Pochodne cysteiny Badane związki

8 4.2.3. Pochodne cysteiny Bdne związki CH 3 SCH 2 CH C - NH 3 + S-metylo-L-cystein [Cys(Me)] CH 3 CH 2 C - SCH 2 CH NH 3 + S-etylo-L-cystein [Cys(Et)] CH 3 C - CH 3 SCH CH NH 3 + D,L-tiizoleucyn [Cys(Me,3Me)] + H 2 N C - CH H 2 C S CH 2 L-tiprolin (kws L-tizolidyno-4-kroksylowy) [Thz] + H 2 N CCH 3 CH H 2 C S CH 2 Ester metylowy L-tiproliny [ThzMe] C - + H 2 N CH H C 2 C CH 3 S CH 3 5,5-dimetylo-L-tiprolin (kws L-5,5-dimetylotizolidyno-4- kroksylowy) [Thz(5Me 2 )] C - HC CH 2 SCH 2 CH [Cys(Cm)] NH 3 + S-kroksymetylo-L-cystein

81 HC CH 2 C - CH 2 SCH 2 CH NH 3 + S-kroksyetylo-L-cystein [Cys(Ce)] - C CH + H 3 N C - CH 2 SCH 2 CH NH 3 + D,L-(mezo)-lntionin [Ln] Tki doór związków modelowych umożliwił: (i) dnie wrunków zchodzeni procesu dekroksylcji w ukłdch, w których możliwość tworzeni przejściowych produktów cyklicznych jest ogrniczon ze względów przestrzennych; (ii) określenie wpływu liczy grup funkcyjnych (NH + 3, C - ) i ich położeni w stosunku do grupy tioeterowej orz rodzju podstwnik lkilowego w grupie tioeterowej (-CH 3, -C 2 H 5 ) n przeieg procesów prowdzących do dekroksylcji; (iii) oszcownie stłej szykości rekcji wewnątrzcząsteczkowego przeniesieni protonu z grupy -NH + 3 do rodnik hydroksysulfurnylowego. Proces ten powinien konkurowć z procesem przeniesieni protonu ze środowisk rekcji nie prowdząc jednk, ze względu n niestilność pierścieni czteroczłonowych, do powstwni trwłych ktionorodników z wewnątrzcząsteczkowymi wiąznimi trójelektronowymi pomiędzy sirką tioeterową zotem grupy minowej; (iv) zdnie wpływu cyklizcji cząsteczki minokwsu n zchodzenie procesów frgmentcji; (v) identyfikcję i rozróżnienie rodnikowych produktów dekroksylcji (rodników α-(lkilotio)lkilowych i α-minolkilowych) poprzez rekcję z p- nitrocetofenonem, orz frgmentcji (rodników lkilosulfnylowych) poprzez rekcję z kwsem skorinowym; (vi) identyfikcję i wyznczenie prmetrów widm EPR niektórych rodnikowych produktów dekroksylcji. 4.2.3.1.Wyniki dń i ich omówienie Rdioliz impulsow Cys(Me), Cys(Et), Cys(Me,3Me) (minokwsy zwierjące grupy kroksylowe i minowe w pozycji β w stosunku do sirki <β-c 2 H, β-nh 2 >): W środowisku silnie

82 kwśnym (ph 1-3,5) rekcj rodników H z w/w minokwsmi (oecnymi w roztworze w stężenich 1-1 * 1-3 mol dm -3 ) prowdzi, w skli około 4 ns, do powstwni psm sorpcji z λ mx ~ 37-39 nm, którego wydjność spd wrz ze wzrostem ph (n rysunku 4.2.3_1 zilustrowno to n przykłdzie Cys(Me) (krzywe i c)). Psmo to przypisłem cyklicznemu ktionorodnikowi z wewnątrzcząsteczkowym wiązniem S, poprzez nlogię z kwsmi lkilotiokroksylowymi. Pełnemu wyudowywniu się psm sorpcji z λ ~ mx 37-39 nm (~1 µs) towrzyszy powstwnie psm z sorpcji z λ mx ~ 48 nm, chrkterystycznego dl ktionorodnik dimerowego z międzycząsteczkowym wiązniem S S rysunek 4.2.3_1. krzyw ). 1 8 6 4 2 c 3 4 5 6 Rys. 4.2.3_1 Widm sorpcyjne produktów przejściowych 2 * 1-3 mol dm -3 roztworów Cys(Me), nsyconych N 2, w ph 1 4 ns () i,9 µs po impulsie (), w ph 3,9 4 ns po impulsie (c). niżenie ph do i zwiększenie stężeni minokwsu powyżej 8 * 1-3 mol dm -3 w przypdku Cys(Me) powoduje zwiększenie intensywności psm sorpcji ktionorodników dimerowych (S S) + λ mx ~ 48 nm (jest to zgodne z oserwcjmi Asmus i in., 1985). Znikowi rodników S i ktionorodników dimerowych (S S) + towrzyszy powstwnie rodników α-minolkilowych i α- (lkilotio)lkilowych chrkteryzujących się odpowiednio psmmi sorpcji z λ mx < 26 nm i λ mx ~ 285 nm Rodniki α-minolkilowe i α-(lkilotio)lkilowe są głównymi indywidumi występującymi dl tej grupy związków w roztworch sło kwśnych, oojętnych i zsdowych (ph 3,5-1) (rysunek 4.2.3_2).

83 8 c 6 4 2 1µs czs 3 4 5 Rys. 4.2.3_2 Widm sorpcyjne produktów przejściowych roztworów 5 * 1-3 mol dm -3 Cys(Me) nsyconych N 2 w ph 5,74 12 ns () i 3 µs po impulsie () orz 5 * 1-2 mol dm -3 Cys(Me) w ph 5,8 12 ns po impulsie (c). Wstwk - kinetyk zniku psm sorpcji zrejestrownego w λ = 26 nm. W mirę zwiększni ph roztworów w widmie pojwi się sło wyodręnione psmo z λ mx ~ 34 nm pochodzące od stilniejszego w tych wrunkch rodnik hydroksysulfurnylowego. Thz, Thz(5Me 2 ) i ThzMe (minokwsy cykliczne zwierjące grupę kroksylową w pozycji β i drugorzędową grupę minową w pozycji α, w stosunku do sirki <β- C 2 H, α-nh>): W niskim ph oserwuje się powstwnie sło wyodręnionego psm sorpcji z λ mx ~ 34 nm, które możn przypisć ktionorodnikowi z wewnątrzcząsteczkowym wiązniem S 1 (rysunek 4.2.3_3 krzyw ). Podonie jk dl większości liniowych pochodnych cysteiny (z wyjątkiem Cys(Me)) zwiększenie stężeni Thz powyżej 1-2 mol dm -3 i oniżenie ph do nie prowdzi do powstwni ktionorodników dimerowych (S S) +. 1 W interpretcji widm możn wykluczyć sorujący w tym zkresie spektrlnym rodnik hydroksysulfurnylowy (λ mx = 34 nm), gdyż dl stłej szykości ktlizownej protonmi rekcji elimincji nionu H - k H rzędu 1 1 [dm 3 mol -1 s -1 ] przy stężeniu protonów [H 3 + ] =,1 [mol dm -3 ] połówkowy czs życi tego indywiduum t 1/2 yły krótszy od 1 ns.

84 12 9 6 3 c 3 4 5 Rys. 4.2.3_3 Widm sorpcyjne produktów przejściowych nsyconych N 2 roztworów 2 * 1-3 mol dm -3 Thz w ph 1 13ns po impulsie () i w ph 6,6 4 ns po impulsie () orz 2 * 1-3 mol dm -3 Thz(5Me 2 ) w ph 6,6 4 ns po impulsie (c). Intensywne psmo sorpcji z λ mx ~ 34-35 nm oserwuje się w ph > 3,5. Psmo to powstje w wyniku nłożeni psm ktionorodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązniem S z psmem sorpcji rodników hydroksysulfurnylowych (Thz rysunek 4.2.3_3 krzyw orz rysunek 4.2.3_4 krzyw ; Thz(5Me 2 ) rysunek 4.2.3_3 krzyw c). Zwiększnie ph jk i zlokownie możliwości dekroksylcji w ThzMe powoduje wzrost wzrost intensywności psm sorpcji λ mx ~ 34-35 nm. W cłym zkresie ph oserwuje się powstwnie i α-(lkilotio)lkilowych z λ mx ~ 285 nm, jk i rodników α-minolkilowych chrkteryzujących się psmem sorpcji z λ mx < 26 nm (rysunki 4.2.3_3 i 4.2.3_4). Czs życi tych osttnich jest stosunkowo długi i wynosi t 1/2 ~ 1 µs, co odróżni Thz i jej pochodne od liniowych pochodnych cysteiny, w których t 1/2 nie przekrcz 6 ns.

85 8 A 6 4 2 B 4 ns 2 µs czs 3 4 5 Rys. 4.2.3_4 Widm sorpcyjne produktów przejściowych nsyconych N 2 roztworów 5 * 1-2 mol dm -3 Thz w ph 5,7 2ns () i 45 µs po impulsie. Wstwk A - kinetyk zniku psm sorpcji zrejestrownego w λ = 33 nm. Wstwk B - kinetyk zniku psm sorpcji zrejestrownego w λ = 26 nm. Cys(Cm) (minokws zwierjący grupę minową w pozycji β orz grupy kroksylowe w pozycji α i β, w stosunku do sirki <α,β-c 2 H, -NH 2 >): Dl tego związku, w cłym dnym zkresie ph 1-1 występuje sorpcj chrkterystyczn dl rodników α-(lkilotio)lkilowych z λ mx ~ 28-3 nm i sorpcj z λ mx < 26 nm chrkterystyczn dl rodników α-minolkilowych (rysunek 4.2.3_5 krzywe i ). W ph 1 nie oserwuje się sorpcji z λ mx ~ 39 nm chrkterystycznej dl rodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązniem S (rysunek 4.2.3_5 krzyw c).

86 12 8 4 c 1µs czs 25 3 35 4 45 Rys. 4.2.3_5 Widm sorpcyjne produktów przejściowych nsyconych N 2, roztworów Cys(Cm) 3 * 1-2 mol dm -3 w ph 5,74 125 ns () i 3,5 µs () po impulsie orz 2 * 1-3 mol dm -3 w ph 1 (c). Wstwk - kinetyk zniku psm sorpcji zrejestrownego w λ = 26 nm. Cys(Ce) i Ln (minokwsy zwierjące grupy kroksylowe i minowe w pozycji β i β' w stosunku do sirki <β-c 2 H; β,β'-nh 2, β,β'-c 2 H; β,β'-nh 2 >): W środowisku silnie kwśnym rekcj rodników hydroksylowych z Cys(Ce) i Ln prowdzi do powstni ktionów z wewnątrzcząsteczkowym wiązniem S, chrkteryzujących się psmem sorpcji z λ mx = 39 nm (w Cys(Ce) psmo to m większą intensywność niż w Ln) (rysunki 4.2.3_6 i 4.2.3_7).

87 1 8 6 4 2 c 1µs czs 3 4 5 6 Rys. 4.2.3_6 Widm sorpcyjne produktów przejściowych 2 * 1-3 mol dm -3 roztworów Cys(Ce), nsyconych N 2,,9 µs po impulsie w: ph - (), ph 1 - () ph - 3,9 (c). Wstwk - kinetyk zniku psm sorpcji zrejestrownego w λ mx = 39 nm (ph 1). Również dl tych związków w cłym dnym zkresie ph 1-1 oerwuje się rodniki α-(lkilotio)lkilowe i α-minolkilowe (rysunki 4.2.3_6 i 4.2.3_7). 6 4 2 1µs czs 25 3 35 4 45 5 55 Rys. 4.2.3_7 Widm sorpcyjne produktów przejściowych 2 * 1-3 mol dm -3 roztworów Ln, nsyconych N 2,,9 µs po impulsie w: ph 1 - (), ph 3 - ().

88 Wstwk - kinetyk zniku psm sorpcji zrejestrownego w λ mx = 39 nm (ph 1). Wydjność dekroksylcji G(C 2 ) W dnych pochodnych cysteiny (tj. Cys(Me), Cys(Ce) <β-c 2 H, β-nh 2 >; Thz, Thz(5Me 2 ) <β-c 2 H, α-nh>, Cys(Cm) <α,β-c 2 H, -NH 2 >) dekroksylcj zchodzi w cłym dnym zkresie ph ( - 1,5). Podonie jk dl wcześniej omwinych związków, wydjność G(C 2 ) w zkresie ph - 3 wzrst ze spdkiem kwsowości roztworu, osiągjąc w ph > 2,5 wydjność zliżoną (w grnicch łędu doświdczlnego) do pełnej wydjności rodników hydroksylowych (przykłdy n rysunkch 4.2.3_8 - Cys(Me), 4.2.3_9 - Thz, 4.2.3_1 - Cys(Cm)). Wyjątek stnowi Thz(5Me 2 ), dl której wydjność dekroksylcji osiąg ~7% wydjności rodników H (rysunek 4.2.3_9 krzyw c). 7.5 6 5.4 G(C 2 ) 4 3 2.3.2 G(PNAP.- ) 1.1 2 4 6 8 1 ph. Rys. 4.2.3_8 Wydjności chemordicyjne G(C 2 ) () i G(PNAP.- ) () w Cys(Me), w zleżności od ph. Dl pomirów wydjności C 2 w zkresie ph - 3,5 stężenie związku wynosiło 1-2 mol dm -3, w ph > 3,5 2 * 1-3 mol dm -3, pomiry G(PNAP.- ) zostły wykonne w 5 * 1-3 mol dm -3 roztworch Cys(Me) zwierjących 3 * 1-5 mol dm -3 PNAP.

89 G(PNAP.- ) Pomiry wydjności produktów dekroksylcji z p-nitrocetofenonem pokzły, że jedynie w przypdku Thz powstjące rodniki redukują PNAP do PNAP.- z pełną wydjnością (rysunek 4.2.3_9 krzyw ). Ntomist rodniki powstłe podczs dekroksylcji liniowych pochodnych cysteiny redukują PNAP tylko w rdzo niewielkim stopniu, G(PNAP.- ) <,3 (rysunek 4.2.3_8 krzyw ). 6 5 6 5 G(C 2 ) 4 3 2 c c 4 3 2 G(PNAP.- ) 1 1 2 4 6 8 1 ph Rys. 4.2.3_9 Wydjności chemordicyjne G(C 2 ) ( - ) i G(PNAP.- ) ( - ) w Thz i G(C 2 ) (c - ) w Thz(5Me 2 ), w zleżności od ph, Dl pomirów wydjności C 2 w zkresie ph - 3,5 stężeni związków wynosiły 1-2 mol dm -3, w ph > 3,5 2 * 1-3 mol dm -3, pomiry G(PNAP.- ) zostły wykonne w 5 * 1-3 mol dm -3 roztworch Thz zwierjących 3 * 1-5 mol dm -3 PNAP. W Cys(Cm) i Cys(Ce) oserwuje się niewielkie le wyrźne zwiększenie wydjności redukcji PNAP wrz ze wzrostem ph (przykłd dl Cys(Cm) rysunek 4.2.3_1 krzyw ).

9 7 6 5 1..8 G(C 2 ) 4 3 2.6.4 G(PNAP.- ) 1.2 2 4 6 8 1 ph Rys. 4.2.3_1 Wydjności chemordicyjne dekroksylcji G(C 2 ) w Cys(Cm) ()) i G(PNAP.- ) w Cys(Cm) (), w zleżności od ph, Dl pomirów wydjności C 2 w zkresie ph - 3,5 stężenie związku wynosiło 1-2 mol dm -3, w ph > 3,5 2 * 1-3 mol dm -3, pomiry G(PNAP.- ) zostły wykonne w 5 * 1-3 mol dm -3 roztworch Cys(Cm) i zwierjących 3 * 1-5 mol dm -3 PNAP. EPR W npromienionych w temperturze 77 K, prókch zwierjących 3 * 1-1 i 7,5 * 1-1 Cys(Me) orz 1,3 * 1-1 mol dm -3 Cys(Cm) w 1-1 mol dm -3 HCl 4, w temperturze 77-12 K oserwuje się widmo pułpkownych rodników H zliżone do oerwownego przez Riederer' i in., 1983, w polikrystlicznym lodzie heksgonlnym. Po rozmrożeniu do tempertury 12-16 K, oserwuje się tryplety o prmetrch zliżonych, w grnicch łędu eksperymentlnego, do wrtości oserwownych dl Met. Świdczy to o powstwniu rodników zloklizownych n tomie węgl, w których niesprowny elektron oddziłuje z dwom protonmi związnymi z tym smym tomem węgl. tj. rodników α-(lkilotio)lkilowych. Tego typu rodniki powstją w Cys(Me) podczs deprotoncji w pozycji α do tomu sirki, w Cys(Cm) podczs dekroksylcji S-końcowej grupy kroksylowej (nlogicznie jk dl 2,2'-TDGA). Dlsze ogrzewnie próek, do tempertur 18-2 K prowdzi w przypdku Cys(Me) do oserwcji singletu (nlogicznie jk dl Met) chrkterystycznego dl ktionorodnik dimerowego (S S) +, w przypdku Cys(Cm) do zniku sygnłu sorpcji mikroflowej (Pogocki i in. 1994).

91 Wydjności produktów β-frgmentcji (rodniki lkilosulfnylowe RS. i ldehydy) Dl dnej grupy związków wydjność powstwni cetldehydu (AcH) i ldehydu propionowego podczs npromienini w ph = 5,8 sięg od 64 do 97% wydjności powstwni C 2 zmierzonej dl tych smych stężeń minokwsów. Z kolei, powstjące w procesie frgmentcji rodników α-minolkilowych rodniki lkilosulfnylowe (RS. ) utleniją kws skorinowy z pełną wydjnością 2 (przykłd dl Cys(Cm) znjduje się n rysunku 4.2.3_11). Wyniki pomirów wydjności chemordicyjnej powstwni ldehydów i utlenini kwsu skorinowego zostły zerne w teli 6. 2 Produkty frgmentcji rodników α-minolkilowych rodniki lkilosulfnylowe (RS. ) yły identyfikowne w rekcji utlenini kwsu skorinowego (witminy C), rekcj [38 ]. Powstjący w tej rekcji nionorodnik VC.- chrkteryzuje się sorpcją w zkresie UV-VIS z λ mx = 36 nm ε = 33 dm 3 mol -1 cm -1 (Bielski 1982). Dzięki swemu stosunkowo wysokiemu H - potencjłowi redoks E o (RS.,H + /RSH) ~ 1,35 V (VC-) H H + RS. (Wrdmn 1989) rodniki lkilosulfnylowe wydjnie utleniją nion kwsu skorinowego o potencjle redoks E o (VC.- /VC - ) ~,3 V (Wrdmn 1989). Rekcj [38] w przypdku rodników RS. pochodzących z cysteiny zchodzi ze stłą szykości k = 1,2 * 1 9 dm 3 (_. ) (VC.-) H H + RSH [38] mol -1 s -1 (Forni i in, 1983, Bonifćić i in, 1994). Poniewż nion VC - może yć tkże utleniny przez rodniki H, eksperymenty z użyciem kwsu skorinowego yły prowdzone przy dwudziestopięciokrotnym ndmirze dnego minokwsu w stosunku do kwsu skorinowego.

92 8 6 4 2 2 µs czs 3 35 4 45 Rys. 4.2.3_11 Widmo sorpcyjne nionorodników kwsu skorinowego (VC._ ) powstłych w nsyconym N 2 roztworze zwierjącym 3 * 1-2 mol dm -3 Cys(Cm) i 2 * 1-3 mol dm -3 VC - w ph 5,8, 6 µs po impulsie. Wstwk - kinetyk powstwni psm sorpcji zrejestrown w λ mx = 36 nm. Prmetry kinetyczne Stłe szykości frgmentcji rodników α-minolkilowych k f zostły wyznczone z pomirów ezpośrednich zniku psm sorpcji w λ = 26 nm (wstwki w rysunkch 4.2.3_2, 4.2.3_4, 4.2.3_5). Wyniki pomirów k f są zerne w teli 6.

93 Tel 6 Wydjności chemordicyjne powstwni C 2 i ldehydu octowego orz redukcji kwsu skorinowego w npromieninych roztworch minokwsów nsyconych N 2. Stłe szykości frgmentcji rodników α-minolkilowych. Aminokws Stężnie G(C 2 ) G(AcH) G(VC.- ) ) k f * 1-6 (ph 5.8) [1-2 mol dm -3 ] [s -1 ] Thz 5, 3,2 2,99,7 Cys(Me) 5, 3,8 3,7 3,96 2,4 Cys(Et) 5, 3,7 3,5 3,92 2,8 Cys(Me,3Me) 5, -- 3,3 c) - 4,7 Cys(Cm) 3, 3,9 2,5 3,28 1,3 Cys(Ce) 3, 4,1 2,9 3,74 3,3 Ln 3,5 3,9 3,7 3,94 ) 1,2 ) Stężenie minokwsu 5 * 1-2 mol dm -3, stężenie kwsu skorinowego - 2 * 1-3 mol dm -3. ) Stężenie Ln - 5 * 1-3 mol dm -3. c) Wydjność ldehydu propionowego.