Badania zostały przeprowadzone dla wybranych pochodnych metioniny. Badane związki

Transkrypt

1 Metionina i jej pohodne Badania zostały przeprowadzone dla wybranyh pohodnyh metioniny. Badane związki COO - CH 3 SCH 2 CH 2 CH NH 3 L-metionina [Met] COO - CH 3 SCH 2 CH 2 CH NH C O CH 3 N-aetylo-L-metionina [A-Met] COO CH 3 CH 3 SCH 2 CH 2 CH NH 2 Ester metylowy L-metioniny [Met-OMe] COO CH 3 CH 3 SCH 2 CH 2 CH NH C CH 3 O Ester metylowy N-aetylo-L-metioniny COO - CH 3 CH 2 S CH 2 CH 2 CH NH 3 L-etionina [A-Met-OMe] [Eth] CH 3 CH 2 COO - CH 2 CH 2 SCH 2 CH 2 CH NH 3 [Hy(nBu)] L-butionina Taki dobór badanyh związków umożliwił:

2 71 (i) rozstrzygnięie, który z ykliznyh rodników: kationorodnik z wewnątrzząstezkowym wiązaniem S N zy rodnik z wewnątrzząstezkowym wiązaniem S O jest produktem pośrednim w proesie prowadząym do dekarboksylaji metioniny; (ii) wyznazenie stałej szybkośi reakji wewnątrzząstezkowego przeniesienia protonu z grupy -NH 3 do rodnika hydroksysulfuranylowego. Proes ten z powinien konkurować z proesem przeniesienia protonu ze środowiska reakji i prowadzić do powstawania kationorodników z wewnątrzząstezkowym wiązaniem trójelektronowym pomiędzy siarką tioeterową i azotem grupy aminowej.; (iii) określenie wpływu podstawnika (C 2 H 5, n-c 4 H 9 ) w grupie tioeterowej na proesy rodnikowe prowadząe do kationorodników z wewnątrzząstezkowym wiązaniem S N i kationorodników dimerowyh z międzyząstezkowym wiązaniem S S; (iv) identyfikaję rodnikowyh produktów dekarboksylaji metioniny (rodników α- aminoalkilowyh), poprzez reakję z p-nitroaetofenonem Wyniki badań i ih omówienie Radioliza impulsowa L-metionina (Met) 1 - W środowisku silnie kwaśnym (ph 1-3,5) reakja rodników OH z metioniną w skali zasowej kilkudziesięiu nanosekund prowadzi do powstania szerokiego pasma z maksimum absorpji λ max ~ 39 nm (rysunek 4.2.2_1 krzywa a). Absorpja z λ ~ max 39 nm nie występuje w A-Met i A-Met-OMe (vide infra) pomimo potenjalnyh możliwośi powstawania w tyh związkah wewnątrzząstezkowego wiązania trójelektronowego typu S O. Pozwala to na przypisanie pasma obserwowanego w metioninie do kationorodnika z wewnątrzząstezkowym wiązaniem trójelektronowym S N. W skali mikrosekundowej wybudowuje się pasmo absorpji λ max ~ 48 nm (rysunek 4.2.2_1 krzywa b), harakterystyzne dla kationorodnika dimerowego z międzyząstezkowym wiązaniem S S, któremu towarzyszy pasmo rodników α- (alkilotio)alkilowyh λ max ~ 29 nm. 1 Użyie enanjomeryznej D-metioniny nie wpływa znaząo na obraz obserwowanyh zjawisk.

3 72 G*ε (mol -1 dm 3 m -1 ) a b λ (nm) Rys _1 Widma absorpyjne produktów przejśiowyh 2 * 1-3 mol dm -3 roztworów Met, nasyonyh N 2 O, w ph 1 4 ns (a) i 1,5 µs po impulsie (b), i w ph 6,9 4 ns po impulsie (). W ph bliskim obojętnego (ph 6,9) dominująym pasmem absorpji jest pasmo z λ max ~ 39 nm (rysunek 4.2.2_1 krzywa ), które w zasie około,8 µs przekształa się w pasmo z λ max w zakresie nadfioletu przypisane rodnikom α-aminoalkilowym. N-aetylo-L-metionina (A-Met) - W środowisku silnie kwaśnym (ph 1-3,5), w zasie około 2 µs po impulsie wybudowuje się harakterystyzne dla kationorodników dimerowyh z międzyząstezkowym wiązaniem S S pasmo absorpji z λ ~ max 49 nm (rysunek 4.2.2_2 krzywe a i b); pasmo to w ph 1 zanika, w zasie dłuższym od 2 µs. Podobnie jak w Met, pasmu absorpyjnemu kationorodników dimerowyh (S S) towarzyszy pasmo o słabszej intensywnośi ( λ ~ max 29 nm) przypisane rodnikom α-(alkilotio)alkilowym. W środowisku obojętnym i zasadowym (ph 7-1) w A-Met obserwuje się, w nanosekundowej skali zasowej pasmo rodnika hydroksysulfuranylowego z λ ~ max 34 nm (rysunek 4.2.2_2 krzywa ), pasmo to przekształa się w pasmo kationorodnika dimerowego (S S) z λ ~ max 49 nm, z szybkośią zależną od ph roztworu i stężenia A-Met.

4 73 G*ε (mol -1 dm 3 m -1 ) b a λ (nm) Rys _2 Widma absorpyjne produktów przejśiowyh 2 * 1-3 mol dm -3 roztworów A-Met, nasyonyh N 2 O, w ph 1 4 ns (a) i 2 µs po impulsie (b), i w ph 7 4 ns po impulsie (). Ester metylowy L-metioniny (Met-OMe) - W środowisku silnie kwaśnym (ph 1-3,5) w wyniku reakji rodników OH z Met-OMe w skali kilkudziesięiu nanosekund obserwuje się poszerzone pasmo absorpji z λ max ~ 39 nm. Jest to spowodowane nałożeniem pasma absorpji kationorodników z wewnątrzząstezkowym wiązaniem S N z pasmem absorpji rodników hydroksysulfuranylowyh (rysunek 4.2.2_3 krzywa a). W mikrosekundowej skali zasu wybudowuje się pasmo absorpji kationorodników dimerowyh z międzyząstezkowym wiązaniem S S z λ max ~ 48 nm, (rysunek 4.2.2_3 krzywa b), któremu towarzyszy harakterystyzne dla rodników α- (alkilotio)alkilowyh pasmo λ max ~ 29 nm. W ph bliskim obojętnego (ph 6,7) dominująym pasmem absorpji jest pasmo λ ~ max 39 nm, którego zas żyia sięga setek mikrosekund (rysunek 4.2.2_3 krzywa ).

5 74 2 G*ε (mol -1 dm 3 m -1 ) a b λ (nm) Rys _3 Widma absorpyjne produktów przejśiowyh 2 * 1-3 mol dm -3 roztworów Met-OMe, nasyonyh N 2 O, w ph 1 4 ns (a) i 2 µs po impulsie (b), i w ph 6,7 9 µs po impulsie (). Ester metylowy N-aetylo-L-metioniny (A-Met-OMe) - Podobnie jak w A-Met, w środowisku silnie kwaśnym (ph 1-3,5), w zasie około 2 µs po impulsie elektronów wybudowuje się pasmo absorpji kationorodników dimerowyh z międzyząstezkowym wiązaniem S S z λ ~ max 49 nm (rysunek 4.2.2_4 krzywe a i b). W ph 1 pasmo to zanika, w zasie dłuższym od 2 µs. Podobnie jak w pozostałyh związkah pasmu kationorodnika dimerowego (S S) towarzyszy pasmo rodników α-(alkilotio)alkilowyh (λ ~ max 29 nm). W środowisku obojętnym i zasadowym (ph 7-1) w A-Met-OMe obserwuje się w nanosekundowej skali zasowej pasmo rodnika hydroksysulfuranylowego z λ ~ max 34 nm (rysunek 4.2.2_4 krzywa ), pasmo to w zasie około 1 µs przekształa się w pasmo przypisane kationorodnikowi dimerowemu (S S) z λ ~ max 49 nm.

6 75 G*ε (mol -1 dm 3 m -1 ) b a λ (nm) Rys _4 Widma absorpyjne produktów przejśiowyh 2 * 1-3 mol dm -3 roztworów A-Met-OMe, nasyonyh N 2 O, w ph 1 4 ns (a) i 2 µs po impulsie (b), i w ph 6,8 4 ns po impulsie (). L-etionina (Eth) 2 i L-butionina (Hy(nBu)): - W środowisku silnie kwaśnym (ph 1-3,5) reakja rodników OH z Eth i Hy(nBu) w skali zasowej kilkudziesięiu nanosekund prowadzi do powstania szerokiego pasma z maksimum absorpji λ ~ max 39 nm. Analogiznie jak w Met, w mikrosekundowej skali wybudowuje się pasmo absorpji λ max ~ 48 nm, harakterystyzne dla kationorodnika dimerowego z międzyząstezkowym wiązaniem S S, któremu towarzyszy pasmo rodników α- (alkilotio)alkilowyh z λ max ~ 29 nm. W środowisku obojętnym i zasadowym (ph 7-9,7) dominująym pasmem absorpji jest pasmo z λ ~ max 39 nm (S N ) które zanika w zasie około 1 µs. Parametry kinetyzne W A-Met i A-Met-OMe, w któryh aylowane grupy aminowe, na skutek elektronoakeptorowego działania podstawnika aetylowego, nie są w stanie pełnić funkji donora protonów proes, prowadząy do powstania kationorodnika (S S), jest główną drogą zaniku rodnika hydroksysulfuranylowego. Zarówno dla A-Met jak i A-Met-OMe zanikowi pasma absorpji z λ max = 34 nm harakterystyznego 2 Użyie enanjomeryznej D-etioniny nie wpływa znaząo na obraz obserwowanyh zjawisk.

7 76 dla rodnika hydroksysulfuranylowego towarzyszy jednozesne powstawanie pasma absorpji z λ max = 49 nm harakterystyznego dla kationorodnika dimerowego (S S) (rysunek 4.2.2_5 A i B). 49 nm 49 nm 1 µ s A 34 nm 2 µ s B 34 nm zas zas Rys _5 Kinetyka zmian absorpji odpowiadająej zanikowi rodników hydroksysulfuranylowh (34 nm) i powstawaniu kationorodników (S S) (49 nm), w 2 * 1-3 mol dm -3 A-Met o ph 7 (A) i w 2 * 1-3 mol dm -3 A-Met-OMe o ph 6,8 (B), w funkji zasu. Podobnie jak dla kwasów alkilotiokarboksylowyh, zanik rodnika hydroksysulfuranylowego w A-Met i A-Met-OMe jest proesem pseudopierwszorzędowym zależnym zarówno od stężenia aminokwasu [S] jak i stężenia protonów obenyh w środowisku [H 3 O ]. 5 A C 3 2 k exp * 1-6 (s -1 ) [H 3 O ] (1-5 mol dm -3 ) 3. B 2.7 k exp * 1-5 (s -1 ) [H 3 O ] (1-5 mol dm -3 ) 1 9 D [A-Met] (1-3 mol dm -3 ) [A-Met-OMe] (1-3 mol dm -3 ) Rys _6 Obserwowana pseudo-pierwszorzędowa stała szybkośi reakji zaniku rodnika hydroksysulfuranylowego (λ max = 34 nm) dla A-Met (A i B) i A-Met-OMe (C i D) w zależnośi od [H 3 O ] stężenie aminokwasu [S] = 2 * 1-3 mol dm -3 ) i w zależnośi od stężenia aminokwasu [S] (ph = 7).

8 77 Stałe szybkośi k d, k H i k S dla A-Met i A-Met-OMe wyznazono metodą opisaną w punkie wykorzystują równanie (XXI). Rezultaty otrzymane podstawie danyh przedstawionyh na rysunku 4.2.2_6 zebrane są w tabeli 5. Tabela 5 Parametry kinetyzne reakji rodnikowyh N-aetylowyh pohodnyh metioniny Związek k d* 1-6 [s -1 ] k H* 1-1 [mol -1 dm 3 s -1 ] k S* 1-7 [mol -1 dm 3 s - 1] A-Met 1,91 2,52 5,97 A-Met-OMe,5 1,24 1,74 Wydajność dekarboksylaji G(CO 2 ) Dla Met i A-Met dekarboksylaja zahodzi w ałym badanym zakresie ph ( - 1,5). Wydajność G(CO 2 ) w zakresie ph - 3 wzrasta ze spadkiem kwasowośi roztworu, osiągają w ph > 2,5, w Met 8-1%, a w A-Met 45-55% wydajnośi pozątkowej rodników OH (rysunek 4.2.2_7 krzywe a i ). G(PNAP.- ) Pomiary wydajnośi rodnikowyh produktów dekarboksylaji Met z p- nitroaetofenonem 3 pokazały, że powstająe rodniki α-aminoalkilowe redukują 3 Jak już wspomniano (w punkie 2.3.3) stosunkowo niski potenjał redoks p-nitroaetofenonu (PNAP) E o (PNAP/PNAP.- ) = -,35 V (Wardman 1989) pozwala na rozróżnienie rodników α- (alkilotio)alkilowyh (słabyh reduktorów) od α-aminoalkilowyh. Rodniki α-aminoalkilowe redukują p-nitroaetofenon w reakji [37].

9 78 PNAP do PNAP.- z pełną wydajnośią (rysunek 4.2.2_5 krzywa b); rodniki α- amidoalkilowe powstałe podzas dekarboksylaji A-Met nie redukują PNAP, G(PNAP.- ) <,3 (rysunek 4.2.2_7 krzywa d). 6 5 a b 6 5 G(CO 2 ) G(PNAP.- ) 1 d ph Rys _7 Wydajnośi hemoradiayjne G(CO2) i G(PNAP.- ) w Met (krzywe a - i b - ) i A-Met (krzywe - i d - ) w zależnośi od ph, Dla pomiarów wydajnośi CO2 w zakresie ph - 3,5 stężenia związków wynosiły 1-2 mol dm -3, a w ph > 3,5 2*1-3 mol dm -3, pomiary G(PNAP.- ) zostały wykonane w 5*1-3 mol dm -3 roztworah aminokwasów zawierająyh 3*1-5 mol dm -3 PNAP. O 2 N (PNAP) O CH 3 R. CH NH 2 Powstająy w niej anionorodnik PNAP.- harakteryzuje się silną absorpją w zakresie UV-VIS z λ max = 35 nm, ε = 176 dm 3 mol - 1 m -1 i λ max = 545 nm, ε = 29 [dm 3 mol -1 m -1 ] (Adams i Willson 1973, Hiller i Asmus 1983). O 2 N. O R CH NH 2 CH 3 (PNAP.-) [37]

10 79 EPR W napromienionej w temperaturze 77 K, próbe zawierająej 1,3 * 1-1 mol dm -3 Met w 1-1 mol dm -3 HClO 4, w temperaturze K obserwuje się widmo pułapkowanyh rodników OH zbliżone do oberwowanego przez Riederer'a i in., 1983, w polikrystaliznym lodzie heksagonalnym. Po rozmrożeniu do temperatury K, obserwuje się tryplet o wartośi współzynnika g = 2,4 i sprzężeniu nadsubtelnym A H 2 mt. Świadzy to o powstawaniu rodnika zlokalizowanego na atomie węgla, w którym niesparowany elektron oddziałuje z dwoma protonami związanymi z tym samym atomem węgla. Widmo to jest analogizne do obserwowanego przez Burlińską i in. 1994, w polikrystaliznyh peptydah metioninowyh wskazująego na powstawanie rodników α-(alkilotio)alkilowyh. Tego typu rodniki powstają w Met podzas deprotonaji w pozyji α do atomu siarki. Dalsze ogrzewanie próbki, do temperatur 18-2 K prowadzi do obserwaji singletu z g = 2,1 i szerokośi sygnału H 2,5 mt harakterystyznego dla kationorodnika dimerowego (S S) (Champagne i in. 1991, Pogoki i in. 1994).