 φ) Średnie kwadratowe przemieszczenie jest liniową funkcją czasu, więc w czasie t, czyli dla t/τ kroków dyfuzji wyniesie ono x (t) = t τ x (τ) = a τ a (1 φ)t = (1 φ)t τ W przypadku dyfuzji swobodnej (bez uwzględniania zatłaczania przestrzeni przez inne cząsteczki) mieliśmy czyli wprowadzenie zatłoczenia daje D o = a τ D x (t) t = D o (1 φ) 6

dyfuzja jest więc wolniejsza. Zadanie 4. Dyfuzja cząsteczek w obecności zatłaczacza. Wykorzystaj model przypadkowych skoków w jednym wymiarze, rozważany na pierwszych ćwiczeniach, wprowadzając prawdopodobieństwo niemożności wykonania przeskoku z powodu zajęcia klatki przez inną molekułę (zatłaczaczem są więc molekuły tego samego rodzaju co ta, której dyfuzję obserwujemy). Tym razem przyjmij, że prawdopodobieństwo przeskoku do pustej klatki jest w obu kierunkach równe k t, a więc, że istnieje niezerowe prawdopodobieństwo pozostania cząsteczki w tym samym miejscu przez czas t, tak jak to było w oryginalnym rozwiązaniu zadania pierwszej serii. Rozwiązanie: Przyjmijmy, że ułamek objętości układu zajęty przez nasze molekuły wynosi φ. Następnie przyjmujemy, że żadne dwie cząsteczki nie mogą zajmować tej samej pozycji, co dla nas oznacza, że nie mogą być w tej samej jednowymiarowej klatce o długości a. Błądzenie przypadkowe wygląda więc następująco. W przedziale czasu τ cząsteczka wykonuje skok w prawo lub lewo, z takim samym prawdopodobieństwem wynoszącym k t. Z prawdopodobieństwem 1 k t cząstka nie wykona przeskoku. Skok się udaje tylko gdy odbywa sieę do miejsca, które nie jest już zajęte. Zatem prawdopodobieństwo zakończonego powodzeniem przeskoku w prawo lub lewo wynosi p r = p l = k t(1 φ) gdzie 1 φ to prawdopodobieństwo, że komórka, do której następuje przeskok, będzie wolna. Z kolei prawdopodobieństwo, że cząsteczka pozostanie tam gdzie była wynosi p s = 1 k t(1 φ). Aby obliczyć współczynnik dyfuzji odpowiadający takiemu błądzeniu przypadkowemu, oszacujemy średnie kwadratowe przemieszczenie x w przedziale czasu t, jak to robiliśmy na pierwszych ćwiczeniach: x ( t) = a p r + a p l + 0p s = a k t(1 φ) Średnie kwadratowe przemieszczenie jest liniową funkcją czasu, więc w czasie t, czyli dla t/ t kroków dyfuzji wyniesie ono x (t) = t t x ( t) = t t a k t(1 φ) = a k(1 φ)t W przypadku dyfuzji swobodnej (bez uwzględniania zatłaczania przestrzeni przez inne cząsteczki) mieliśmy D o = a k czyli wprowadzenie zatłoczenia daje a więc x (t) = D o (1 φ)t D = D o (1 φ) wynik nasz jest więc taki sam jak przy przyjęciu poprzedniego modelu. 7

Problem 5 Niech D o będzie współczynnikiem dyfuzji cząsteczek L w rozcieńczonym roztworze. Wyprowadź zależność współczynnika D cząsteczek L w obecności cząsteczek zatłaczających C o rozmiarach liniowych r razy mniejszych cząsteczki L, od ułamka objętości roztworu zajętej przez C, posługując się przypadkiem dyfuzji jednowymiarowej. Jak się zmieni ta zależność, gdy rozmiary liniowe cząsteczek C będą r razy większe niż cząsteczki L? Przedyskutuj konsekwencje wyprowadzonych zależności. Rozwiązanie: Zaznaczenie, że roztwór jest rozcieńczony ze względu na stężenie cząsteczek L oznacza, że pomijamy efekty objętości wyłączonej związane z tymi cząsteczkami. Wprowadzamy dwie siatki jedną o oczku a i drugą o oczku b = a/r. Cząsteczki L w czasie τ mogą przeskakiwać na siatce a. Możemy, jak w problemie na ćwiczeniach, przyjąć, że prawdopodobieństwo próby przeskoku w prawo i w lewo są równe i wynoszą po 1/, a prawdopodobieństwo próby pozostania w miejscu wynosi 0. Aby próba dokonania przeskoku w prawo lub w lewo przez cząsteczkę L zakończyła się powodzeniem, żadna z r kolejnych sąsiadujących z nią małych klatek, z prawej lub lewej strony, nie może być zajęta przez cząsteczkę C. Gdy ułamek objętości roztworu zajęty przez cząsteczki C wynosi φ, to prawdopowobieństwo, że jedna konkretna mała klatka jest pusta wynosi 1 φ, a prawdopodobieństwo, że r kolejnych małych klatek jest pustych wynosi (1 φ) r. Zatem prawdopodobieństwa przeskoku w prawo, przeskoku w lewo i pozostania w miejscu wynoszą odpowiednio: 1 (1 φ)r ; 1 (1 φ)r ; i 1 (1 φ) r Suma tych prawdopodobieństw, tak jak trzeba, daje 1. Błądzenie przypadkowe wygląda więc następująco. W przedziale czasu τ cząsteczka wykonuje skok w prawo lub lewo, z takim samym prawdopodobieństwem. Skok się udaje tylko gdy odbywa sie do miejsca, którego kolejnych r małych klatek nie jest zajęte przez jakąkolwiek cząsteczkę C. Aby obliczyć współczynnik dyfuzji odpowiadający takiemu błądzeniu przypadkowemu, oszacujemy średnie kwadratowe przemieszczenie x jako funkcję czasu. Dla t = τ trajektoria składa się z pojedynczego kroku a dla czasu t, czyli N = t/τ kroków mamy: x (τ) = a p r + a p l + 0p s = a (1 φ) r x (t) = t τ x (τ) = a τ (1 φ)r t W przypadku dyfuzji swobodnej (bez uwzględniania zatłaczania przestrzeni przez inne cząsteczki) mieliśmy czyli możemy zapisać D o = a τ x (t) = a τ (1 φ)r t D o (1 φ) r t wprowadzenie zatłoczenia daje więc D = D o (1 φ) r dyfuzja jest więc wolniejsza i efekt zależy od r, im r jest większe tym wpływ cząsteczek zatłaczających, przy tym samym stopniu wypełnienia roztworu, jest większy. 8

Gdy to cząsteczki L są r razy mniejsze niż cząsteczki C to w wyrażeniu na prawdopodobieństwo skutecznego przeskoku mamy zamiast (1 φ) r po prostu 1 φ. W kolejnych wzorach w miejsce (1 φ) r wstawiamy 1 φ i stąd mamy odpowiedź. 9