Zestaw do izolacji plazmidowego DNA. Nr kat. EM01 Wersja zestawu:

Transkrypt

1 Zestaw do izolacji plazmidowego DNA Nr kat. EM01 Wersja zestawu:

2

3 Nr kat. EM01 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME PLASMID DNA przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji plazmidowego DNA o wysokiej czystości z rekombinantowych szczepów Escherichia coli. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia wysokiej wydajności i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do zastosowań badawczo-rozwojowych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU Liczba izolacji izolacje izolacji izolacji izolacji (DEMO) Nr katalogowy EM EM EM EM01-D Resuspension Buffer 12,5 ml 37,5 ml 62,5 ml 0,75 ml Lysis Buffer 12,5 ml 37,5 ml 62,5 ml 0,75 ml Neutralization Buffer 17,5 ml 52,5 ml 87,5 ml 1,05 ml Wash Buffer (conc.)* 13 ml 39 ml 65 ml 3,6 ml** Elution Buffer 10 ml 3 x 10 ml 5 x 10 ml 0,6 ml DNA Purification Columns 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Collection Tubes (2 ml) 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. *Przed pierwszym użyciem do roztworu Wash Buffer należy dodać odpowiednią ilość % etanolu (informacja na etykietach oraz w poniższej tabeli). Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki. **Uwaga: w zestawie DEMO (EM01-D) Wash Buffer zawiera już etanol. Resuspension Buffer należy przechowywać w temperaturze +4 C. Pozostałe składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15 25 C). Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność przez okres minimum 12 miesięcy. Liczba izolacji 50 izolacji 150 izolacji 250 izolacji Nr katalogowy EM EM EM Wash Buffer 13 ml 39 ml 65 ml Etanol % 52 ml 156 ml 260 ml Całkowita objętość 65 ml 195 ml 325 ml

4 III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT etanol % cz.d.a. jałowe próbówki wirownicze typu Eendorf (1,5 2 ml) pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet rękawiczki jednorazowe mikrowirówka z rotorem na probówki o obj. 1,5 2 ml (> 10 tys. rpm) termoblok lub łaźnia wodna (do 70 C) worteks IV. ZASADA IZOLACJI Procedura oczyszczania plazmidowego DNA przeprowadzana jest z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. W procesie izolacji plazmidowe DNA zostaje uwolnione z komórek bakteryjnych na zasadzie lizy alkalicznej. Następnie lizat jest neutralizowany, a pozostałości komórkowe wraz z białkami i genomowym DNA zostają usunięte podczas wirowania. Supernatant zawierający plazmidowe DNA przenoszony jest do minikolumny ze złożem. Dwuetapowe przemywanie DNA związanego do złoża minikolumny ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest z minikolumny buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą (ph 7,0 9,0) i gotowe jest do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, QPCR, sekwencjonowanie DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi, ligacja DNA itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia. V. KONTROLA JAKOŚCI Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME PLASMID DNA testowana jest według wewnętrznych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego DNA sprawdzana jest w reakcji PCR, QPCR oraz reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi.

5 Nr kat. EM01 VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU Materiał wyjściowy bakteryjna hodowla płynna Pojemność złoża ok. 25 µg DNA Czas izolacji ok. 25 minut Czystość DNA A 260/A280 = 1,8 2,0 VII. środki ostrożności Hodowla bakteryjna jest biologicznym materiałem niebezpiecznym ze względu na zawartość mikroorganizmów potencjalnie patogennych lub substancji zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Przy pracy z hodowlami mikroorganizmów należy stosować się do wymogów dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych. Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze II klasy bezpieczeństwa biologicznego lub przy palniku laboratoryjnym, używać ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych. Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladów DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami. Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem. W przypadku rozlania cieczy zawierającej mikroorganizmy, zanieczyszczoną powierzchnię zmyć roztworem detergentu.

6 VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI Materiał Wydajność izolacji i jakość wyizolowanego DNA mogą zależeć od: ilości kopii (kopijności) plazmidu, ilości komórek w materiale wyjściowym, rodzaju pożywki, fazy wzrostu, wieku i stanu komórek bakteryjnych. Zaleca się prowadzenie izolacji DNA ze świeżej, odpowiednio przygotowanej hodowli bakteryjnej, co gwarantuje najlepsze parametry izolacji. Możliwa jest także ekstrakcja plazmidowego DNA z mrożonych osadów bakteryjnych. Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania materiału przed izolacją. Użycie starej hodowli bądź wielokrotnie rozmrażanego materiału może skutkować niską wydajnością izolacji oraz słabą jakością DNA. Przygotowanie hodowli bakteryjnej Użycie kolonii ze świeżej hodowli jest istotne w celu uzyskania wydajnej izolacji plazmidów bez zanieczyszczeń genomowym DNA. Hodowlę bakteryjną należy odmłodzić poprzez wykonanie posiewu redukcyjnego na podłożu stałym Luria-Bertani (LB) Agar zawierającym odpowiednie antybiotyki. Po zakończeniu inkubacji należy pobrać z płytki pojedynczą kolonię bakteryjną, przenieść do płynnego podłoża LB (z dodatkiem odpowiednich antybiotyków) i inkubować w 37 C z intensywnym wytrząsaniem (ok. 200 rpm). Inkubację należy zakończyć, gdy gęstość hodowli osiąga wartość A 600 w granicach 2,0 5,0 (12 16 godzin). By zapewnić optymalne warunki mieszania i napowietrzania należy użyć naczynia o objętości co najmniej 4 razy większej niż objętość hodowli. Można użyć kolby z przegrodami zwiększającymi mieszanie i napowietrzanie. Elucja DNA ze złoża Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności od ilości materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego poziomu stężenia DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie μl Elution Buffer. Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć nawet do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że obniży to wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy podgrzać do 80 C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut. Jeśli istotne jest odzyskanie całkowitego DNA z minikolumny można prowadzić elucję w objętości 200 µl lub większej, spowoduje to jednak znaczne rozcieńczenie próby. Można także przeprowadzić dodatkową elucję (100 µl). W tym przypadku należy powtórzyć punkty Protokołu izolacji (sekcja XI), umieszczając minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. Elution Buffer nie zawiera EDTA, którego obecność może przeszkadzać w niektórych reakcjach enzymatycznych.

7 Nr kat. EM01 IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Optymalne parametry izolacji otrzymuje się dla osadów bakteryjnych sporządzonych z 1,5 3 ml hodowli. W niektórych przypadkach (np. niska gęstość hodowli bakteryjnej, plazmidy średnio- i niskokopijne) może zaistnieć konieczność zwiększenia objętości hodowli bakteryjnej. Izolacja plazmidów wysokokopijnych (np. puc, pbluescript, pgem, pjet, ptz i ich pochodne) Do izolacji plazmidów wysokokopijnych można stosować osad z hodowli bakteryjnej o objętości z zakresu 0,5 5 ml. Nie należy przekraczać 5 ml, ponieważ może to spowodować zatkanie złoża minikolumny, a nie wpłynie na wzrost wydajności. Izolacja plazmidów średnio- i niskokopijnych (np. pbr322, pet, pacyc, psc101 i ich pochodne, kosmidy) Do izolacji plazmidów średnio- i niskokopijnych można zwiększyć objętości hodowli bakteryjnej nawet do 10 ml w celu zwiększenia wydajności izolacji. Nie jest konieczna zmiana objętości buforów stosowanych do izolacji DNA. Uwaga: użycie większej objętości hodowli (> 10 ml) może spowodować zatkanie złoża minikolumny i obniżenie wydajności izolacji. X. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. Nie należy mieszać zbyt intensywnie buforu Lysis Buffer. 2. Należy upewnić się czy do Wash Buffer został dodany etanol. Jeśli nie, należy dodać odpowiednią ilość % etanolu (ilości podane są na etykietach oraz w tabeli w sekcji II). 3. W przypadku wytrącenia osadu w buforach Lysis Buffer, Binding Buffer lub Wash Buffer, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp C (Neutralization Buffer) lub 37 C (Lysis Buffer, Wash Buffer) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 4. Ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70 C. 5. Należy pamiętać, żeby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej, jeśli nie zalecono inaczej. 6. Wszystkie etapy wirowania zostały optymalizowane z wykorzystaniem mikrowirówki Eendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach rpm odnoszą się do tej mikrowirówki.

8 XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Zwirować 1,5 3 ml hodowli bakteryjnej przy 5 6 tys. rpm (3 4 tys. x g) przez 5 min. Możliwa jest zmiana objętości hodowli bakteryjnej w zakresie 0,5 10 ml. Więcej wskazówek znajduje się w sekcji IX. Przygotowanie próbki. 2. Supernatant zdekantować, a osad bakteryjny dokładnie zawiesić w 250 µl Resuspension Buffer przez pipetowanie lub worteksowanie. Niedokładne zawieszenie osadu może spowodować znaczne obniżenie wydajności izolacji. 3. Dodać 250 µl Lysis Buffer i wymieszać delikatnie poprzez kilkukrotne odwracanie probówki. Należy delikatnie wymieszać zawartość probówki, aby zapobiec fragmentacji chromosomalnego DNA. Nie worteksować! Po dodaniu Lysis Buffer próbka powinna być całkowicie klarowna, w przeciwnym razie należy inkubować próbkę w temp. pokojowej 1 2 min. Nie należy inkubować próbki dłużej niż 5 minut w celu uniknięcia uszkodzenia superzwiniętej formy CCC plazmidu. 4. Dodać 350 µl Neutralization Buffer i wymieszać delikatnie poprzez kilkukrotne odwracanie probówki. Należy delikatnie mieszać próbkę. Nie worteksować! Zmętnienie roztworu lub wytrącenie białego osadu jest efektem precypitacji białek i chromosomalnego DNA. 5. Wirować 10 min przy tys. rpm (15 21 tys. x g). 6. Ostrożnie przenieść supernatant do minikolumny umieszczonej w probówce odbierającej. Wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g). Należy uważać, aby przenieść do minikolumny jedynie supernatant zawierający plazmidowe DNA i nie naruszyć osadu zawierającego chromosomalne DNA i pozostałości komórkowe.

9 Nr kat. EM01 7. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml). 8. Dodać do minikolumny 600 μl Wash Buffer i wirować 30 s przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 9. Wylać przesącz z probówki odbierającej i ponownie umieścić w niej minikolumnę. 10. Powtórzyć etapy Wirować 2 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g). Etap wirowania na sucho ma na celu całkowite usunięcie resztek etanolu, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych. 12. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. 13. Nanieść μl Elution Buffer uprzednio podgrzanego do temp. 70 C centralnie na złoże w minikolumnie. Inkubować przez 2 min. Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie µl. Więcej wskazówek na temat elucji znajduje się w sekcji VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. 14. Wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 15. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać w temp. +4 C lub -20 C do czasu dalszych analiz.

10 XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE Problem Niska wydajność izolacji plazmidowego DNA. Niecałkowita liza komórek bakteryjnych. Prawdopodobna przyczyna Materiał o niskiej zawartości komórek bakteryjnych. Niecałkowita liza komórek bakteryjnych. Do izolacji użyto starej hodowli bakteryjnej. Niedodany etanol do buforu płuczącego. Niedokładne zdekantowanie supernatantu znad osadu bakteryjnego. Komórki bakteryjne nie zawierają plazmidu. Niecałkowite przeniesienie lizatu do minikolumny. Niewłaściwe ph buforu elucyjnego lub wody (ph <7,0). Niedokładnie zawieszony osad bakteryjny w Resuspension Buffer. Wytrącił się osad w Lysis Buffer. Lizat nie jest klarowny. Do izolacji użyto za dużą liczbę komórek. Rozwiązanie Zwiększyć objętość hodowli użytej do izolacji. Patrz sekcja IX. Przygotowanie próbki. Patrz Problem Niecałkowita liza komórek bakteryjnych. Prowadzić hodowlę w podłożu płynnym zawierającym odpowiednie antybiotyki nie dłużej niż 16 godzin. Upewnić się, że % etanol został dodany w odpowiedniej ilości do Wash Buffer. Dokładnie usunąć odwirowaną pożywkę znad osadu bakteryjnego przy pomocy pipety. Należy pamiętać o użyciu odpowiednich antybiotyków, zarówno do hodowli na podłożu stałym, jak i płynnym. Klarowny supernatant może zostać przelany do minikolumny, jednak najlepszą wydajność uzyskuje się przenosząc lizat za pomocą pipety. Do elucji użyć Elution Buffer. Po dodaniu Resuspension Buffer próbkę należy worteksować lub pipetować do momentu całkowitego rozbicia osadu. W temperaturze poniżej 20 C może wytrącać się osad. Należy podgrzać bufor w temp. 37 C do momentu rozpuszczenia osadu, a następnie delikatnie wymieszać i schłodzić do temp. pokojowej. Należy inkubować próbkę w temp. pokojowej 1 2 min. Nie należy inkubować próbki dłużej niż 5 min w celu uniknięcia uszkodzenia superzwiniętej formy CCC plazmidu. Użyć hodowli o gęstości A 600 5,0. Do izolacji należy stosować rekomendowane ilości hodowli bakteryjnej opisane w sekcji IX. Przygotowanie próbki.

11 Nr kat. EM01 Obecność RNA w próbce. Obecność genomowego DNA w próbce. Nieodpowiednie warunki przechowywania Resuspension Buffer. Doszło do fragmentacji genomowego DNA w trakcie lizy komórek bakteryjnych. Do izolacji użyto starej hodowli bakteryjnej. Resuspension Buffer zawiera RNazę, dlatego powinien być przechowywany w temp. +4 C. Nie worteksować próbki po dodaniu Lysis Buffer. Worteksowanie, a nawet gwałtowne mieszanie może spowodować fragmentację genomowego DNA i kontaminację oczyszczanego plazmidowego DNA. Prowadzić hodowlę w podłożu płynnym zawierającym odpowiednie antybiotyki nie dłużej niż 16 godzin. Zdenaturowane plazmidowe DNA. Zbyt długa inkubacja z Lysis Buffer. Nie należy inkubować próbki z Lysis Buffer dłużej niż 5 min przed dodaniem Neutralization Buffer. Niskie stężenie DNA w eluacie. Za duża objętość Elution Buffer. Objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć (sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi). Wyizolowane DNA jest niskiej czystości. Pominięto jeden z dwóch etapów płukania. Niecałkowite wysuszenie minikolumny z resztek buforu płuczącego. Do izolacji użyto starej hodowli bakteryjnej. Izolację należy powtórzyć, pamiętając o obu etapach płukania. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby po etapie wirowania na sucho (pkt.11 Protokołu izolacji) nie pozostały w minikolumnie resztki buforu płuczącego. Prowadzić hodowlę w podłożu płynnym zawierającym odpowiednie antybiotyki nie dłużej niż 16 godzin. Inhibicja enzymatycznej obróbki wyizolowanego DNA. Niedokładne zdekantowanie supernatantu znad osadu bakteryjnego. Obecność etanolu w próbce. Plazmidowe DNA uległo denaturacji. Niektóre podłoża zawierają składniki, które mogą obniżać czystość izolowanego DNA. Do izolacji plazmidowego DNA polecamy podłoże LB. W przypadku użycia innych podłoży należy osad zawiesić w buforze TE lub wodzie przed przystąpieniem do izolacji. Należy pamiętać o dokładnym usunięciu pożywki znad osadu bakteryjnego. Upewnić się, że po etapie wirowania na sucho nie pozostały w minikolumnie resztki buforu płuczącego, w przeciwnym wypadku należy powtórzyć wirowanie (pkt. 11 Protokołu izolacji). Patrz Problem Zdenaturowane plazmidowe DNA.

12 XIII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM RESUSPENSION BUFFER Uwaga H315, H319, H335 P261, P305+P351+P338 NEUTRALIZATION BUFFER Uwaga H302, H315, H319 P305+P351+P338 LYSIS BUFFER Niebezpieczeństwo H314, H315, H319 P280, P305+P351+P338, P310 WASH BUFFER BLIRT S.A., ul. Trzy Lipy 3/1.38, Gdańsk, T: F: E: info@dnagdansk.com Niebezpieczeństwo H225 P210 H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/ otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać.