Zestaw przeznaczony jest do całkowitej izolacji RNA z bakterii, drożdży, hodowli komórkowych, tkanek oraz krwi świeżej (nie mrożonej).

Transkrypt

1 Total RNA Mini Plus Zestaw do izolacji całkowitego RNA. Procedura izolacji nie wymaga użycia chloroformu wersja izolacji, 100 izolacji Nr kat , Zestaw przeznaczony jest do całkowitej izolacji RNA z bakterii, drożdży, hodowli komórkowych, tkanek oraz krwi świeżej (nie mrożonej). Pojemność minikolumny do oczyszczania RNA wynosi 100 μg. Produkt przeznaczony wyłącznie do badań naukowych. 1

2 Skład zestawu Składnik 25 izolacji 100 izolacji Temp. Przechowywania Minikolumny do oczyszczania RNA 25 szt. 100 szt. Temp. Pok. Probówki 2 ml 50 szt. 200 szt. Temp. Pok. A1 roztwór płuczący 50 ml 200 ml Temp. Pok. Fenozol Plus 15 ml 50 ml Temp. Pok. Izopropanol 15 ml 50 ml +4 C Woda jałowa (wolna od nukleaz, traktowana DEPC) 8 ml 30 ml od -20 C do +20 C Wyposażenie i materiały niezbędne do izolacji RNA, które nie wchodzą w skład zestawu 1. Materiał do izolacji RNA 2. RBCL - bufor do lizy erytrocytów w przypadku izolacji RNA z krwi (nr kat , ) 3. DNAza (nr kat , ) 4. Jałowe, wolne od RNAzy probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml 5. Mikrowirówka 6. Inkubator lub łaźnia wodna 50 C UWAGA: Przed przystąpieniem do pracy zalecamy oczyszczenie powierzchni roboczej używając produktu LabZAP (nr kat ) Ilustracje zamieszczone w niniejszym protokole mają jedynie charakter poglądowy. Ich rzeczywisty wygląd, w tym kolor, może odbiegać od prezentowanych w grafice. Firma A&A Biotechnology udziela rocznej gwarancji na niniejszy zestaw. Firma nie gwarantuje poprawnego działania zestawu do izolacji RNA w przypadku: odstępstwa od dostarczonego wraz z zestawem protokołu braku zalecanego w niniejszym protokole wyposażenia i materiałów użycia innych odczynników niż zalecane lub które nie wchodzą w skład zestawu użycia przeterminowanych odczynników oraz minikolumn 2

3 Przygotowanie materiału A. Bakterie 1. Odwirować 1-3 ml świeżej hodowli nocnej i usunąć supernatant. 2. Przejść do punktu 1. protokołu izolacji RNA. B. Drożdże 1. Odwirować 1 ml hodowli drożdży i usunąć supernatant. 2. Przejść do punktu 1. protokołu izolacji RNA. C. Hodowle komórkowe 1. Odwirować komórki (1x10 6 ) i usunąć supernatant. 2. Przejść do punktu 1. protokołu izolacji RNA. D. Tkanki stałe 1. Tkanki (20-50 mg) należy rozetrzeć w moździeżu z ciekłym azotem. 2. Sproszkowane tkanki przenieść do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. 3. Przejść do punktu 1. protokołu izolacji RNA. E. Tkanki roślinne 1. Tkanki (20-50 mg) należy rozetrzeć w moździeżu z ciekłym azotem. 2. Sproszkowane tkanki przenieść do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. 3. Przejść do punktu 1. protokołu izolacji RNA. F. Krew świeża 1. Do 1-2 ml krwi dodać buforu do lizy erytrocytów RBCL (5 obj. RBCL/1 obj. krwi) (nie ma w zestawie, nr kat , ). 2. Całość wymieszać i inkubować w lodzie 15 min. Po inkubacji roztwór z mętnego powinien zmienić się w szkarłatnie przezroczysty. 3. Próbkę wirować przez 10 min przy 3000 x g, a następnie usunąć supernatant. 4. Przejść do punktu 1. protokołu izolacji RNA. 3

4 Protokół izolacji RNA 1. Do przygotowanych prób dodać po 400 µl Fenozolu Plus i mieszać przez pipetowanie, aż do całkowitej lizy komórek. Fenozol Plus inaktywuje endogenne RNAzy. Próby zawieszone w Fenozolu Plus mogą być przechowywane: - do roku w temp. -20 C, -80 C - do tygodnia w temp. od +4 C do +8 C - do 24 godzin w temp. pokojowej Roztwór Fenozolu Plus zawiera fenol. Należy unikać jego kontaktu ze skórą i pracować w rękawiczkach ochronnych. 2. Inkubować 5 min w temp. 50 C. 50 C 3. Do lizatów dodać po 150 µl wody jałowej. Próbki intensywnie worteksować przez 15 s. Następnie pozostawić na 5 min w temp. pokojowej. 4. Wirować przez 15 min przy RPM. Podczas wirowania, DNA oraz białka osadzają się na dnie probówki. RNA pozostaje rozpuszczone w supernatancie. 5. Pobrać 400 µl supernatantu do nowych probówek 1,5 ml (nie ma w zestawie). Następnie dodać po 400 µl Izopropanolu. 6. Całość dokładnie wymieszać i nanieść na minikolumny do oczyszczania RNA. 7. Wirować 1 min przy RPM. A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, Gdynia 4 NIP

5 8. Przenieść minikolumny do nowych probówek 2 ml (w zestawie). Następnie dodać do minikolumn po 700 µl roztworu płuczącego A1. 9. Wirować 1 min przy RPM. 10. Wyjąć minikolumny z probówek 2 ml i umieścić w nowych probówkach 2 ml (w zestawie). Następnie dodać do minikolumn po 700 µl roztworu płuczącego A Wirować 1 min przy RPM. 12. Wyjąć minikolumny z probówek 2 ml, wylać przesącz i umieścić w tych samych probówkach 2 ml. Następnie dodać do minikolumn po 300 µl roztworu płuczącego A Wirować 2 min przy RPM. 14. Minikolumny umieścić w nowych jałowych, wolnych od RNAzy probówkach elucyjnych 1,5 ml (nie ma w zestawie). Do złoża znajdującego się na dnie minikolumn dodać po µl wody jałowej. 15. Pozostawić na 2 min w temp. pokojowej. Następnie wirować 1 min przy RPM. 16. Minikolumny usunąć, a oczyszczone RNA znajdujące się w probówkach przechowywać w temperaturze -20 C, -80 C do czasu dalszych analiz. A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, Gdynia 5 NIP

6 Protokół skrócony przygotowana próbka µl Fenozolu Plus i. wymieszać ii. inkubować 50 C - 5 min próbka z Fenozolem Plus µl wody jałowej i. worteksować - 15 s ii. inkubować w temp. pok. - 5 min iii. wirować RPM- 15 min supernatant nowa probówka 1,5 ml 400 µl Izopropanolu i. wymieszać ii. nanieść na minikolumnę iii. wirować RPM - 1 min nowa probówka 2 ml minikolumna 700 µl roztworu A1 i. wirować RPM - 1 min nowa probówka 2 ml minikolumna 700 µl roztworu A1 300 µl roztworu A1 minikolumna i. wirować RPM - 1 min ii. wylać przesącz i włożyć minikolumnę do tej samej probówki 2 ml i. wirować RPM - 2 min probówka elucyjna 1,5 ml minikolumna µl wody jałowej i. inkubować w temp. pok. - 2 min ii. wirować RPM - 1 min µl eluatu RNA RNA gotowe do użycia Przechowywać w temperaturze -20 C, -80 C 6

7 Doczyszczanie eluatu RNA (opcjonalnie) Zestaw Total RNA Mini efektywnie izoluje i oczyszcza RNA bez potrzeby jego dodatkowego doczyszczania. W szczególnym przypadku, gdy konieczne jest usunięcie nawet śladowych ilości DNA zalecamy: Zastosowanie DNAzy (nr kat , ) 1. Do 100 µl eluatu RNA dodać po: 1 µl DNAzy (10 U/µl) 10 µl 10x buforu reakcyjnego (w zestawie z DNAzą) 2. Inkubować próbkę 15 min w temp. 37 C 3. Inkubować próbkę 10 min w temp. 75 C - inaktywacja DNAzy lub Użycie zestawu Clean-Up RNA Concentrator (nr kat C, C) Zestaw jest oparty na mikrokolumnach i służy do usuwania śladowych ilości DNA. Elucja RNA w ok. 30 µl wody jałowej. Elementy do zamówień dodatkowych Produkt Ilość Nr kat. RBCL bufor do lizy erytrocytów 100 ml ml Fenozol Plus 50 ml P Izopropanol 50 ml Woda jałowa (wolna od nukleaz, traktowana DEPC) DNAza (10 U/µl) Clean-Up RNA Concentrator 5 x 1,5 ml x 5 ml ml U U izolacji C 100 izolacji C 7

8 Informacje bezpieczeństwa NIEBEZPIECZEŃSTWO Fenozol Plus H301+H311+H331 Działa toksycznie po połknięciu, w kontakcie ze skórą lub w następstwie wdychania. H314 Powoduje poważne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu. H341 Podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne. H373 Może powodować uszkodzenie narządów poprzez długotrwałe lub wielokrotne narażenie. H411 Działa toksycznie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. P261 Unikać wdychania pyłu. P273 Unikać uwolnienia do środowiska. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu/ ochronę twarzy. P301+P310 W przypadku połknięcia: natychmiast skontaktować się z Ośrodkiem Zatruć lub lekarzem. P305+P351+P338 W przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P310 Natychmiast skontaktować się z Ośrodkiem Zatruć lub lekarzem. NIEBEZPIECZEŃSTWO A1 roztwór płuczący H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H319 Działa drażniąco na oczy. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. P305+P351+P338 W przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. NIEBEZPIECZEŃSTWO Izopropanol H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H319 Działa drażniąco na oczy. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. P305+P351+P338 W przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. 8