BADANIE WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH AMINOKWASÓW

Transkrypt

1 BADANIE WŁAŚIWŚI FIZYKEMIZNY AMINKWASÓW IDENTYFIKAJA AMINKWASÓW BIAŁKA, JAK I WLNE AMINKWASY REAGUJĄ ZA PŚREDNITWEM GRUP: -N 2 I Z NINYDRYNĄ, DINITRFLURBENZENEM I KWASEM AZTWYM (III). WYSTĘPWANIE W STRUKTURZE AMINKWASÓW INNY GRUP FUNKYJNY, PRÓZ AMINWEJ I KARBKSYLWEJ, UMŻLIWIA IDENTYFIKAJĘ TY AMINKWASÓW NA PDSTAWIE ZUŁY REAKJI BARWNY. Reakcja biuretowa Nazwa pochodzi od biuretu, związku powstającego przy ogrzewaniu mocznika do 180. Reakcję biuretową dają wszystkie połączenia zawierające w cząsteczce co najmniej 2 grupy --N- połączone ze sobą bezpośrednio (np. w diamidzie kwasu szczawiowego N 2 ---N 2 ), poprzez azot (w biurecie) lub poprzez atom węgla (w diamidzie kwasu malonowego, bursztynowego, w produktach hydrolizy białek). W wyniku utworzenia połączenia koordynacyjnego u 2 z dwoma przyległymi wiązaniami -N- powstaje barwny produkt. Dodatniego odczynu reakcji biuretowej nie dają wolne aminokwasy i dipeptydy. Do 1 ml danej próby dodać 1 ml Na i kilka kropli 0,5% us 4 W obecności białka powstaje fioletowe zabarwienie. Uwaga: ponieważ niebieska barwa odczynnika może maskować właściwy odczyn należy unikać nadmiaru us 4. Reakcja ninhydrynowa Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu poprzez iminokwasy do amoniaku, dwutlenku węgla i aldehydu uboższego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji cząsteczki zredukowanej i utlenionej ninhydryny z amoniakiem powstaje niebiesko-fioletowe zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu aminowego aminokwasów. 1

2 R N 2 R N 2 2 ninhydryna zredukowana ninhydryna R N 2 R N 3 2N 3 N barwny kompleks 3 2 N 4 Do 1 ml próby badanej dodać 3-4 krople 0,1% roztworu ninhydryny w 50% etanolu. Po wymieszaniu próbę ogrzać do wrzenia. Wszystkie aminokwasy (oprócz proliny) reagują z ninhydryną tworząc niebieskie zabarwienie. Reakcja ksantoproteinowa Aminokwasy aromatyczne oraz fenole ulegają reakcji nitrowania w czasie ogrzewania ze stężonym N 3, dając żółto zabarwione pochodne nitrowe (fenyloalanina wymaga do nitrowania dodatku 2 S 4 ). 2 N N 3 2N 3 2 N Do 1 ml próby badanej dodać 0,5 ml stężonego N 3 i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez 2 min. Wytrąca się żółty osad. Reakcja Adamkiewicza Jest to reakcja charakterystyczna dla tryptofanu zawierającego pierścień indolowy. W obecności kwasu siarkowego i formaldehydu (kwas glioksalowy) dwie grupy indolowe ulegają kondensacji z wydzieleniem cząsteczki wody i dają barwny fioletowy związek. Schemat przebiegu reakcji: 2

3 Do 1 ml próby badanej dodać kilka kropli formaldehydu. Po wymieszaniu roztwór podwarstwić (po ściance) stężonym 2 S 4. Na granicy cieczy powstaje fioletowy pierścień. Reakcja Millona Reakcja na wykrywanie tyrozyny jest mało specyficzna, ponieważ dodatni wynik dają również związki zawierające reszty fenolowe. Do 1 ml próby badanej dodać kilka kropli odczynnika Millona. Mieszaninę ogrzewać w łaźni wodnej przez kilka minut. W przypadku obecności tyrozyny pojawia się biały osad, który zabarwia się na żółto, a później na czerwono (lub powstaje czerwone zabarwienie roztworu). Wykrywanie cysteiny i cystyny Zawarta w cysteinie i cystynie siarka w silnie zasadowym środowisku ulega uwolnieniu w postaci jonów siarczkowych, które z jonami Pb 2 dają czarny osad PbS. Metionina nie daje dodatniego wyniku w tej reakcji. Schemat przebiegu reakcji: N 2 2 S 3 2 S 2 N 3 2 Pb 2 S 2 Do 1 ml próby badanej dodać 1 ml roztworu octanu ołowiu i 3 ml 10% roztworu Na (roztwór powinien być klarowny). Próbkę ogrzewać na łaźni wodnej, po kilku minutach pojawia się czarny osad. PbS 3

4 Wykrywanie glutaminy Próba na obecność glutaminy wykorzystuje obecność w jej cząsteczce ugrupowania amidowego, z którego w warunkach hydrolizy zasadowej uwalnia się gazowy amoniak. Dodatni wynik tej reakcji dają też asparagina i sole amonowe. Do 3 ml próby badanej dodać 3 ml 10% Na (roztwór dodać do probówki pipetą, tak aby nie dotknąć jej wylotu). ałość umieścić we wrzącej łaźni wodnej a do wylotu probówki zbliżyć zwilżony uniwersalny papierek lakmusowy. W przypadku obecności glutaminy papierek zmienia zabarwienie na niebieski Uwaga: należy uważać, aby nie dotknąć papierkiem brzegu probówki. wówczas zmiana zabarwienia papierka następuje na skutek obecności Na a nie amoniaku. Wykrywanie argininy (reakcja Sakaguchiego) Związki zawierające grupę guanidynową (arginina) tworzą barwny czerwony związek w reakcji z -naftolem utlenionym przez bromian (I) lub chloran (I) sodu. Wydzielający się amoniak ulega dalszemu utlenianiu do wolnego azotu. Dłuższe działania bromianu (I) lub chloranu (I) na powstały barwny związek powoduje jego dalsze utlenienie i odbarwienie. Do 1 ml roztworu argininy dodać 0,5 ml 1 M Na i kilka kropel -naftolu oraz 2-3 krople roztworu chloranu (I) sodu. Powstająca czerwona barwa wskazuje na obecność argininy. 4

5 5