Wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie protonu

Transkrypt

1 Dyskusja wyników 431 Wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie protonu Wyniki badań przedstawionych w pracy (punkty 421, 422, 423, 424) pozwalają na wyjaśnienie roli wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu w mechanizmie utleniania rodnikiem wodorotlenkowym aminokwasów zawierających grupę tioeterową Pierwotnym produktem utleniania aminokwasów tioeterowych rodnikiem wodorotlenkowym jest rodnik hydroksysulfuranylowy, który powstaje w wyniku addycji rodnika H do siarki tioeterowej (reakcja [39]) ( 2 )n H k(h ) ( 2 )n [39] H odniki hydroksysulfuranylowe zanikają w (i) reakcji spontanicznej dysocjacji (k d ), (ii) katalizowanej protonami środowiska reakcji eliminacji cząsteczki wody (k H ) i (iii) podstawienia anionu H przez drugą cząsteczkę aminokwasu (k ) (schemat 2) (podobnie jak to ma miejsce w modelowych kwasach alkilotiokarboksylowych punkt 421) oraz w (iv) reakcji wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu, w której bierze udział protonowana grupa aminowa (k ) (schemat 2) chemat 2 H H H k H 2 H 2 N k d H k H H 3 2H 2 k H H H H

2 107 W dotychczasowej literaturze (Hiller i in 1981) udział tego ostatniego procesu w metioninie był brany pod uwagę tylko w roztworach słabo kwaśnych i obojętnych pierając się na widmach absorpcyjnych otrzymanych dla metioniny w roztworach silnie kwaśnych (rysunki 4221 i 4223) proces wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu od protonowanej grupy aminowej (k, schemat 2) może skutecznie konkurować z międzycząsteczkowym przeniesieniem protonów ze środowiska reakcji do rodnika hydroksysulfuranylowego (k H, schemat 2), nawet w warunkach wysokiego stężenia protonów w środowisku reakcji W niskim ph (ph < 2) i przy stosunkowo niskim stężeniu aminokwasu (< 10 2 mol dm 3 ) udział spontanicznej dysocjacji rodnika hydroksysulfuranylowego oraz podstawienia anionu H przez drugą cząsteczkę aminokwasu (opisywanych odpowiednio stałymi szybkości k d i k ) jest do zaniedbania w procesie zaniku rodnika hydroksysulfuranylowego W warunkach prowadzenia eksperymentu (ph 1, stężenie aminokwasu 2 * 10 3 mol dm 3 ) obserwowane procesy rodnikowe w metioninie sprowadzają się do konkurencji pomiędzy wewnątrzcząsteczkowym przeniesieniem protonu z protonowanej grupy aminowej (k ) i katalizowaną protonami środowiska (k H ) eliminacją cząsteczki wody Wymienione procesy prowadzą do dwóch różnych rodnikowych produktów pośrednich (schemat 3), których identyfikacja i ilościowe oznaczenie umożliwiło wyznaczenie stałej szybkości wewnatrzcząsteczkowego przeniesienia protonu (k ) w metioninie chemat 3 H 3 C H 2 2 H 2 H k H H 3 ( 2H 2 ) H 3 C 2 H 2 k H 2 H H 3 C 2 eakcja z udziałem protonów grupy aminowej prowadzi do powstawania kationorodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym pomiędzy

3 108 siarką i azotem (k, schematy 2 i 3), które są jednym z prekursorów dekarboksylacji Pasmo absorpcji z λ max ~ 390 nm można z całą pewnością przypisać kationorodnikowi z wiązaniem trójelektronowym ( N) 1 ponieważ obserwowano je tylko w związkach dysponujących "kwasowymi" protonami wolnych (nieacylowanych) grup aminowych (Met i MetMe, rysunki 4221 i 4223) Konkurencyjna, wobec powstawania kationorodnika z wiązaniem N, reakcja dehydratacji rodników hydroksysulfuranylowych z udziałem protonów środowiska (k H, schematy 2 i 3) prowadzi do monomerycznego kationorodnika > Kationorodnik ten znajduje się w zależnej od stężenia aminokwasu równowadze z kationorodnikiem dimerowym ( ) 2, którego powstawanie w metioninie i jej pochodnych obserwuje się w niskim ph, zarówno metodą radiolizy impulsowej jak i EP Przyjęcie założeń o konkurencyjności procesów przeniesienia protonów ze środowiska (k H ) i z grupy aminowej (k ) do rodnika hydroksysulfuranylowego (schemat 3), oraz że stałe szybkości przeniesienia protonów środowiska (k H ) i molowe współczynniki kationorodników dimerowych z międzycząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym w Met i AcMet nie powinny się zasadniczo różnić, pozwala obliczyć stałą szybkości (k ) w metioninie ze wzoru (XXIII): 1 Molowy współczynnik absorpcji kationorodnika ( N) ε 390 = 4600/200 dm 3 mol 1 cm 1 wyznaczyłem z widma otrzymanego w roztworze MetMe (2 * 10 3 mol dm 3, ph 6,7) 2 µs po impulsie, przy założeniu 80% konwersji rodników H, wygenerowanych podczas napromieniania, w kationorodniki ( N) (G(( N) ) = 0,8 * G(H) ph 6,7 = 4,6) MetMe został wybrany dlatego, że w wyniku zablokowania grupy karboksylowej przez estryfikację jest w nim zahamowana dekarboksylacja i w konsekwencji jest spowolniony zanik kationorodnika z wiązaniem N Połówkowy czas życia kationorodnika z wiązaniem N w MetMe wynosi τ 1/2 > 300 µs a w Met τ 1/2 ~ 200 ns Procent konwersji wynika z przyjęcia za Hiller i in 1981, że około 20% wygenerowanych w układzie rodników hydroksylowych reaguje z aminokwasem poprzez oderwanie wodoru od węgla w pozycji α do siarki tioeterowej 2 Molowy współczynnik absorpcji kationorodnika ( ) ε 490 = 8600/200 dm 3 mol 1 cm 1 wyznaczyłem z widma otrzymanego w roztworze AcMetMe (2 * 10 3 mol dm 3, ph 1) 2 µs po impulsie (rysunek 3224 krzywa b), przy założeniu 80% konwersji rodników H wygenerowanych podczas napromieniania w kationorodniki ( ) (G(( ) ) = 0,8 * G(H) ph 1 = 2,3) AcMet Me został wybrany ponieważ nie występuje w nim reakcja prowadząca do kationorodnika z wiązaniem N oraz reakcja dekarboksylacji

4 109 k G(( N) ) Met = k k [ H ] G(( N) ) G(( ) ) H 3 Met Met (XXIII) gdzie: k stała szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu z grupy aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego], k H stała szybkości przeniesienia protonu środowiska do rodnika hydroksysulfuranylowego, [H 3 ] stężenie protonów, G(( N) ) wydajność chemoradiacyjna kationorodników z wiązaniem N, G(( ) ) wydajność chemoradiacyjna kationorodników dimerowych z wiązaniem Przyjmując G(( N) ) = G(( ) ) G(( ) ) otrzymujemy: Met Ac Met Met k G(( ) ) Met = 1 (XXIV) k k [ H ] G(( ) ) H 3 Ac Met Podstawiając do wzoru (XXIV) [H 3 ] = 0,1 mol dm 3, G(( ) ) Met )/G(( )) Ac = 0,62 (rysunki 4221 krzywa b i 4222 krzywa b) oraz wartość k = 2,52 Met H * 1010 mol 1 dm 3 s 1 (uzyskaną dla AcMet (tabela 5)) otrzymujemy: k 1,6 * 109 s 1 tałą szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu z grupy aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego (k ) można wyznaczyć na niezależnej drodze, wykorzystując wyniki uzyskane dla estru metylowego metioniny (MetMe) 3 Wydajności chemoradiacyjne powstawania kationorodników G(( ) ) i G(( N) ) są równe gdy szybkości ich powstawania są równe, tj gdy spełniona jest zależność (XXV) k = k H [H 3 ] (XXV) Korzystając z wykresów na rysunku 431 można stwierdzić, że zależność (XXV) jest spełniona dla MetMe w ph 1,15, co pozwala na obliczenie stałej szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu: k 1,8 * 10 9 s 1 3 Patrz przypis 16

5 110 Uzyskana wartość stałej szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu (k ) jest w bardzo dobrej zgodności z wartością obliczoną na podstawie różnic w wydajnościach chemoradiacyjnych kationorodników dimerowych z wiązaniem w Met i AcMet, co potwierdza słuszność przyjętych wcześniej założeń dotczących stałych szybkości k H i molowych współczynników absorpcji kationorodników dimerowych w tych związkach b 08 G X /G H a ph ys 431 Wydajność kationorodników dimerowych z wiązaniem mierzona w 490 nm (wyrażona jako G X /G H ) (a), i kationorodników z wiązaniem ( N) mierzona w 390 nm (wyrażona jak (G X /G H ) (b), dla 2 * 10 3 mol dm 3 roztworach MetMe nasyconych N 2, w zależności od ph Przez analogię do procesów rodnikowych prowadzących do dekarboksylacji w metioninie i jej pochodnych obserwacja wysokiej wydajności dekarboksylacji w słabo kwaśnych i obojętnych roztworach metylocysteiny (rysunek 4238) sugeruje, że wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie protonu z protonowanej grupy aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego może mieć także istotne znaczenie w mechanizmie utleniania rodnikiem wodorotlenkowym alkilowych pochodnych cysteiny Proces ten zachodzi pomimo niestabilności pierścieni czteroczłonowych i związanych z tym trudności w powstawaniu kationorodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym N

6 111 chemat 4 k C H k H k d H H 2 H H 2 k H 2 N H 2 N k D α k ET2 H 2 N (αn) k ET1 Wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie protonu z grupy aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego (k, schemat 4) prowadzi do utlenienia azotu grupy aminowej i w konsekwencji do dekarboksylacji cząsteczki, poprzedzonej przeniesieniem elektronu z grupy karboksylowej do utlenionego centrum rodnikowego zlokalizowanego na atomie azotu (k ET1, schemat 4) 4 Dekarboksylacji towarzyszy wytworzenie rodników αaminoalkilowych, które następnie ulegają β fragmentacji (patrz punkt 433) Z kolei, procesy konkurujące z wewnątrzcząsteczkowym przeniesieniem protonu prowadzą do kationorodnika dimerowego ( ) (k, schemat 4), do monomerycznego kationorodnika > (k d, schemat 4), który znajduje się w zależnej od stężenia aminokwasu równowadze z 4 Wykonane eksperymenty nie dostarczyły bezpośrednich dowodów na powstawanie indywidów umieszczonych na schemacie 4 w nawiasach kwadratowych Jeśli nawet indywidua te powstają to mogą charakteryzować się bardzo krótkim czasem życia poza zasięgiem metod eksperymentalnych którymi dysponowałem

7 112 kationorodnikiem dimerowym (podobnie jak w innych tioeterach) oraz do powstania rodnika z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem pomiędzy siarką i tlenem (k C, schemat 4) (przez analogię z kwasami alkilotiokarboksylowymi zawierającymi grupy karboksylowe w pozycji β w stosunku do siarki punkt 421) Monomeryczny kationorodnik > zanika w procesie deprotonacji (k D, schemat 4), który prowadzi do rodników α(alkilotio)alkilowych (α) oraz w procesie wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia elektronu od grupy karboksylowej do utlenionego centrum rodnikowego zlokalizowanego na atomie siarki (k ET2, schemat 4) 5 pierając się na schemacie 4 stałą szybkości zaniku rodnika hydroksysulfuranylowego można opisać równaniem (XXVI): k exp = k d k H [H 3 ] k [] k C k (XXVI) Pseudopierwszorzędowa stała szybkości (k exp ) obliczona z kinetyki zaniku rodnika hydroksysulfuranylowego w stężonym roztworze metylocysteiny (5 * 10 2 mol dm 3 ) w ph 5,7 (rysunek 432) ma wartość 4,3 * 10 7 s G*ε (mol 1 dm 3 cm 1 ) czas (ns) ys 432 Kinetyka zaniku pasma absorpcji rodników hydroksysulfuranylowych zmierzona w λ max = 330 nm, w roztworze 5 * 10 2 mol dm 3 Cys(Me) w ph = 5,7 Brak wyraźnych pasm absorpcji z λ max = 390 nm i 480 nm, w słabo kwaśnych i obojętnych roztworach metylocysteiny (rysunki 4231, 4232), przypisanych odpowiednio rodnikom z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem i 5 becność tego procesu jest postulowana na bazie obserwacji dekarboksylacji w kwasie 3,3' tiodipropionowym, w którym obydwie grupy karboksylowe znajdują się w pozycji β w stosunku do siarki (rysunek 4216)

8 113 kationorodnikom dimerowym z międzycząsteczkowym wiązaniem, świadczy o niewielkim udziale procesów opisywanych stałymi szybkości k C i k Na podstawie danych kinetycznych dla kwasu 3metylotiopropionowego (tabela 4) możemy oszacować udział procesu wymiany anionu H przez drugą cząsteczkę aminokwasu k [] w 5 * 10 2 mol dm 3 Cys(Me) na ~10 7 s 1 Z kolei opierając się na wydajnościach chemoradiacyjnych rodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem i kationorodników dimerowych z międzycząsteczkowym wiązaniem otrzymanych dla różnych stężeń 3MTPA (rysunek 4212) oszacowana stała k C nie powinna być wyższa od 10 7 s 1 W rezultacie po uwzględnieniu w równaniu (XXVI) udziałów poszczególnych procesów 6 stałą szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu w metylocysteinie oszacowano na ~2 * 10 7 s 1 Zasadniczo podobny obraz widm absorpcji jak w metylo (rysunek 4232) i etylocysteinie obserwuje się w karboksymetylocysteinie (rysunek 4235) znacza to, że wprowadzenie do cząsteczki aminokwasu drugiej grupy karboksylowej zlokalizowanej w podstawniku w grupie tioeterowej nie zmienia zasadniczo obrazu procesów rodnikowych w aminokwasie Dodatkowym procesem, który potencjalnie może pojawić się po wprowadzeniu grupy karboksylowej zlokalizowanej na końcu cząsteczki jest wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie elektronu z końcowej grupy karboksylowej do kationorodnika > (k ET3, schemat 5) konkurujące z wewnątrzcząsteczkowym przeniesieniem elektronu z Nkońcowej grupy karboksylowej do kationorodnika > (k ET2, schemat 4) Następstwem zachodzenia pierwszego procesu jest dekarboksylacja na końcu cząsteczki aminokwasu z wytworzeniem rodników α(alkilotio)alkilowych (α) Z kolei następstwem drugiego procesu jest dekarboksylacja na Nkońcu cząsteczki aminokwasu prowadząca do rodników αaminoalkilowych (αn) ulegających β fragmentacji (patrz punkt 433) 6 Z danych kinetycznych (k d i k H ) dla tioeterów (Bobrowski i chöneich 1993) udział procesów spontanicznej dysocjacji i katalizowanej protonami środowiska eliminacji cząsteczki wody (ph 5,7) jest do zaniedbania

9 114 chemat C H k d H Ο Ο Ο Ο k ET3 H 2 C k C ET2 C2 2 H 2 C 2 Potwierdzeniem istotnego udziału wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia elektronu z końcowej grupy karboksylowej do kationorodnika > jest obserwacja wydajności kwantowej aldehydu octowego φ(ah) (produktu βfragmentacji rodników αaminoalkilowych) podczas utleniania Cys(Cm) trypletem 4 karboksybenzofenonu 8 (Goez i in 1996, ozwadowski 1996) tanowi ona zaledwie ~10% wydajności kwantowej φ( ) W tym aspekcie, komentarza wymaga obserwacja znacznie wyższych wydajności chemoradiacyjnych produktów βfragmentacji rodników α aminoalkilowych (tj aldehydu octowego i rodników alkilosulfanylowych) w stosunku do wydajności chemoradiacyjnych podczas utleniania Cys(Cm) 7 W odróżnieniu od metylocysteiny spontaniczna dysocjacja w karboksymetylocysteinie jest katalizowana grupą karboksylową w pozycji α do siarki podobnie jak w kwasach alkilotiokarboksylowych (2MTEA, 2,2'TDEA) (Bobrowski i in 1993) 8 Pierwotnym produktem utleniania aminokwasów tioeterowych przez tryplet 4 karboksybenzofenonu jest monomeryczny kationorodnik > (Bobrowski i in 1992)

10 115 rodnikiem wodorotlenkowym (G(Ah)/G( ) ~64% i G( )/G(C2 ) ~84%; na podstawie danych z tabeli 6) Świadczy to o znacznie wydajniejszym tworzeniu się rodników αaminoalkilowych, gdy prekursorem procesów rodnikowych prowadzących do ich utworzenia jest rodnik hydroksysulfuranylowy Zjawisko to nie miałoby miejsca, gdyby głównym kanałem reakcyjnym zaniku rodnika hydroksysulfuranylowego były procesy prowadzące do kationorodnika > bserwacje te można wyjaśnić uwzględniając istotny udział w tworzeniu rodników αaminoalkilowych wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu od grupy aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego (k, schemat 4) Fakt, że wydajność chemoradiacyjna dekarboksylacji G( ) jest wyraźnie wyższa od wydajności chemoradiacyjne rodników αaminoalkilowych G(αN) (zarówno w procesie inicjowanym fotochemicznie jak i radiacyjnie) świadczy, że dekarboksylacja w cząsteczce Cys(Cm) zachodzi na obu jej końcach Proces dekarboksylacji w bocznym łańcuchu aminokwasu jest bardzo wydajny, gdy prekursorem reakcji rodnikowych jest kationorodnik > zczególnego znaczenia nabiera w tej sytuacji szybkość wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu od grupy aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego Jej wielkość będzie decydować o tym w jakim stopniu cząsteczki alkilowych pochodnych cysteiny ulegną βfragmentacji, co jest bezpośrednio związane z wydajnością dekarboksylacji Nkońcowej grupy karboksylowej pierając się na schematach 4 i 5, stałą szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu w alkilowych pochodnych cysteiny można oszacować posługując się równaniem (XXVII): k k ET2 kz ket k k k GC ( ) αn 1 = = GC ( GC GC 2) ( 2) ( 2) 1 GC ( ) 2 ET3 2 Z αn α α 2 αn (XXVII) gdzie: k z = k d k [] k H [H 3 ] jest pseudopierwszorzędową stałą szybkości zaniku rodnika hydroksysulfuranylowego (bez procesu k ) w Cys(Cm) dla danego stężenia aminokwasu i protonów środowiska reakcji 9 ; k ET2 i k ET3 są odpowiednimi stałymi szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia elektronu w schemacie 5 ; 9 Wartość k z w Cys(Cm) nie powinna się zasadniczo różnić od stałej k z obliczonej z równania (XXI) dla danego stężenia kwasu alkilotiokarboksylowego i protonów w modelowym kwasie alkilotiokarboksylowym (2MTEA)

11 116 G( ) α i G( ) αn wydajności chemoradiacyjne dekarboksylacji odpowiednio na końcu i na Nkońcu cząsteczki Przyjmując że: GC ( 2) GC ( ) α 2 αn G ( ) Cys( Me) G ( ) Cys( Cm) (XXVIII) G ( ) Cys( Me) i k k ET2 k Ah φ ( ) φ( C ) Cys( Cm) ET2 ET3 2 Cys( Cm) (XXIX) gdzie: G( )Cys(Me), G( )Cys(Cm) wydajności chemoradiacyjne rodników alkilosulfanylowych w Cys(Me) i Cys(Cm), które odpowiadają wydajnościom produktu utleniania kwasu askorbinowego przez te rodniki tj G( ) G(VC ), φ (Ah) Cys(Cm) i φ( ) Cys(Cm) wydajności kwantowe powstawania aldehydu octowego i w Cys(Cm) i przekształcając równanie (XXVII) otrzymujemy: k α [ ( )] 2 α 2 Cys( Cm) 2 αn GC Ah N Cys Cm GC = kz * ( ) φ( ) 2 α ( ) ( 2) * 1 * 1 GC ( ) φ( C ) GC ( ) (XXX) W roztworze Cys(Cm) o stężeniu 3 * 10 2 mol dm 3 w ph 5,8 10 obliczona wartość k z (na podstawie danych z tabeli 4) wynosi 8,2 * 10 6 s 1 Wykorzystując równanie (XXVII) i wydajności chemoradiacyjne utleniania kwasu askorbinowego G(VC ) w roztworach Cys(Me) i Cys(Cm) (tabela 6) otrzymujemy wartość G( ) α /G( ) αn = 0,17 Z kolei, korzystając z równania (XXIX) oraz zmierzonych wydajności kwantowych φ(ah) Cys(Cm) = 0,06 i φ( ) Cys(Cm) = 0,59 w roztworach zawierających 2 * 10 2 mol dm 3 Cys(Cm) i 2 * 10 3 mol dm 3 4karboksybenzofenonu w ph 6,8 (ozwadowski 1996) φ(ah) Cys(Cm) /φ( ) Cys(Cm) = 0,1 Podstawiając obliczone wartości do równania (XXX) otrzymujemy wartość stałej szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu w alkilowych pochodnych cysteiny: k 4,2 * 107 s 1 10 Wszystkie pomiary wydajności chemoradiacyjnych, aldehydów i produktów utleniania kwasu askorbinowego były przeprowadzone w roztworach o stężeniu 3 5 * 10 2 mol dm 3 w ph 5,8 Zapewniło to we wszystkich eksperymentach podobny udział reakcji podstawienia H przez drugą cząsteczkę aminokwasu (k []) oraz niewielki udział katalizowanej protonami reakcji eliminacji cząsteczki woody (k H [H 3 ])

12 117 Kationorodniki z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym pomiędzy siarką i azotem, w ph zbliżonym do obojętnego, powstają w homometioninie z wydajnością znacznie niższą (rysunek 4241) od obserwowanej w metioninie (rysunek 4221) Może to wynikać z faktu, że sześcioczłonowa konformacja konieczna do utworzenia kationorodnika cyklicznego ( N) tworzy się znacznie wolniej (k C1, schemat 6) od konformacji pięcioczłonowej kationorodnika cyklicznego ( N) w metioninie W konsekwencji powstający kationorodnik ze zlokalizowanym miejscem rodnikowym na azocie zanika w szybkim procesie wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia elektronu (k ET1, schemat 6) i następującej po nim dekarboksylacji Z kolei w ph 1, brak kationorodnika z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym pomiędzy siarką i azotem (rysunek 4241) można wyjaśnić niższą wartością stałej szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia elektronu (k, schemat 6) w porównaniu z wartością (k ) w metioninie (schemat 2) W tej sytuacji dominujący udział w zaniku rodnika hydroksysulfuranylowego w homometioninie ma katalizowana protonami środowiska reakcja eliminacji cząsteczki wody (k H, schemat 6) prowadząc do monomerycznego kationorodnika > chemat 6 H 3 C H H 2 (H ) k H 2 H 3 C C 2 2 (H ) k H H 3 2 H 2 H 3 C (H ) k C1 H k ET1 C 2 (H ) H 3 C 3 H 3 C C 2 (H ) H 3 C C 2 2 (H ) H 3 C 2

13 118 Zakładając, że prekursorem procesu dekarboksylacji w homometioninie jest wyłącznie utlenione centrum rodnikowe zlokalizowane na atomie azotu 11 oraz wykorzystując znajomość wydajności chemoradiacyjnych kationorodników dimerowych G(( ) ) i dekarboksylacji (G( ) można podjąć próbę oszacowania stałej szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu k w homometioninie można oszacować w oparciu o równanie (XXXI): k = k k [ H ] H G( ) G( ) G(( ) ) (XXXI) gdzie: k stała szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu z grupy aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego, k H stała szybkości przeniesienia protonu środowiska do rodnika hydroksysulfuranylowego 12, [H 3 ] stężenie protonów, G( 2 ) wydajność chemoradiacyjna utleniania azotu w procesie wewnątrzcząsteczkowym, G(( ) ) wydajność chemoradiacyjna powstawania kationorodników dimerowych ( ) Z widma absorpcji kationorodnika dimerowego ( ) (rysunek 4241) otrzymanego w roztworze homometioniny (2 * 10 3 mol dm 3, ph 1) 13 obliczona wydajność chemoradiacyjna G(( ) ) wynosi 2,1 14 Przyjmując, podobnie jak w metioninie, że 20% rodników wodorotlenkowych reaguje z homometioniną poprzez oderwanie wodoru z łańcucha alifatycznego, oszacowana wartość G( 2 ) = 0,2 Podstawiając powyższe wartości do wzoru (XXXI) otrzymujemy: k 2,5 * 108 s 1 11 Bezpośrednie przeniesienie elektronu z grupu karboksylowej do utlenionego centrum siarkowego wzdłuż sześcioczłonowego łańcucha jest do zaniedbania Dowodem na to jest obserwacja bardzo niskiej wydajności kwantowej dekarboksylacji φ( ) = 0,03 podczas utleniania homometioniny trypletem 4karboksybenzofenonu (ozwadowski 1996) 12 Przyjęto k H = 2,52 * mol 1 dm 3 s 1 uzyskaną dla AcMet, która dla homometioniny powinna mieć zbliżoną wartość 13 bliczona ze wzoru (XIII) wydajność chemoradiacyjna rodników H reagujących z aminokwasem o stężeniu 2 * 10 3 mol dm 3 w ph 1 wynosi G(H) sum 2,9 14 Korzystając z molowego współczynnika absorpcji kationorodnika dimerowego ( ) ε 490 = 8600/200 dm 3 mol 1 cm 1 wyznaczonego dla pochodnych metioniny

14 119 Z kolei, wykorzystując zmierzoną wydajność chemoradiacyjną dekarboksylacji G( ) = 0,4 w roztworze homometioniny (10 2 mol dm 3, ph 1) 15 (rysunek 4243 krzywa a) i przyjmując poprzednie założenia oszacowana wartość wydajności chemoradiacyjnej tworzącego się w tych warunkach kationorodnika dimerowego ( ) wynosi 2,25 Podstawiając powyższe wartości do wzoru (XXX) otrzymujemy: k 4,7 * 108 s 1 Porównanie wartości stałych szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu od protonowanej grupy aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego pokazuje wyraźnie, że stałe szybkości k rosną w szeregu: alkilowe pochodne cysteiny (k 3 * 10 7 s 1 ) < homometionina (k 3,6 * 10 8 s 1 (średnia)) < metionina (k 1,7 * 10 9 s 1 ) bserwowany trend w wartościach k pokrywa się wyraźnie z jednocześnie rosnącymi wydajnościami chemoradiacyjnymi kationorodników z wewnątrzcząsteczkowymi wiązaniami N Energia stabilizacji tego typu rodników może być jednym z czynników zwiększających siłę napędową reakcji przeniesienia protonu (alkilowe pochodne cysteiny i metionina) Nie można również wykluczyć roli czynnika konformacyjnego w cyklicznej strukturze wewnątrz której następuje przeniesienia protonu W tego typu strukturach ważną rolę mogą odgrywać wiązania wodorowe, które mogą stabilizować lub destabilizować konformacje wewnątrz których preferowane jest przeniesienie protonu Wyjaśnienie tego problemu wymaga jednak intensywnych badań na układach modelowych, w których można zmieniać w sposób kontrolowany giętkość konformacyjną cząsteczki 432 Dekarboksylacja Wysoką wydajność dekarboksylacji obserwuje się dla wszystkich badanych aminokwasów tioeterowych iłą napędową procesu dekarboksylacji jest, jak już wspomniano, energia stabilizacji powstających w procesie rodników α aminoalkilowych (patrz tabela 8 punkt 62) bserwowana korelacja pomiędzy wydajnością chemoradiacyjną kationorodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym N (rysunek 433 krzywa c) a wydajnością chemoradiacyjną dekarboksylacji w 15 bliczona ze wzoru (XIII) wydajność chemoradiacyjna rodników H reagujących z aminokwasem o stężeniu 10 2 mol dm 3 w ph 1 wynosi G(H) sum 3,3

15 120 metioninie (rysunek 433 krzywa a) dowodzi, że kationorodniki te są prekursorami dekarboksylacji (schemat 7) c 08 a G X /G H b ph ys 433 Wydajność (wyrażona jako G x /G H ) dla Met (a) i AcMet (b) oraz wydajność kationorodników ( N) dla Met mierzona w 390 nm 16 (wyrażona jako G x /G H ) (c) w 2 * 10 3 mol dm 3 nasyconych N 2 roztworach aminokwasów, w zależności od ph (dla pomiarów zakresie ph 0 3,5 stężenia badanych związków wynosiło 10 2 mol dm 3 ) 16 bserwowana wydajność kationorodnika ( N) nie jest wydajnością pełną, ponieważ k1 k2 powstaje on jako produkt przejściowy w reakcji następczej typu A B C Dlatego wartości G(( N) ) ph zostały obliczone przy hipotetycznym założeniu, że kationorodnik ( N) nie zanika tj stała szybkości k 2 = 0 dpowiednie wielkości zostały uzyskane z dopasowania numerycznego funkcji [B] t = f(t) (XXXII) do przebiegów doświadczalnych G * ε(λ 390nm ) t = f(t) ównanie (XXXII) opisuje wielkość stężenia produktu przejściowego dla dwu następujących po sobie reakcji pierwszego rzędu (Capellos i Bielski 1972, chwetlick 1975, Emanuel i Knorre 1984) [ A] 0k1 [ B] ( ) k k e kt 1 e kt 2 t= (XXXII) 2 1 gdzie: [B] t stężenie produktu przejściowego B (( N) ) po czasie t, [A] 0 stężenie początkowe substratu A (rodnika hydroksysulfuranylowego), k 1 i k 2 stałe szybkości powstawania i zaniku produktu przejściowego [s 1 ] Wartości G(( N) ) * ε otrzymuje się gdy w równaniu (XXXI) podstawimy k 2 = 0, wtedy dla czasu t = t G(( N) ) * ε = [B] t = [A] 0

16 121 chemat 7 H 2 N H 2 N (( N) ) k ET1 H 2 N k dec H 2 N (αn) Wyznaczenie stałej szybkości najwolniejszego etapu limitującego szybkość powstawania rodników αaminoalkilowych w metioninie jest możliwe wykorzystując reakcję z pnitroacetofenonem (reakcja 37, punkt 422) Zależność pseudopierwszorzędowej stałej szybkości powstawania anionorodnika PNAP wykazuje dla wysokich stężeń PNAP wyraźne odchylenie od liniowości (rysunek 434) znacza to, że proces prowadzący do powstawania rodników α aminoalkilowych jest procesem limitującym 17 powstawanie PNAP Z wartości plateau oszacowana stała szybkości najwolniejszego etapu decydującego o szybkości powstawania rodników αaminoalkilowych wynosi 2,5 * 10 6 s 1 Z kolei obliczona wartość stałej szybkości zaniku kationorodnika ( N) zmierzona bezpośrednio w maksimum absoprcji λ max = 390 nm (rysunek 435) wynosi 3,8 * 10 6 s 1 Świadczy to, że reakcją limitującą szybkość powstawania rodników αaminoalkilowych w metioninie nie jest otwarcie pięcioczłonowego pierścienia kationorodnika ( N) Na podstawie dotychczasowych danych eksperymentalnych nie można jednak jednoznacznie stwierdzić, która z reakcji (reakcja wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia elektronu k ET1 czy reakcja homolitycznego pęknięcia wiązania węgielwęgiel k dec, schemat 7) decyduje o szybkości całego procesu 17 Patrz przypis 6 punkt 421

17 k exp *10 6 (s 1 ) [PNAP]*10 4 (mol dm 3 ) ys 434 Zależność stałej szybkości powstawania anionorodnika PNAP w 2 * 10 2 mol dm 3 roztworze Met nasyconym N 2 w ph 6, od stężenia pnitroacetofenonu [PNAP] G*ε (mol 1 dm 3 cm 1 ) czas (µ s) ys 435 Kinetyka zaniku pasma absorpcji kationorodników ( N) zmierzona w λ max = 390 nm, w roztworze 5 * 10 2 mol dm 3 Met o ph = 5,9 Bardzo wydajna dekarboksylacja zachodzi także w alkilowych pochodnych cysteiny (krzywe a w rysunkach: 4238, 4239 i 42310) pomimo nieobserwowania kationorodników z wewnątrzcząsteczkowymi wiązaniami trójelektronowymi N wśród produktów przejściowych utleniania Prowadzą do niej procesy przedstawione na schematach 4 i 5 Na uwagę zasługuje obserwacja stosunkowo wysokiej wydajności dekarboksylacji w Nacetylometioninie (patrz rysunki 4227 krzywa c i 433

18 123 krzywa b) mimo braku możliwości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu od grupy aminowej i utlenienia atomu azotu Najbardziej prawdopodobnym mechanizmem dekarboksylacji tej cząsteczki jest mechanizm typu pseudo Kolbego Fragmentacja rodników αaminoalkilowych odniki αaminoalkilowe, powstające w liniowych alkilowych pochodnych cysteiny w wyniku dekarboksylacji na Nkońcu cząsteczki, tylko w niewielkim stopniu redukują PNAP pomimo silnych własności redukujących wynikających z niskiego potencjału jonizacji (patrz tabela 8) Tworzenie się z jednej strony aldehydu octowego 19, a z drugiej identyfikacja rodników sulfanylowych ( ) świadczy o fragmentacji wiązania pomiędzy atomami węgla (C β ) i siarki Ten typ fragmentacji jest charakterystyczny dla rodników z miejscem rodnikowym zlokalizowanym na węglu i zawierających heteroatom w pozycji β (Huyser i Kellogg 1966 Huang i in 1974, Ito i Matsuda 1988, Fossey i in 1995, Baciocchi i in 1996) Zaproponowany mechanizm βfragmentacji dla rodników αaminoalkilowych przedstawiono na schemacie 8 H 2 C 2 chemat k f H 2 C H 2 VC VC H 2 C 2 C H 18 Patrz reakcja [28] 19 W tiaizoleucynie oberwowano tworzenie się aldehydu propionowego

19 124 W wyniku βfragmentacji (k f, schemat 8) powstają rodniki alkilosulfanylowe ( ) i odpowiednia winyloamina Winyloamina tautomeryzuje do odpowiedniej iminy, która ulega hydrolizie do odpowiedniego aldehydu (octowego lub propionowego) Mechanizm ten został potwierdzony poprzez identyfikację i ilościowe oznaczenie w produktach reakcji utleniania alkilowych pochodnych cysteiny rodnikiem wodorotlenkowym: rodników alkilosulfanylowych oraz aldehydów octowego i propionowego (dla tiaizoleucyny) odniki alkilosulfanylowe zostały zidentyfikowane pośrednio, wykorzystując ich własności utleniające, w reakcji z kwasem askorbinowym (patrz reakcja 38) Zmierzone stałe szybkości βfragmentacji rodników α aminoalkilowych znajdują się w przedziale (1,2 4,7) * 10 6 s 1 (Tabela 6) Energia aktywacji reakcji fragmentacji rodników α aminoalkilowych została oszacowana na około 54 kj mol 1 (Goez i in 1996, ozwadowski 1996) Przy założeniu, że reakcje fragmentacji (k f ) i redukcji PNAP (k (PNAPαN)) konkurują ze sobą (schemat 8) musi być spełniona zależność (XXXIII), z której można obliczyć stałą szybkości fragmentacji (k f ) rodników αaminoalkilowych k f G( C2) G( PNAP ) = k k [ PNAP] GC ( ) f ( PNAP αn) 2 (XXXIII) gdzie: k f stała szybkości fragmentacji rodników αaminoalkilowych, k (PNAPαN) stała szybkości reakcji rodników αaminoalkilowych z pnitracetofenonem PNAP, [PNAP] stężenie pnitroacetofenonu bliczenia wykonane dla metylocysteiny w ph ~6 prowadzą 20 do wartości k f ~ 2,4 * 10 6 s 1 Wartość ta jest w doskonałej zgodności z wartością k f zmierzoną bezpośrdnio z szybkości zaniku pasma absorpcji w λ max = 260 nm (tabela 6) Ten fakt wyjaśnia przyczynę niskiej wydajności chemoradiacyjnej G(PNAP ) w roztworach zawierających alkilowe pochodne cysteiny Ważnym czynnikiem wpływającym na szybkość βfragmentacji jest entalpia tworzenia powstających produktów rodnikowych i cząsteczkowych (Fossey i in 20 Do obliczeń przyjęto następujące wielkości: G( ) = 5,9, G(PNAP ) = 0,16 (z rysunku 4234), [PNAP] = 3 * 10 5 mol dm 3 oraz wartość k = 2,39 (PNAPαN) * 109 mol 1 dm 3 s 1 obliczoną dla metioniny z tg nachylenia prostej (rysunek 434) w zakresie niskich stężeń PNAP Ze względu na zbliżone potencjały joniazcji (IP) rodników αaminoalkilowych stałe szybkości redukcji PNAP (k (PNAPαN)) w metioninie i pochodnych cysteiny nie powinny różnić się zasadniczo

20 ) eakcja fragmentacji rodników αaminoalkilowych w tiaizoleucynie, korzystniejsza energetycznie ze względu na entalpię tworzenia winyloaminy 21, zachodzi ze stałą szybkości (k f ) prawie dwukrotnie wyższą niż w metylocysteinie (tabela 6) Drugim istotnym czynnikiem wpływającym na szybkość βfragmentacji jest czynnik entropowy (Fossey i in 1995) Potwierdza to porównanie stałych szybkości fragmentacji (k f ) rodników αaminoalkilowych powstałych z metylocysteiny i tiaproliny (jej cyklicznego analogu) (tabela 6) Podobnie jak w innych procesach fragmentacji rodników szybkość procesu i w tym przypadku jest kontrolowana przez entropię, która wzrasta wraz ze zwiększającą się liczbą powstających w reakcji indywiduów chemicznych graniczenie (przez cyklizację) możliwości rozpadu cząsteczki na małe stabilne fragmenty w przypadku tiaproliny powoduje ponad trzydziestokrotne zmniejszenie stałej szybkości fragmentacji w stosunku do Cys(Me) 434 Tworzenie wewnątrzcząsteczkowych wiązań trójelektronowych Jedną z ważniejszych dróg zaniku rodnika hydroksysulfuranylowego w aminokwasach jest tworzenie indywiduów przejściowych z wewnątrz i międzycząsteczkowymi wiązaniami trójelektronowymi Wydajność procesów prowadzących do wewnątrzcząsteczkowych wiązań typu N i jest ściśle uwarunkowana geometrią cząsteczki aminokwasu (związaną z liczbą wiązań kowalencyjnych oddzielających atom siarki i heteroatom), liczbą grup funkcyjnych (aminowych i karboksylowych) w cząsteczce aminokwasu, oraz steżęniem aminokwasu i protonów w środowisku reakcji zczególnie uprzywilejowaną konformacją kationorodników i rodników z wiązaniami trójelektronowymi jest pięcioczłonowa struktura cykliczna Potwierdzają to obserwacje wydajności kationorodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym pomiędzy siarką i azotem w metioninie i jej pochodnych (rysunki: 4221, 4223, 4242) oraz rodników i kationorodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym pomiędzy siarką i tlenem w metylocysteinie (rysunek 4231) i jej pochodnych (rysunki: 4236, 4237) oraz alkiloglutationach (rysunki: 4252 i 4254) 21 bliczone metodą AM1 entalpie tworzenia ( H f ) winyloamin 2 = 2 i 3 = 2 wynosząd odpowiednio 11,4 i 1,6 kcal mol 1

21 126 eakcja prowadząca do wewnątrzcząsteczkowego wiązania trójelektronowego pomiędzy siarką i azotem ma istotny udział w procesie zaniku rodnika hydroksysulfuranylowego w warunkach niskiego stężenia protonów środowiska reakcji oraz niskiego stężenia aminokwasu Jest to zrozumiałe w świetle mechanizmu przedstawionego na schemacie 2 W tych warunkach jest faworyzowana reakcja wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu od grupy aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego (k ) Z kolei podwyższenie stężenia protonów oraz stężenia aminokwasu prowadzi odpowiednio do monomerycznego kationorodnika > oraz dimerowego kationorodnika z międzycząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym, co przy jednoczesnej obecności protonowanej grupy aminowej w cząsteczce aminokwasu (niedostępna wolna para elektronów na atomie azotu) uniemożliwia utworzenie wewnątrzcząsteczkowego wiązania trójelektronowego ( N) eakcja prowadząca do wewnątrzcząsteczkowego wiązania trójelektronowego pomiędzy siarką i tlenem ma istotny udział w warunkach wysokiego stężenia protonów środowiska reakcji oraz niskiego stężenia aminokwasu Jest to szczególnie widoczne dla metylocysteiny i jej pochodnych W niskim ph rodnik hydroksysulfuranylowy zanika głównie w katalizowanej protonami reakcji eliminacji cząsteczki wody, która prowadzi do monomerycznego kationorodnika > Jednoczesna dostępność wolnej pary elektronowej na atomie tlenu i niskie stężeniu aminokwasu (zmniejszające udział procesu międzycząsteczkowego prowadzącego do dimerowego kationorodnika z wiązaniem trójelektronowym ) stwarza optymalne warunki do wytworzenia rodnika z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem Podwyższenie ph roztworu, czego konsekwencją jest wydłużenie czasu życia rodnika hydroksysulfuranylowego, zwiększa udział konkurencyjnej reakcji wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu prowadzącej do rodników ### aminoalkilowych (rysunki: 4231, 4232 i 4236) Wpływ liczby grup funkcyjnych w cząsteczce aminokwasu na kierunek reakcji rodnikowych prowadzących do wewnątrzcząsteczkowych wiązań trójelektronowych można było doskonale prześledzić na przykładzie metylocysteiny i jej dwóch pochodnych: karboksyetylocysteiny i lantioniny Wyższą wydajność rodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem w karboksyetylocysteinie (rysunek 4236, krzywa b i c) w porównaniu z metylocysteiną (rysunek 4231, krzywa b i c), można wyjaśnić obecnością drugiej grupy karboksylowej znajdującej się w pozycji ### do siarki w cząsteczce aminokwasu Umożliwia to poza powstawaniem rodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem (struktura I) obecnych

22 127 również w metylocysteinie i karboksymetylocysteinie, powstawanie rodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem (struktura II) (H ) 2 C (H ) (I) (II) W niskim ph (~1) proces prowadzący do ich powstania skutecznie konkuruje z procesem prowadzącym do powstania dimerowego kationorodnika z międzycząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym (co przejawia się znacznie węższym pasmem absorpcji z λ max = 390 nm ze względu na nieobecność wyraźnego ramienia absorpcji w obszarze nm) Z kolei w wyższym ph (~3,9) proces prowadzący do ich powstania konkuruje z procesem wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu (k ) (co przejawia się pojawieniem pasma absorpcji z λ max = 390 nm) becność drugiej grupy aminowej w pozycji α do siarki, przy jednoczesnej obecności dwóch grup karboksylowych w pozycji α do siarki (lantionina) manifestuje się niższą wydajnością rodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem (rysunek 4237) w porównaniu do karboksyetylocysteiny (rysunek 4236), co świadczy o zwiększeniu się ponownie udziału reakcji wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu (k ) H H 2 N (H ) 2 C H H (H ) 435 Addycja rodnika wodorotlenkowego do nukleofilowego atomu azotu W cząsteczkach aminokwasów tioeterowych proces utleniania rodnikiem wodorotlenkowym, może być również inicjowany przez jego atak na nukleofilowy atom azotu w grupie aminowej Podobnie jak to ma miejsce w aminokwasach alifatycznych, reakcja ta może zachodzić wydajnie wtedy, gdy grupa aminowa jest deprotonowana, a wolna para elektronowa na azocie jest odsłonięta (tj w warunkach ph wyższego od pk a grupy aminowej (patrz tabela 7, punkt 61)) (Mönig i in 1985b, Bobrowski i in 1994a) Addycja rodnika H do deprotonowanej grupy aminowej

23 128 (k (H ), schemat 9) prowadzi bezpośrdnio do utleniania azotu i w konsekwencji do dekarboksylacji 22 poprzedzonej wewnątrzcząsteczkowym przeniesieniem elektronu z grupy karboksylowej do utlenionego centrum rodnikowego na azocie (k ET1, schemat 9) chemat 9 ( 2 )n 2 H k (H ) k (H N) H ( 2 )n 2 ( 2 )n H 2 k d H 2 ( 2 )n H 2 N ( 2 )n ( 2 )n H 2 k X k ET2 k ET1 (α) (αn) = 3, C 2 H 5 = 2 = 2 2 k X = k D k X = k ET3 k X = k C * Jest to struktrura hipotetyczna; można również postulować obecność rodnika iminowego będącego w równowadze kwasowozasadowej z kationorodnikiem 2 (Hug i in 1996) 22 Mechanizm ten jest odpowiedzialny za wysoką wydajność dekarboksylacji w aminokwasach alifatycznych w roztworach alkalicznych (Mönig i in 1985b, Bobrowski i in 1994a)

24 129 Pojawienie się tego kanału reakcji w roztworach alkalicznych tłumaczy wzrost wydajności redukcji pnitroacetofenonu w karboksymetylo, karboksyetylocysteinie (rysunek krzywe b i c), który jest odbiciem wzrostu wydajności chemoradiacyjnej rodników αaminoalkilowych tych związkach Zgodnie z mechanizmem przedstawionym na schemacie 9 jest to spowodowane zmniejszeniem udziału procesu wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia elektronu (k ET3 ), który prowdzi do rodników α(alkilotio)alkilowych (α ) eakcje rodnikowe w alkilowych pochodnych glutationu Przedstawione w rozdziale 425 wyniki badań alkilowych pochodnych glutationu metodą radiolizy impulsowej, uzupełnione przez wcześniejsze dane literaturowe (Bobrowski i in 1991) dotyczące wydajności chemoradiacyjnej dekarboksylacji, umożliwiły zaproponowanie mechanizmu reakcji, wyjaśniającego dotychczasowe obserwacje eksperymentalne w alkiloglutationach (reakcja [40] i schematy 10 i 11) Pomimo braku bezpośredniej obserwacji rodnika hydroksysulfuranylowego w alkiloglutationach, opierając się na danych literaturowych dotyczących reaktywności aminokwasów z rodnikiem wodorotlenkowym, przyjęto, że pierwotnym miejscem jego ataku w cząsteczce alkiloglutationu jest jednostka alkilocysteiny, a konkretnie jej grupa tioeterowa (reakcja [40]) 23 odniki α(alkilotio)alkilowe ze względu na niższy potencjał utlenianiaredukcji nie redukują PNAP (patrz rysunek 4216)

25 130 H 3 N 2 C 2 2 C C 2 2 H H 3 N 2 C 2 2 C C 2 2 H [40] Utworzony rodnik hydroksysulfuranylowy ulega dalszym reakcjom następczym, które zależą od warunków eksperymentalnych takich jak stężenie peptydu oraz ph roztworu W roztworach słabo kwaśnych i obojętnych istotny udział w zaniku rodnika hydroksysulfuranylowego ma reakcja wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu od grupy aminowej Nkońcowego kwasu glutaminowego do rodnika hydroksysulfuranylowego (schemat 10) chemat 10 2 C 2 2 C H 2 N H C 2 H 2 k H 2 H 2 C H 2 C C 2 2 C H 2 N C 2 H 2 C H 2 C H 2 N C 2 C 2 homolityczne pęknięcie wiązania CC H 2 C H 2 C 2 C H 2 N przeniesienie elektronu C 2 C 2

26 131 eakcja ta prowadzi do utworzenia kationorodnika z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym N, którego obecność zidentyfikowano w widmie absorpcyjnym w nanosekundowej skali czasowej (rysunek 4253) Indywiduum to jest w równowadze dynamicznej z kationorodnikiem 2, w którym wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie elektronu i homolityczne pęknięcie wiązania węgielwęgiel prowadzi w konsekwencji do dekarboksylacji cząsteczki z jednoczesnym utworzeniem rodników αaminoalkilowych Zarówno jak i rodniki αaminoalkilowe zostały zidentyfikowane jako produkty fragmentacji alkiloglutationów (Bobrowski i in 1991a) Fakt, że wyznaczone wydajności i rodników α aminoalkilowych były niższe od wydajności rodników wodorotlenkowych sugerował, że w cząsteczkach alkiloglutationów mają miejsce inne procesy rodnikowe, które konkurują z wewnątrzcząsteczkowym przeniesieniem protonu pierając się na mechanizmach utleniania rodnikami wodorotlenkowymi opracowanych dla aminokwasów tioeterowych takimi reakcjami konkurującymi mogą być: (i) reakcja spontanicznej dysocjacji rodnika hydroksysulfuranylowego (k d ), (ii) reakcja katalizowanej protonami środowiska eliminacji cząsteczki wody (k H ), (iii) oraz reakcja podstawienia anionu H przez drugą cząsteczkę peptydu (k ) (schemat 11) chemat 11 H 3 N 2 C 2 2 C C 2 H 2 k H 2 k d k H H H H 3 H 2 k H kc H 2 N 2 H 2 C C C 2 becność w widmie absorpcji alkiloglutationów zarówno w roztworach kwaśnych jak i obojętnych intensywnego długożyciowego pasma absorpcji z λ max = 390 nm,

27 132 przy jednoczesnym braku wyraźnej i charakterystycznej absorpcji kationorodników dimerowych z wiązaniem świadczy, że ważnym procesem konkurującym nie jest zgodnie z oczekiwaniami proces tworzenia kationorodnika dimerowego z wiązaniem lecz proces tworzenia kationorodnika z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym pomiędzy siarką i tlenem w wiązaniu peptydowym (k C, schemat 11) Przypisanie pasma absorpcji konkretnie temu indywiduum ma swoje uzasadnienie, poparte zarówno obserwacjami eksperymentalnymi jak i wcześniejszymi doniesieniami literaturowymi Po pierwsze, położenie maksimum i szerokość pasma absorpcji wskazywało, że jest to indywiduum z wiązaniem trójelektronowym pomiędzy siarką i tlenem; po drugie, względnie długi czas życia indywiduum wykluczał, że jest to atom tlenu z N lub Ckońcowej grupy karboksylowej; po trzecie, znacznie niższa wydajność tworzenia się tego indywiduum w Glu(MetGly), w którym taki kationorodnik miałby cykliczną strukturę sześcioczłonową; oraz po czwarte tego typu wiązania pomiędzy siarką i tlenem karbonylowym obserwowano w estrze metylowym kwasu 2 (metylotio)etanowego (Bobrowski i chöneich 1993) Jest to obserwacja interesująca, ponieważ pokazuje na ważną rolę wiązania peptydowego w stabilizacji utlenionego centrum zlokalizowanego na atomie siarki Zmniejszenie wydajności dekarboksylacji w alkilowych pochodnych glutationu wraz ze wzrostem własności elektrodonorowych podstawnika (nbu > Me) (Bobrowski 1990, Bobrowski i in 1991b) można wyjaśnić zwiększoną rezonansową stabilizacją protonowanej formy rodnika hydroksysulfuranylowego Prowadzi to w konsekwencji do zwiększonej wydajności monomerycznego kationorodnika > i następnie jego stabilizacji w wyniku utworzenia wewnątrzcząsteczkowego wiązania (k C, schemat 11) Proces ten zachodzi kosztem reakcji wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu prowadzącej do kationorodnika z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem N (k, schemat 11) Potwierdza to większy udział w widmie absorpcji Glu(Cys(nBu)Gly) (rysunek 4254,) pasm absorpcji przypisanych rodnikom z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem oraz rodnikom α (alkilotio)alkilowym w porównaniu do widma absorpcji w Glu(Cys(Me)Gly), gdzie istotny udział w krótkofalowym zakresie widma mają rodniki αaminoalkilowe (rysunek 4253)