Oznaczanie RNA w materiale roślinnym

Transkrypt

1 znaczanie RA w materiale roślinnym rowadzący: mgr inż. Marta Grec

2 1. Wstęp teoretyczny RA oraz DA, nazywane kwasami nukleinowymi, są długimi liniowymi polimerami, w których monomery stanowią nukleotydy 1. Każdy z tych merów, który złożony jest z jednostki cukrowej β-d-rybozy (RA) oraz β-d-deoksyrybozy (DA) - związanej w pozycji 1 z zasadą purynową (adenina A, guanina G) lub pirymidynową (cytozyna C, tymina T w DA, uracyl U w RA), łączy się z kolejnym za pomocą wiązania 3 5 -fosfodiestrowego. Cząsteczki DA i RA są uważane za nośniki informacji genetycznej, która jest przechowywana w sekwencji zasad leżących wzdłuż łańcucha kwasu nukleinowego. Zasady te posiadają szczególną cechę tworzenia za pomocą wiązań wodorowych specyficznych par, a takie ich parowanie jest podstawą mechanizmu kopiowania informacji genetycznej z istniejącego łańcucha na nowo powstały. Cząsteczki RA zbudowane są z jednej nici ale zawierają rejony typu spinki do włosów, powstające w wyniku utworzenia dwuniciowej helisy przez sekwencje komplementarne występujące w jednej nici kwasu. DA stanowi materiał genetyczny organizmów komórkowych, który określa jakie białka powstają w komórce, ale to RA stanowi bezpośrednią matrycę dla ich syntezy. Ekspresja genów jest przekształceniem informacji zawartej w DA w funkcjonalne cząsteczki, w której kluczową rolę odgrywa kilka rodzajów RA: a) Informacyjny RA (mra) stanowi matrycę do syntezy białek czyli translacji określa kolejność aminokwasów w syntezowanym białku b) Transportujący RA (tra) przenosi zaktywowane aminokwasy do rybosomów, gdzie dochodzi do ich połączenia się wiązaniami peptydowymi w kolejności określonej przez mra c) Rybosomowy RA (rra) główny składnik rybosomów, pełni podczas biosyntezy białek funkcje zarówno katalityczne jak i strukturalne DA stanowi matrycę do syntezy RA, a proces ten nazywany jest transkrypcją. Jest on katalizowany przez enzym polimerazę RA, która rozpoznając tzw. promotora rozpoczyna syntezę RA. olimeraza RA przemieszcza się wzdłuż matrycy i przepisuje jedną z nici, aż osiągnie miejsce terminacji transkrypcji. Zawartość RA w komórce roślinnej zmienia się w zależności od rodzaju tkanki i jej stadium rozwojowego. W dojrzałych liściach całkowite stężenie RA wynosi 0,1-0,2%. W liściach czy korzeniach starzejących się lub poddanych głodzeniu jego poziom wyraźnie obniża się. W komórce RA zwykle połączone jest z białkami, które można odłączyć przez działanie detergentami, chlorkiem guanidyny lub proteazami. aturalne mieszaniny RA można rozdzielić metodą chromatografii jonowymiennej, sączenia molekularnego w żelach itd. Badanie składników RA można przeprowadzić bez poddania go reakcji hydrolizy (np. stosując reakcje barwne tj. reakcja Biala na rybozę) lub po hydrolizie enzymatycznej lub chemicznej. W wyniku działania 1M kwasu solnego (1h, 100 o C) na cząsteczkę RA uwalniane są zasady purynowe, fosforany rybozy oraz nukleotydy pirymidynowe. grzewanie RA w obecności 0,5M wodorotlenku potasu (40 o C) powoduje powstawanie cyklicznych diestrów mononukleotydów (nie powstają one z DA, gdyż nie ma w nim 2 - H); przedłużenie czasu ogrzewania w wodorotlenku potasu do godziny prowadzi do utworzenia w przybliżeniu równych ilości rozpuszczalnych soli potasowych izomerów 2 - i 3 - nukleotydów: AM, GM, CM i UM (rys 1), których ilość można oznaczyć spektrofotometrycznie.

3 H 2 H H 2 H H H H H 2 H H H H H Rys. 1 odczas ćwiczenia będzie wykorzystana adaptowana do materiału roślinnego i uproszczona procedura Schmidta i Thannhausera 2. olega ona na usunięciu z materiału roślinnego barwników, lipidów, białek, wolnych nukleotydów i DA. ozostałe RA hydrolizuje się poprzez łagodne ogrzewanie w roztworze wodorotlenku potasu, a powstające 2 - i 3 -mononukleozydy oznacza się spektrofotometrycznie. Wykazują one maksymalną absorpcję przy około 260 nm. onadto mierzy się absorbancję przy 300 nm w celu wprowadzenia poprawki wynikającej z obecności innych związków pochłaniających promieniowanie przy tej długości fali. 2. Wykonanie ćwiczenia dczynniki i materiały: 95% etanol 80% etanol eter naftowy 0,2M kwas nadchlorowy (schłodzony) 1M kwas nadchlorowy 0,5M wodorotlenek potasu materiał roślinny

4 Szkło i inne wyposażenie Kolba stożkowa 250 ml, moździerz z tłuczkiem, pęseta, lejek szklany z korkiem gumowym, kolbka ssawkowa, sączki, bagietki, probówka wirówkowa, próbówka szklana, termometr, cylinder miarowy 10 ml, pipeta, łaźnia lodowa, łaźnia wodna (100 o C), łaźnia wodna (40 o C), folia aluminiowa, kuweta, spektrofotometr, wirówka, Etap 1 usunięcie większości chlorofilu, lipidów, wolnych puryn i nukleotydów aważkę 300 mg (zapisać dokładną wagę naważki!!) liści pociąć na 2-3 milimetrowe fragmenty. Do kolby stożkowej o pojemności 250 ml wlać 100 ml 80% etanolu i zakryć folią aluminiową. astępnie umieścić w wrzącej łaźni wodnej i gdy alkohol zacznie wrzeć dodać stopniowo za pomocą pęsety kawałki liści w taki sposób, aby nie przerwać wrzenia. Kolbę przykryć folią i ogrzewać przez 4 minuty. ie doprowadzić do zbyt dużego odparowania alkoholu! Etap 2 usunięcie chlorofilu, lipidów, karotenoidów Zawartość kolby schłodzić pod bieżącą wodą, zdekantować alkoholowy roztwór i odrzucić (wylać do specjalnie przygotowanego pojemnika na odpad etanolu!!!). ozostałość przenieść do moździerza i dokładnie rozetrzeć, dodać 5 ml 95% etanolu i dalej rozcierać. Zawiesinę przenieść na lejek szklany z gumką i przygotowanym sączkiem odsączyć alkohol pod słabą próżnią. Moździerz przepłukać 10 ml 95% etanolu i roztwór przenieść na sączek. sad na sączku przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) eterem naftowym i odsączyć pod słabym ciśnienie. Etap 3 usunięcie rozpuszczalnych nukleotydów sad przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) schłodzonym 0,2M kwasem nadchlorowym. W celu usunięcia kwasu osad przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) 95% etanolem. Etap 4 hydroliza RA do 2 - i 3 -mononukleotydów o odsączeniu etanolu wyjąć sączek z osadem, zwinąć, włożyć do probówki wirówkowej, dodać 5 ml 0,5M wodorotlenku potasu i całkowicie zanurzyć sączek w roztworze. robówkę zamknąć i wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 40 o C na godzinę. Etap 5 wytrącenie DA, białek, ścian komórkowych o wyjęciu z łaźni wodnej probówkę umieścić w łaźni lodowej na 10 minut (mieszając zawartość bagietką), następnie dodać 5 ml schłodzonego 1M kwasu nadchlorowego i łagodnie wymieszać. ozostawić w łaźni lodowej przez 15 minut. Etap 6 Uzyskanie roztworów oczyszczonych 2 - i 3 -mononukleotydów Całość wirować 7 minut przy obrotach/min, supernant ostrożnie zdekantować do cylindra o pojemności 10 ml (zapisać objętość!).

5 Etap 7 pomiary i ilościowe oznaczanie RA Do szklanej próbówki pobrać 1 ml roztworu nukleotydów RA, dodać 3 ml wody, dokładnie wymieszać i przenieść do kuwety pomiarowej. Zmierzyć absorbancję przy 260 i 300 nm w spektrofotometrze wyzerowanym na wodę. Ilość RA obliczyć ze wzoru: mg RA = 0,031(A 260 -A 300 )(rozcieńczenie x ml RA) gdzie: 0,031 średnia wartość absorbancji dla nukleotydów w RA A 260, A 300 zmierzone wartości absorbancji rozcieńczenie próbki w tym przypadku 4 (1 ml + 3 ml) ml RA ilość supernantu po wirowaniu Zawartość RA wyrazić w procentach. 1. J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, Biochemia, Wydawnictwo W, 2005, J.. Davidson, Biochemia kwasów nukleinowych, Methuen & Co Ltd., 1969,