Imię i nazwisko Uzyskane punkty Nr albumu data /3 podpis asystenta ĆWICZENIE 11 KWASY NUKLEINOWE Izolacja i oczyszczanie DNA jest kluczowym etapem większości procedur stosowanych w biologii molekularnej, diagnostyce i biochemii. Głównym celem tego etapu jest uzyskanie wysokiej jakości i czystości materiału biologicznego, niezaleŝnie od źródła jego pochodzenia. Wybór odpowiedniej metody izolacji zaleŝy od: rodzaju badanego kwasu nukleinowego jaki chcemy uzyskać (DNA genomowe, mitochondrialne, plazmidowe, RNA itd.), pochodzenia (roślinne, zwierzęce, bakteryjne, wirusowe itd.), rodzaju materiału z jakiego przeprowadzamy izolację (z tkanek, organu, hodowli komorkowej itd.), oczekiwanych rezultatow (czystość, jakość, czas izolacji itd.) przeznaczenia (PCR, klonowanie, itd.). Znanych jest wiele procedur izolacji DNA, w wyniku których otrzymuje się DNA biologicznie aktywne, chemicznie stabilne oraz wolne od RNA i białek. JednakŜe ze względu na wielkość i wraŝliwość chromosomalnego DNA praktycznie niemoŝliwa jest jego izolacja w formie niezmienionej. Część DNA ulega mechanicznym uszkodzeniom. Podczas izolacji DNA z komórki naleŝy wziąć pod uwagę następujące parametry, warunkujące zachowanie natywnej struktury DNA: 1. ph: wiązania wodorowe pomiędzy komplementarnymi łańcuchami są stabilne w środowisku o ph = 4 10, wiązania fosfodiestrowe w szkielecie DNA są trwałe w zakresie ph = 3 12, wiązania N-glikozydowe z zasadami purynowymi (adeniną i guaniną) ulegają hydrolizie przy ph < 3. 2. Temperatura: istnieją znaczne róŝnice w stabilności termicznej wiązań wodorowych w podwójnej helisie, ale większość DNA ulega rozpleceniu w temperaturze 80 90 C, N-glikozydowe i fosfodiestrowe są trwałe do 100 C. 3. Siła jonowa: DNA jest bardziej trwały i rozpuszczalny w roztworach soli, w stęŝeniu soli mniejszym niŝ 0,1M osłabiają się wiązania wodorowe pomiędzy komplementarnymi łańcuchami. 4. Warunki komórkowe: Przed uwolnieniem DNA konieczne jest rozbicie ściany komórkowej (komórki grzybowe, bakteryjne i in.) i liza błon komórkowych (komórki zwierzęce i in.); łatwość rozbicia ściany zaleŝy od rodzaju organizmu, w niektórych przypadkach konieczne jest intensywne ucieranie lub działanie ultradźwiękami (komórki droŝdŝy, tytoniu), podczas gdy w innych (E. coli) moŝliwa jest enzymatyczna hydroliza ściany komórkowej. W komórce występuje kilka enzymów, które hydrolizują DNA; najistotniejszymi z nich są deoksyrybonukleazy, które hydrolizują wiązania fosfodiestrowe. Ponadto natywny DNA występuje w komórkach w kompleksie z białkami (histony, helikazy, polimerazy i in.), białka te muszą być oddzielone podczas ekstrakcji. 5. Odporność mechaniczna DNA: Łagodne manipulowanie nie zawsze jest moŝliwe podczas izolacji DNA; ucieranie, wytrząsanie, mieszanie i inne czynności mechaniczne mogą spowodować rozszczepienie DNA, zwykle nie powoduje to zniszczenia drugorzędowej struktury DNA, ale zmniejsza długość cząsteczki (fragmentacja). Ocena wydajności izolacji Ocena uzyskanego DNA polega na spektrofotometrycznym pomiarze ilości uzyskanego kwasu. Preparat powinien zawierać około 1 mg DNA w 1 ml. Pomiar przeprowadza się długości fali λ = 260 nm i λ = 280 nm, jako odnośnik str. 1
stosując wodę do PCR, a następnie wyznacza się stosunek A 260nm /A 280nm. Wartości prawidłowe mieszczą się w zakresie 1,6 do 1,8. Wartości stosunku A 260nm /A 280nm < 1,6 świadczą o zanieczyszczeniu preparatu białkami, wartości > 1,8 o zanieczyszczeniu uŝywanymi odczynnikami. Zawartość DNA w roztworze określa wzór: zawartość DNA = A 260nm x 50 x R gdzie: A 260nm wartość absorbancji przy długości fali = 260 nm 50 1 jednostka absorbancji = 50 g dwuniciowego DNA 50 1 jednostka absorbancji = 50 g dwuniciowego DNA R rozcieńczenie. Doświadczenie 1 Cel: Izolacja i badanie składu DNA. Najczęściej wykorzystywanym do izolacji DNA materiałem jest pełna krew obwodowa. pobiera się od 1 do 5 ml krwi Ŝylnej. Aby zapobiec krzepnięciu, krew powinna być pobierana na EDTA (sól dwusodowa kwasu wersenowego), który chelatuje zarówno jony Ca 2+ (zapobiega krzepnięciu krwi), jak i hemoglobinę (inhibitor polimeraz DNA) oraz zapobiega degradacji DNA powodowanej obecnością DNAz. Główne etapy izolacji DNA z krwi obwodowej to: liza komórek nieposiadających jąder takich jak erytrocyty i ich odrzucenie z surowicą jako zbędne zanieczyszczenia. zebranie interesujących nas leukocytów, ich liza, oczyszczanie RNA-zą w celu usunięcia jednoniciowych kwasów nukleinowych, głownie RNA, oraz odbiałczanie w celu usunięcia białek histonowych i niehistonowych. wytrącanie DNA alkoholem izopropylowym. suszenie DNA na powietrzu. uwodnienie DNA, czyli przygotowanie próbki do analizy bądź przechowywania. roztwór do lizy krwinek czerwonych roztwór do lizy krwinek białych roztwór RNAzy A roztwór strącający białka 100% izopropanol 70% etanol roztwór do uwodnienia DNA 1.1. Izolacja DNA z pełnej krwi Ŝylnej Do izolacji DNA wykorzystuje się pełna krew Ŝylną pobraną do probówek zawierających EDTA w celu zapobiegniecia jej wykrzepianiu. Krew powinna być przechowywana w temperaturze około 4C w celu zapobiegania hemolizie. DNA izolowane jest z masy limfocytarnej uzyskanej w wyniku odwirowania krwi, po uprzedniej lizie erytrocytów i usunięciu nadmiaru hemolizatu. Liza komórek 1. Do probówki wirowniczej typu Falcon (poj. 15 ml) naleŝy dodać 4,5 ml Roztworu do lizy krwinek czerwonych, a następnie dodać 1,5 ml krwi. 2. Probówkę naleŝy odwrócić w celu wymieszania zawartości. 3. Próbkę naleŝy inkubować przez 3 min w temperaturze pokojowej. 4. Po inkubacji próbkę naleŝy ponownie zamieszać przez odwrócenie. 5. Próbkę proszę odwirować przy 2000 x g przez 10 min. str. 2
6. Po wirowaniu naleŝy usunąć supernatant pozostawiając ponad peletką białych krwinek ok. 100 µl supernatantu, a następnie mocno wytrząsnąć próbkę w celu rozproszenia komórek w płynie. 7. Do probówki naleŝy dodać 1,5 ml Roztworu do lizy krwinek białych aby rozproszyć komórki i pipetować góra-dół w celu wywołania lizy komórek. 8. Próbkę naleŝy inkubować w temperaturze 37 C przez 5 min. Oczyszczanie RNA-zą 1. Do poprzednio otrzymanej próbki proszę dodać 5 µl Roztworu RNAzy A i wymieszać zawartość przez 25-krotne obracanie probówki. 2. Próbkę naleŝy inkubować w temperaturze 37 C przez 15 min. Strącanie białek 1. Próbkę po inkubacji naleŝy schłodzić do temperatury pokojowej, a następnie dodać 0,5 ml Roztworu strącającego białka i wytrząsać próbkę na wysokich obrotach przez 20 sekund. 2. Następnie naleŝy odwirować próbkę przy 2000 x g przez 10 min. Strącone białka tworzą brązową peletkę. JeŜeli nie jest ona wyraźna naleŝy powtórzyć wytrząsanie, następnie inkubować w lodzie przez 5 minut i powtórnie odwirować próbkę. Strącanie DNA 1. Supernatant zawierający DNA naleŝy przenieść do czystej probówki wirowniczej typu Falcon o pojemności 15 ml zawierającej 1,5 ml 100% izopropanolu i zamieszać przez 50-krotne obracanie probówki. 2. Próbkę naleŝy odwirować przy prędkości 2000 x g przez 3 minuty DNA widać w postaci małej białej peletki. 3. Po wirowaniu proszę usunąć supernatant i szybko wysuszyć brzeg probówki poprzez zetknięcie z czystą bibułą filtracyjną. 4. Do probówki naleŝy dodać 1,5 ml 70% etanolu i kilkakrotnie wymieszać DNA poprzez wstrząsanie probówki. 5. Próbkę naleŝy następnie odwirować przy prędkości 2000 x g przez 1 minutę i dokładnie usunąć etanol (Uwaga! Peletka moŝe być luźna, więc etanol naleŝy usuwać powoli). 6. Po wirowaniu naleŝy odwrócić i wysuszyć probówkę na czystej bibule filtracyjnej a następnie dosuszyć w otwartym Falkonie, w bloku grzejnym w temperaturze 37 C, prz ez około 10 minut. Uwodnienie DNA 1. Do suchej pozostałości dodać 250 µl Roztworu do uwodnienia DNA. 2. Próbkę naleŝy inkubować w temperaturze 65 C przez 20 minut, okresowo stukając w probówkę w celu szybszego rozproszenia DNA. str. 3
1.2. Jakościowe oznaczanie deoksyrybozy Preparat DNA w odczynniku Dische go (stęŝ. H 2 SO 4, lodowaty CH 3 COOH i dwufenyloamina) w temperaturze 100 C ulega hydrolizie, a następnie deoksyryboza tworzy z dwufenyloaminą produkt kondensacji o barwie niebieskofioletowej. Postępowanie: NaleŜy przygotować 2 probówki i postępować wg schematu zamieszczonego w tabelce: Odczynniki 1 2 H 2 O 0.1 ml - DNA - 0.1 ml odczynnik Dische go Uwaga: substancja Ŝrąca i brudząca! 0.5 ml 0.5 ml Inkubacja w temp. 100 C 5 min. Doświadczenie 2 Cel: wykazanie obecności roŝnych wiązań przyłączających reszty fosforanowe w ATP. ATP to związek makroergiczny Pierwsza reszta trojfosforanowa w ATP (AMP~P~P) przyłączona jest do rybozy wiązaniem estrowym. Dwie kolejne reszty fosforanowe są przyłączone wiązaniami bezwodnikowymi. Są to wiązania wysokoenergetyczne, co oznacza, Ŝe podczas ich hydrolizy następuje zmiana energii swobodnej ( Go' zmiana wzorcowej energii swobodnej). W wyniku przemian metabolicznych z ATP powstaje AMP i dwie reszty fosforanowe. AMP~P~P + H 2 O => AMP~P + reszta fosforanowa (Pi) + energia Go' = -7,3 kcal. mol-1 AMP~P + H 2 O => AMP + reszta fosforanowa (Pi) + energia Go' = -7,1 kcal. mol-1 str. 4
Wiązania bezwodnikowe ulegają hydrolizie w 1 M HCl w temperaturze 100 C (ciśnienie atmosferyczne) w ciągu 7 minut. Do oznaczenia ilości fosforu w próbie stosuje się metodę Fiskego i Subbarowa. W środowisku kwasowym jony fosforanowe(v) reagują z molibdenianem amonu tworząc Ŝółtą sól - fosforomolibdenian amonu. Eikonogen redukuje powstałą sól do błękitu molibdenowego. NatęŜenie zabarwienia jest proporcjonalne do stęŝenia fosforu w próbie. Czułość metody 4-40 µg w 1 ml analizowanego roztworu. nie hydrolizowane ATP molibdenian amonu w 0,25 M H 2 SO 4 * molibdenian amonu w 1,25 M H 2 SO 4 * eikogen * naleŝy zachować ostroŝność, poniewaŝ roztwór jest silnie brudzący. W celu przeprowadzenia kwaśnej hydrolizy do jednej probówki (nr 1) naleŝy dodać 0,5 ml roztworu ATP i 0,5 ml 2 M roztworu HCl. Po zamieszaniu probówkę naleŝy wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 7 minut. Następnie proszę przygotować kolejne 3 probówki oznaczone jako 2, 3 i 4 i postępować wg schematu zamieszczonego w tabelce: odczynniki hydrolizat ATP (z probówki nr 1) 2 3 4 0.5 ml - - nie hydrolizowane ATP - 0.5 ml - H 2 O 2.0 ml 2.0 ml 2.5 ml molibdenian amonu* w 0,25 M H 2 SO 4 molibdenian amonu* w 1,25 M H 2 SO 4 0.5 ml - - - 0.5 ml 0.5 ml eikogen 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml Inkubacja w temperaturze 37 C przez 10 minut. Po wyjęciu z łaźni próby ochłodzić i zmierzyć ekstynkcję przy długości fali 660 nm. Uwaga: do probówki nr 2 dodawany jest roztwór molibdenianu amonu w 0,25 M H 2 SO 4, a do probówki nr 3 roztwór molibdenianu amonu w 1,5 M H 2 SO 4, poniewaŝ roztwór ATP w probówce nr 1 zawiera juŝ kwas solny. Obliczyć stęŝenie ATP (mmol/l) na podstawie zawartości fosforu w próbce, posługując się krzywą wzorcową. Masa cząsteczkowa fosforu wynosi 31. Wyliczenia i wnioski: str. 5
Doświadczenie 3 Cel: Wykrywanie składników RNA. Do dyspozycji jest gotowy, odpowiednio rozcieńczony, hydrolizat RNA. Hydrolizę prowadzono w 1 M HCl. 3.1. Wykrywanie puryn Puryny wykrywane są w hydrolizacie RNA doprowadzonym do ph 4, poniewaŝ w tym środowisku wodorosiarczan(iv) sodu (NaHSO 3 ) (kwaśny siarczyn sodu) redukuje jony Cu 2+ do jonów Cu +. Nowo powstałe jony miedzi(i) tworzą nierozpuszczalne sole z purynami. Daje to w probówce zawierającej purynę opalizujący, Ŝółtawy osad. hydrolizat RNA o ph 4 0,25 M roztwór CuSO 4 nasycony roztwór NaHSO 3 Przygotuj 2 probówki i postępuj wg schematu zamieszczonego w tabelce (waŝna jest kolejność dodawania odczynników): odczynniki 1 2 H 2 O 0.5 ml - hydrolizat RNA o ph 4-0.5 ml 0,25 M roztwór CuSO 4 0.1 ml 0.1 ml nasycony roztwór NaHSO 3 0.1 ml 0.1 ml str. 6
3.2. Wykrywanie puryn Cel: Wykrywanie rybozy wg metody Biala. Pentozy pod wpływem stęŝonego kwasu chlorowodorowego ulegają odwodornieniu do furfuralu, który w obecności jonów Ŝelaza(III) daje z orcyną kompleks o barwie zielonej lub zielono-niebieskiej. Ryboza połączona z zasadami purynowymi bierze udział w tej reakcji, a związana z pirymidynami - nie. hydrolizat RNA 10% roztwór orcynolu roztwór FeCl 3 w HCl Przygotuj 2 probówki, podpisz odpowiednio jako: 1 i 2. Do kolejnych probówek wprowadź odpowiednio: odczynniki 1 2 H 2 O 0.5 ml - hydrolizat RNA - 0.5 ml 10% roztwór orcynolu 0.2 ml 0.2 ml roztwór FeCl 3 w HCl 1.0 ml 1.0 ml Wymieszaj zawartość probówek i inkubuj w temperaturze 100 o C przez 5 minut. str. 7