Odczynnik do izolacji RNA z tkanek zwierzęcych, roślinnych oraz linii komórkowych

Transkrypt

1 Nr kat.: EM30-100, EM Wersja zestawu: Odczynnik do izolacji RNA z tkanek zwierzęcych, roślinnych oraz linii komórkowych EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A.

2 I. PRZEZNACZENIE ODCZYNNIKA EXTRAZOL Odczynnik do izolacji wysokiej jakości RNA z różnego rodzaju materiałów biologicznych, w tym tkanek zwierzęcych i roślinnych bogatych w polisacharydy i proteoglikany. Oczyszczone RNA może być przeznaczone w wielu aplikacjach downstream takich jak RT-PCR, hybrydyzacji czy translacji in vitro. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU EXTRAZOL może być przechowywany przez 12 miesięcy w temperaturze +4 C. III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT chloroform alkohol izopropylowy 75% etanol (w wodzie DEPC) woda DEPC jałowe probówki wirownicze typu Eendorf (1,5 2 ml) wolne od RNaz pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet (wolne od RNaz) mikrowirówka z rotorem na probówki o obj. 1,5 2 ml (> 11 tys. x g) rękawiczki jednorazowe worteks IV. ZASADA IZOLACJI Próbka biologiczna jest homogenizowana lub lizowana w EXTRAZOL-u, a następnie rozdzielana na fazę organiczną i wodną. RNA pozostaje w fazie wodnej i jest następnie precypitowane za pomocą alkoholu izopropylowego. V. KONTROLA JAKOŚCI Każda partia produkcyjna (LOT) odczynnika EXTRAZOL testowana jest według opracowanych procedur. Wydajność oraz efektywność izolacji i oczyszczania RNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego RNA sprawdzana jest w reakcji qpcr poprzedzonej reakcją odwrotnej transkrypcji. 3

3 VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU VIII. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI MATERIAŁ WYJŚCIOWY Tkanka świeża lub mrożona (najlepiej w temp. -80oC) mg na 1 ml EXTRAZOL-u Linie komórkowe 5x106 komórek na 1 ml EXTRAZOL-u WYDAJNOŚĆ IZOLACJI RNA Przykładowe wydajności izolacji RNA ze świeżego materiału biologicznego podane są w sekcji XI. CZAS IZOLACJI A. TKANKI STAŁE Zhomogenizować próbki tkanek w 1 ml EXTRAZOL na mg tkanki. Dla małych ilości tkanek (1-10 mg) dodać 800 µl EXTRAZOL. W przypadku próbek tkanki tłuszczowej, warstwa tłuszczu może akumulować się na powierzchni. Powinna ona zostać usunięta. Tkanki roślinne W przypadku tkanek roślinnych, po homogenizacji należy oddzielić nierozpuszczalne fragmenty poprzez wirowanie przy x g przez 10 minut w temperaturze 2-8 C. Następnie należy przenieść oczyszczony homogenizat do nowej probówki. około 1h CZYSTOŚĆ RNA A 260 /A 280 = 1,9-2,1 VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI B. LINIE KOMÓRKOWE Komórki w postaci monowarstwy Tkanki w postaci monowarstwy należy poddać lizie bezpośrednio na płytce bądź w butelce poprzez dodanie 1 ml EXTRAZOL na 10 cm 2 powierzchni wzrostu. Następnie należy rozpipetować lizat komórkowy kilkukrotnie w celu upewnienia się, że komórki zostały wydajnie zlizowane. Odczynnik jest toksyczny w kontakcie ze skórą i w przypadku połknięcia. Powoduje oparzenia. Tkanka jest biologicznym materiałem niebezpiecznym ze względu na potencjalną zawartość mikroorganizmów patogennych lub substancji zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Przy pracy z materiałem tkankowym należy stosować się do wymogów dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych. Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze II klasy bezpieczeństwa biologicznego lub przy palniku laboratoryjnym, używać ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych. Zalecane jest używanie jałowych końcówek do pipet z filtrami wolnymi od RNaz. Komórki w postaci zawiesiny Komórki w zawiesinie należy zwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie komórki należy zlizować w 1 ml EXTRAZOL na każde 5x10 6 komórek poprzez rozpipetowanie. W przypadku małych ilości komórek ( ) należy zlizować w 800 µl EXTRAZOL. Uwaga! Po tym etapie próbki mogą być przechowywane przez co najmniej miesiąc w temperaturze -60/-70 C. 4 5

4 IX. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Inkubować próbki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 2. Dodać 200 µl chloroformu na 1 ml użytego EXTRAZOL. 3. Dokładnie zamknąć probówkę i mieszać energicznie przez 15 sekund. 4. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. 5. Próbkę zwirować przy x g przez 15 minut (lub 2600 x g przez minut) w temperaturze 2-8 C. Próbka powinna rozdzielić się na jasnożółtą fazę organiczną (fenolchloroform), interfazę oraz bezbarwną fazę wodną zawierającą RNA. 6. Przenieść fazę wodną do nowej probówki typu eendorf. 11. Przemyć pelet 75% etanolem dodając co najmniej 1 ml etanolu na 1 ml użytego EXTRAZOL. 12. Próbkę zworteksować i zwirować przy 7500 x g przez 5 minut w temperaturze 2-8 C. Uwaga! Po tym etapie próbki mogą być przechowywane przez tydzień w temperaturze 2-8 C lub 12 miesięcy w temperaturze od -5 do -20 C. 13. Wysuszyć pelet przez 5-10 minut. 14. Rozpuścić w wodzie DEPC przez rozpipetowanie. 15. Inkubować przez 10 minut przez C 16. RNA przechowywać w temperaturze -70 C. 7. Zprecypitować RNA poprzez wymieszanie z alkoholem izopropylowym. Należy użyć 0,5 ml alkoholu izopropylowego na 1 ml EXTRAZOL. 8. Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej 9. Zwirować przy x g przez 10 minut (lub 2600 x g przez minut) w temperaturze 2-8 C. 10. Usunąć supernatant. 6 7

5 X. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE XI. PRZYKŁADOWE WYDAJNOŚCI IZOLACJI RNA ZE ŚWIEŻEGO MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO Problem Prawdopodobna przyczyna Rozwiązanie MATERIAŁ Masa/ilość Ilość RNA Kontaminacja DNA Niewystarczająca objętość użytego EXTRAzol-u Upewnić się, że 1 ml EXTRAzol-u został użyty na każde 10 cm 2 powierzchni komórek lub 5x10 6 komórek. Jeżeli problem pozostanie należy zwiększyć ilość EXTRAzol-u 1,5 x. Nerka 1 mg / 1x µg Wątroba 1 mg / 1x µg Niekompletna liza lub homogenizacja Kontaminacja warstwą interfazy podczas pobierania fazy wodnej zawierającej RNA Należy dokładnie zhomogenizować tkankę i zwirować w celu usunięcia nierozpuszczalnych cząstek. Rozpipetować lizat komórkowy do momentu uzyskania mniejszej lepkości. Należy bardzo ostrożnie pobrać fazę wodną uważając, aby nie pobrać interfazy. Zaleca się pozostawienie najniższej warstwy fazy wodnej tak, aby nie naruszyć interfazy. Komórki nabłonkowe 1 mg / 1x µg Komórki fibroblastyczne 1 mg / 1x µg Niska wydajność izolacji RNA Utrata peletu W przypadku niewielkiej ilości materiału wyjściowego pelet RNA może nie być widoczny po etapie precypitacji. Należy bardzo ostrożnie usunąć supernatant, tak by pelet RNA pozostał w probówce. Niekompletna liza lub homogenizacja Należy dokładnie zhomogenizować tkankę i zwirować w celu usunięcia nierozpuszczalnych cząstek. Rozpipetować lizat komórkowy do momentu uzyskania mniejszej lepkości. Niecałkowite rozpuszczenie peletu RNA Upewnić się, że pelet RNa został rozpuszczony w całości. Degradacja RNA Kontaminacja RNazami Procedura oczyszczania RNA musi być prowadzona w środowisku wolnym od DNA i RNaz. Upewnić się, że pipety, tipsy, probówki oraz miejsce pracy sa wolne od RNaz. Należy używać rękawiczek. Niewłaściwa homogenizacja. Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji. Opcjonalne trawienie DNazą po izolacji RNA. 8 9

6 XII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM EXTRAZOL Niebezpieczeństwo H302, H312, H315, H319, P273, P280, P305+P351+P338, P302+P352 H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/ otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P233 Przechowywać pojemnik szczelnie zamknięty. P273 Unikać uwolnienia do środowiska. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu / ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P302 + P352 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ NA SKÓRĘ: Umyć dużą ilością wody z mydłem. 10

7