OPIS PATENTOWY. Zgłoszenie ogłoszono: Opis patentowy opublikowano:

Transkrypt

1 POLSKA RZECZPOSPOLITA LUDOWA OPIS PATENTOWY Ptent dodtkowy do ptentu nr Int. Cl.4 C12P21/W Zgłoszono: (P ) Pierwszeństwo: Jponi URZĄD PATENTOWY PRL Zgłoszenie ogłoszono: Opis ptentowy opublikowno: Twórc wynlzku Uprwniony z ptentu: Kubushiki Kisy Advnce Kihtsu Kenkyujo, Tokio(Jponi) Sposób wytwrzni biłk obniżjącego poziom cholesterolu we krwi Przedmiotem wynlzku jest sposób wytwrzni biłk obniżjącego poziom cholesterolu we krwi, które dlej w tekście określne jest jko biłko CRP (jest to skrót od ngielskiego terminu cholesterol-reducing protein", co ozncz biłko zmniejszjące ilość cholesterolu). Jk widomo, istnieje obecnie szereg preprtów frmceutycznych, tkich jk klofibrt lub preprty pochodne, które proponowne są jko środki lecznicze do leczeni miżdżycy nczyń lub hiperlipidemii, którjest jedną z tk zwnych typowych chorób wieku średniego lub strczego. Jednkże te znne środki lecznicze nie pozwlją n osiągnięcie w pełni celów pożądnych z punktu widzeni n przykłd skutków frmkologicznych orz dziłń ubocznych, tym smym zncznie wzrosł potrzeb wytworzeni brdziej skutecznych i bezpiecznych lekrstw. W związku z tym celem niniejszego wynlzku jest wytwrznie nowego biłk obniżjącego poziom cholesterolu we krwi, czyli biłk CRP, które możn bezpiecznie podwć sskom i które skutecznie obniż poziom cholesterolu we krwi ssków. Dlszym celem wynlzku jest wytwrz nie frmceutycznej kompozycji przciwdziłjącej miżdżycy nczyń lub powodującej obniżenie poziomu cholesterolu we krwi, któr jko skłdnik czynny zwier to nowe biłko CRP. Dlsze cele i zlety sposobu według wynlzku omówiono w podnym poniżej opisie. Przedmiotem wynlzku jest sposób wytwrzni biłk obniżjącego poziom cholesterolu we krwi, które powoduje obniżenie poziomu cholesterolu we krwi ssków i posid nstępujące cechy chrkterystyczne: ) ms cząsteczkow oznczon metodą chromtogrfii żelowej: , b) punkt izoelektryczny: 7,90,2, c) skłd minokwsów (% molowe): glicyn glutminin lizyn wlin treomn seryn 25,23 lnin 10,34 sprginin 6,39 leucyn 5,41 izoleucyn 4,23 tyrozyn 3,46 prolin 10,98 8,20 5,58 5,18 4,19 2,62

2 rginin 2,60 fenylolnin 2,51 metionin 1,56 histydyn 1,30 cystein 0,16 d) obrz elektroforezy: wyrźne psmo po stronie nody przy elektroforezie n żelu polikrylomidu, chrkteryzujący się tym, że hoduje się mikroorgnizm nleżący do rodzju Streptococcus w odpowiedniej pożywce hodowlnej i z tej hodowli wyodrębni się biłko obniżjące poziom cholesterolu we krwi. Sposób według wynlzku zostnie wyjśniony w podnym poniżej opisie, w, powiązniu z złączonymi rysunkmi, n których fig. 1 przedstwi obrz elektroforezy n żelu polikrylomidu biłk CRP otrzymnego sposobem według wynlzku, zś fig. 2 do 4 przedstwiją przebieg eluowni przy chromtogrfii żelowej próbek z podnego w opisie przykłdu I. W wyniku bdń stwierdzono, że nowe biłko otrzymne z mikroorgnizmów nleżących do rodzju Streptococcus i/lub sklrownego bulionu hodowli może skutecznie obniżć poziom cholesterolu we krwi orz że skłdnik ten wyodrębniony z tych tk zwnych bkterii żołądkowo-je- Iitowych i sklrownego bulionu hodowli jest zsdniczo biorąc nietoksyczny przy podwniu doustnym. Poniżej szczegółowo opisno zstosowne mikroorgnizmy, sposoby wytwrzni, chrkte rystyki fizykochemiczne i dziłnie frmkologiczne biłk CRP otrzymnego sposobem według wynlzku. Mikroorgnizmy. 1. Gtunki W sposobie według wynlzku stosuje się mikroorgnizmy nleżące do rodzju Streptococ cus, korzystnie Streptococcus fecium, Streptococus feclis, Streptococcus bovis, Streptococcus vium, Streptococcus durns, Streptococcus slivrius, Streptococcus mitis, Streptococcus equinus orz inne. Pondto korzystnie możn stosowć gtunki określne jko pciorkowce jelitowe. Typowe przykłdy tkich mikroorgnizmów wyodrębnionych z kłu zdrowych ludzi zostły zdeponowne 15 lipc 1982 roku w Fermenttion Reserch Institute (FRI) w Jponii (wszystkie numery podne w Tblicy 1 jko FERM-P" odnoszą się do numerów depozytu we wspomninym Instytucie) i przeniesione w tymże Fermenttion Reserch Institute (jko Międzynrodowym Urzędzie Skłdnicy w Jponii przewidzinym postnowienimi porozumieni budpeszteń skiego) pod podne w Tblicy 1 numery depozytów FERM-BP, zgodnie z postnowienimi porozumieni budpeszteńskiego odnośnie międzynrodowego uznni deponowni mikro orgnizmów dl celów postępowni ptentowego. T b e 1 I Nzw szczepu Streptococcus fecium Streptococcus feclis Streptococcus vium Streptococcus slivrius Streptococcus durns Streptococcus mitis Streptococcus equinus ADV1009 ADV9001 AD2003 ADV10001 ADV3001 ADV7001 ADY8001 Numer depozytu FERM P-6624 FERM BP-296 FERM P-6625 FERM BP-297 FERM P-6626 FERM BP-298 FERM P-6627 FERM BP-299 FERM P-6628 FERM BP-300 FERM P-6629 FERM BP-301 FERM P-6630 FERM BP Chrkterystyki mikrobiologiczne mikroorgnizmów Ogólne chrkterystyki mikrobiologiczne Chrkterystki mikrobiologiczne mikroorgnizmów stosownych w sposobie według wynlz ku są tkie sme, jk chrkterystyki znnych mikroorgnizmów nleżących do identycznej klsy. Tk więc ogólne chrkterystki mikrobiologiczne, metody hodowli orz inne włściwości odpo widją opisnym w podnych poniżej pozycjch litertury nukowej: 1) Bergey's Mnuł of Determintive Bcteriology, 8 wyd., s (1974), 2) Int. J. Syst. Bct. 16, s. 114 (1966), 3) Microbiol. Immunol. 25 (3), (1981), 4) J. Clin. Pthol. 33, (1980), 5) J. Generl Microbiol. 128, (1982), 6) Applied Microbiol. 23 (6), (1972).

3 Typowe włściwości mikrobiologiczne wyżej wymienionych szczepów stosownych w sposo bie według wynlzku możn zestwić jk podno poniżej w tbeli 2: T b e 1 II Szczepy Chrkterystyki ADV 1009 ADV 9001 AD 2003 ADV ADV 3001 ADV 7001 ADV Ksztłt komórki Brwienie się metodą Grm Hemoliz sferoidlny Wzrost w temperturze 10 C Wzrost w temperturze 45 C Wzrost w temperturze 50 C Odporność n dziłnie tem pertury 60 C przez 30 min Wzrost w pożywce hodowli przy ph 9,6 Zdolność redukcji błękitu metylenowego Upłynninie żeltyny Wzrost w pożywce hodowli zwierjącej NCl (6,5%) Wzrost w pożywce hodowli zwierjącej żółć (40%) Wytwrznie moniku Hydroliz kwsu hipurowego Wzrost w pożywce hodowli zwierjącej telluryt Wzrost w pożywce hodowli zwierjącej TTC*1 Wytwrznie kwsu ze źródł węgl glukoz eskulin t T *2 r. T 4- inulin lktoz gliceryn rbinoz melezytoz sorbit Grup ntygenu D D Q/D/ K D D I : chlorek 2,3,5-trifenylotetrzolium * 2 : nie oznczono 3. Metody hodowli bkterii Hodowl tych mikroorgnizmów prowdzon jest w sposób konwencjonlny, n przykłd komórki bkteryjne możn otrzymć przez stcjonrną hodowlę przy dostępie tlenu w bulionie Rogos o poniżej podnym skłdzie i możn je nstępnie zbierć przez odwirownie. Skłd bulionu Rogos Tryptikz Wyciąg drożdżowy Tryptoz K2HPO4 KH2PO4 Cytrynin trimoniowy Emulgtor Tween 80 Glukoz Chlorowodorek cysteiny Roztwór soli *1 Wod destylown uzupełnienie do 10g 5g 3g 3g 3g 2g Ig 20 g 0,2 g 5 ml 1 litr

4 (ph 7, sterylizcj termiczn w temperturze 121 C przez 15 minut) *1MgS04-7H20 ll,5g FeS04-7H20 0,68 g MnS04-7H20 2A g Wod destylown 100 ml Wytwrznie biłk CRP Typowe procesy wytwrzni biłk CRP sposobem według wynlzku przebiegjąjk nstępuje: 1. Zbiernie mikroorgnizmów Kżdy z wymienionych powyżej szczepów zszczepi się w bulionie Rogos, inkubuje bez miesz ni w temperturze 37 C przez 5 do 10 godzin przy dostępie tlenu ż do otrzymni bulionu pożywki hodowli o pewnej zncznej koncentrcji komórek bkteryjnych. Bulion hodowli w sposób ciągły odwirowuje się z prędkością obr/min. Zebrne komórki bkteryjne przemyw się nstępnie 2 do 3 rzy roztworem soli (0,85% NCl). 2. Rozrywnie komórek bkteryjnych ) Przemyte komórki zwiesz się w fizjologicznym roztworze soli i przez 10 minut utrzymuje się w temperturze 115 C celem rozerwni komórek. b) Komórki bkteryjne przemyte i zwieszone w fizjologicznym roztworze soli rozryw się przez poddwnie dziłniu fl dźwiękowych, obróbce w prsie wysokociśnieniowej orz innymi konwencjonlnymi sposobmi. 3. Usuwnie tłuszczu z komórki. Zwiesinę rozerwnych komórek miesz się z roztworem chloroform-metnol (2:1,% objętościo we). Skłdniki rozpuszczlne w orgnicznym rozpuszczlniku usuw się nstępnie cłkowicie przez odwirownie w ciągu 10 minut przy 3000 obr/min i odrzuc się wrstwę chloroformową. 4. Trktownie enzymmi proteolitycznymi. Odtłuszczoną powyższą próbkę trktuje się w ogólnie przyjęty sposób proteolitycznymi enzymmi tkimi, jk pronz, trypsyn i pepsyn. W sposobie według wynlzku njkorzystniej jest stoso wć jko enzym proteolityczny pronzę. Wrunki trktowni tym enzymem podno w Methods m Enzymology, vol. VIII, s. 26 (1966). 5. Oczyszcznie Otrzymną po odwirowniu sklrowną ciecz z proteolitycznej mieszniny rekcyjnej zdje się środkmi strącjącymi, tkimi jk kws trichlorooctowy lub sirczn monowy, w celu strąceni frkcji biłkowej. Frkcję biłkową trktuje się z kolei odpowiednimi nuklezmi w celu usunięci występujących w tej frkcji skłdowych kwsów nukleinowych, tkich jk DNA i RNA. Po kżdym dziłniu enzymem ponownie przeprowdz się dilizę. Częściowo oczyszczoną frkcję poddje się nstępnie powtrzlnym dlszym zbiegom oczy szczni, tkim jk chromtogrfi żelow i frkcjonownie sircznem monowym, w wyniku czego otrzymuje się osttecznie czysty preprt biłk określny jko biłko CRP. Biłko CRP możn njogólniej biorąc otrzymć, w zleżności od jego chrkterystyk fizyko chemicznych, które omówiono poniżej, w wyniku szeregu szeroko stosownych w tej dziedzinie opercji wyodrębnini i oczyszczni tkich, jk wytrącnie-rozpuszcznie i ekstrkcj, ekstrk cj rozpuszczlnikow, diliz, chromtogrfi kolumnow, elektroforez, chromtogrfi żelo w względnie ich kombincji. W związku z tym sposób według wynlzku nie jest ogrniczony do wymienionych w niniejszym opisie opercji. Tkwięc przedmiotem wynlzku jest sposób wytwrzni produktów obniżjących poziom cholesterolu we krwi, które skłdją się z biłk i które otrzymuje się z mikroorgnizmów nleżących do rodzju Streptococcus, poniewż we frkcji biłkowej stwierdzono ktywność frmkologiczną. Opisno to szczegółowo w podnych poniżej przykłdch. Stwierdzono pondto, że sklrown ciecz z bulionu pożywki hodowli wykzuje czynność obniżni poziomu cholesterolu we krwi, odpowidjącą w przybliżeniu około 1/5 ktywności komórek bkteryjnych. Fizykochemiczne chrkterystyki biłk CRP Biłko CRP wytwrzne sposobem według wynlzku wykzuje nstępujące chrkterystyki fizykochemiczne i fizjologiczne: 1. Włściwości chemiczne i rozpuszczlność Sproszkowną próbką otrzymną po rozłożeniu soli i liofilizcji był nie rozpływjący się n powietrzu biły proszek, brdzo dobrze rozpuszczlny w wodzie i rozpuszczlny w cetonie. W

5 rzypdku zmieszni roztworu biłk CRP w niskiej temperturze (4 C) z sircznem monowym lub kwsem triochlorooctowym zobserwowno odpowiednio zmętnienie lbo wytrącenie się osdu. 2. Ms cząsteczkow Msę cząsteczkową biłk CRP oszcowno n stosując metodę chromtogrfii żelowej przy użyciu kolumny Toyoperl HW 55 (ToyosodCo., Ltd.), doprowdzonej do stnu równowgi przy użyciu 25 mm roztworu buforowego Tris-HCl zwierjącego 0,3 M NCl (ph 7,5). 3. Punkt izoelektryczny Punkt izoelektryczny biłk CRP zmierzono metodą ogniskowni izoelektrycznego przy użyciu 5% żelu polikrylomidu zwierjącego Amfolinę (ph 3,5 do 10, LKB Co., Ltd.), przy końcowym stężeniu 2% w temperturze 4 C przy stłym npięciu 200 V przez 3 godziny. Jko roztwory elektrodowe dl nody i ktody stosowno odpowiednio 0,02 M roztwór H3PO4 i 1 M roztwór NCl. Wprowdzono próbkę w ilości 100//g i przeprowdzono brwienie próbki przy użyciu brwnik Coomssie Brillint Blue R-250. Punkt izoelektryczny oznczono n 7,90,2. Wrtość t leżł pomiędzy dnymi dl wzorcowych biłek hemoglobiny szczurów i mioglobiny kszlotów. 4. Skłd minokwsów Próbkę 1 mg zwieszono w 1 ml 6 N HC1 i wprowdzono do mpułki, zmrożono w mieszni nie suchy lód-metnol i pod zmniejszonym ciśnieniem zstąpiono powietrze gzowym N2- Wyminę gzu powtrz się 3 rzy i mpułkę ztopiono pod zmniejszonym ciśnieniem. Po hydrolizie w temperturze 110 C przez 24 godziny w bloku grzejnym usunięto chlorowodór przez odprownie obrotowe pod zmniejszonym ciśnieniem i próbkę rozpuszczono w 200/ii 1/50 N HO. Nstępnie 50//l tej próbki poddno nlizie w nliztorze minokwsów (szybki nliztor minokwsów Model 835 High Speed Amino Acid Anlyzer, Hitchi, Ltd.). Skłd minokw sów próbki biłk CRP podno w tbeli 3. Tbe l III. glicyn lnin Aminokws glutminin sprginin lizyn leucyn wlin izoleucyn treonin tyrozyn sery n prolin rginin fenylolnin metionin histydyn cystein % molowe 25,23 10,98 10,34 8,20 6,39 5,58 5,41 5,18 4,23 4,19 3,46 2,62 2,60 2,51 1,56 1,30 0,16 5. Obrz elektroforezy krążkowej Krążkowe nlizy elektroforetyczne biłk CRP (25fig) przeprowdzono n żelch polikrylo midu (7% polikrylomidu) w roztworze buforowym Tris-glićyny (ph 8,3) przy 4 ma/żel w ciągu 2,5 godziny. Uzyskno wyrźne psmo biłk próbki w odległości 4,2 0,2 cm od nody. Obrz żelu i rozkłdu densytometrycznego elektroforezy przedstwiono n fig Chrkterystyki fizjologiczne Biłko CRP wykzuje ktywność biologiczną, obniżjąc poziom cholesterolu we krwi ssków przy podwniu doustnym. Podczs przechowywni biłk CRP ktywność t jest stbiln w zkresie od co njmniej -80 C do 115 C orz ph od 4,1 do 10,9. Dziłnie frmkologiczne biłk CRP 1. Skutki frmkologiczne

6 Jk przedstwiono w podnym poniżej przykłdzie, lek przeciw miżdżycy nczyń zwier jący biłko CRP wytworzone sposobem według wynlzku może spowodowć wyjątkowo skute czne obniżnie poziomu cholesterolu we krwi ssków. W związku z tym lek tenjest przydtny jko środek podwny leczniczo lbo zpobiegwczo w przypdkch chorób związnych z miżdżycą nczyń, hiperlipidemią, hiperlipoproteinemią, ndmirem lipidów w ustroju, kmicą pęcherzyk żółciowego, ndciśnieniem, cukrzycą i innymi zburzenimi. Preprty zwierjące jko skłdnik czynny biłko CRP wytwrzne sposobem według wyn lzku możn podwć sskom doustnie, śródotrzewnowo i dożylnie, jk również wykorzystując inne sposoby podwni. Stosown dwk może wynosić od około 1 /jg do 1 g/kg wgi cił, korzystnie przy podwniu doustnym od około 0,1 mg do 100 mg/kg wgi cił. Możn wybierć dowolną formę leku zwierjącego jko skłdnik czynny biłko CRP wytwrzne sposobem według wynlzku i tk możn je stosowć jko roztwór w fizjologicznym roztworze soli orz innych cieczch, zstrzyki, proszek otrzymywny przez liofilizcję lub innymi metodmi, czopki, tbletki z powłoką rozpuszczjącą się dopiero wjelitch, tbletki do ssni podjęzykiem, grnulki, tbletki, kpsułki itd., z odpowiednimi nośnikmi (n przykłd skrobi, dekstryn), podłożmi rozcieńczjącyim (n przykłd węgln wpniowy, lktoz), rozcieńczlnikmi (n przykłd fizjo logiczny roztwór soli, wod destylown) itd. 2. Ostr toksyczność Jk podno to w przykłdzie poniżej, wrtość LD50 biłk CRP wytwrznego sposobem według wynlzku wynosi powyżej 802 mg/kg wgi cił, oznczn n myszch przy podwniu sródotrzewnowego. Substncj t jest zsdniczo biorąc nietoksyczn przy podwniu doustnym. Wytwrznie biłk CRP sposobem według wynlzku zostnie zilustrowne podnymi poniżej przykłdmi. Przykłd I Wytwrznie i oczyszcznie biłk CRP. Szczep Streptococcus fecium ADV 1009 (FERM BP-296) zszczepiono w 21 bulionu Rogos przy końcowym stężeniu 1 X 106 komó rek bkteryjnych/ml. Zszczepioną pożywkę poddno inkubcji w temperturze 37 C przez 10 godzin bez mieszni przy dostępie tlenu, ż do otrzymni 109 komórek bkteryjnych/ml bulionu hodowli. Komórki bktekryjne zebrno przez ciągłe odwirowywnie z prędkością obr/min, przemyto fizjologicznym roztworem soli (0,85% NCl) i zwieszono w tym smym roztworze, otrzymując 100 ml zwiesiny komórek o stężeniu 2X I010/ml. Otrzymną zwiesinę komórek bkteryjnych poddno obróbce termicznej ogrzewjąc n 10 minut do tempertury 115 C i 3 rzy potrktowno mieszniną chloroform-metnol (2:1, sto sunki objętościowe), celem usunięci tłuszczów. Odtłuszczoną zwiesinę bkteryjną wirowno przez 10 minut z prędkością 3000 obr/min i odrzucono wrstwę dolną, to znczy chloroformową. Wrstwę wodną wykorzystno jko mterił wyjściowy do dlszych etpów oczyszczni. Ten mterił wyjściowy potrktowno 20 mg pronzy (Sigm protez typ XIV) w 100 ml fosfornowego roztworu buforowego (ph 7,8), zwierjącego 0,0015 M CCU, w temperturze 47 C przez 24 godziny, po czym w tych smych wrunkch powtórzono trktownie przy użyciu 10 mg pronzy. Wrunki eksperymentlne trktowni pronzą oprte są i opisne w publikcji Methods in Enzymology", vol. VIII, s. 26 (1966). Mterił potrktowny pronzą podzielono n frkcję osdu i sklrownej cieczy nd nim przez odwirownie przez 10 minut z prędkością 3000 obr/min. Do frkcji sklrownej cieczy dodno 1/9 objętości 100% (% wgowo/objętościowe) kwsu trichlorooctowego (TCA), odst wiono n 3 godziny w temperturze 4 C przy stłym mieszniu i nstępnie wirowno przez 10 minut z prędkością 3000 obr/min celem uzyskni frkcji osdu i sklrownej cieczy nd osdem. Do frkcji osdu dodno tę smą objętość 10% TCA i powtórzono ten sm proces. Otrzymny osd przemyto 3 rzy eterem etylowym w celu usunięci TCA, rozpuszczono w 50 ml wody destylownej, zobojętniono 1N H, poddno dilizie celem cłkowitego usunięci TCA i n koniec odwirowno otrzymując 345 mg wysuszono osdu. Do otrzymnego osdu (345 mg) dodno 5 ml 0,1 M buforu trisoctnowego (ph 8,0), 1 ml 0,1 M octnu mgnezowego orz 0,06 ml dezoksyrybonuklezy (2 mg/ml dezoksyrybonuklezy I (Sigm)), po czym poddno inkubcji w temperturze 37 C przez 1 godzinę. Nstępnie mieszninę rekcyjną poddno dilizie względem wody destylownej przy użyciu rurki z celulozy (Cellotube, Nkri Kgkuykuhin Co., Ltd., Jponi), dilizują substncje o msie cząsteczkowej poniżej

7 140W przez 3 dni. Dilizowną frkcję odprowno do such. Otrzymny mterił zwieszono nstępnie w 5 ml 0,05 M buforu octnowego (ph 4,6) zwierjącego 440 jednostek rybonuklezy T2 (Sigm), poddno inkubcji w temperturze 37 C przez 3 godziny i poddno dilizie względem wody destylownej. Dilizowną frkcję o ciężrze cząsteczkowym powyżej oznczono jko oczyszczoną frkcję I (such ms 285 mg). Powyższą oczyszczoną frkcję I ponownie potrktowno rybonuklezą T2 i poddno dilizie celem otrzymni oczyszczonej frkcji II (such ms 274 mg). Oczyszczoną frkcję II wprow dzono do chromtogrfu kolumnowego ToyoperlHW 55, doprowdzonego do stnu równowgi przy użyciu 25 mm roztworu buforowego Tris-HCl (ph 7,5) zwierjącego 0,3 M NCl. Chromtogrm kolumnowy frkcji II przy prędkości eluowni 1 ml/min przedstwiono n fig. 2; lini A przedstwi zwrtość biłk mierzoną przez bsorbncję przy fli 280 nm; lini B przedstwi zwrtość kwsu nukleinowego mierzoną przez bsorbncję przy fli 260 nm; zś lini C przedst wi zwrtość cukru oznczną metodą wykorzystującą fenol H2SO4. Porcję eluowną później niż przedstwion lini D n fig. 2 (objętość elutu 67 ml) potrkto wno sircznem monowym (nsycenie 55%) i ze sklrownego płynu frkcjonowni sircz nem monowym otrzymno oczyszczoną frkcję III (such ms 205,5 mg). N fig. 3 przedstwionochromtogrm kolumnowy oczyszczonej frkcji III, wykonny w tych smych wrunkch eksperymentlnych, co podno dł fig. 2. Poniewż frkcj III zwier śldowe ilości cukrów, to frkcję tę potrktowno 3 rzy 10% TCA i poddno dilizie w tych smych wrunkch, po czym otrzymno osttecznie oczyszczone biłko CRP (such ms 197,3 mg). N fig. 4 przedstwiono chromtogrm kolumnowy biłk CRP, wykonny w tych smych wrunkch eksperymentlnych, jk dl 2 i fig. 3. Fizykochemiczne chrkterystyki biłk CRP podno powyżej. W tblicy 4 zestwiono wydjność ogólną orz ilość biłk oznczone metodą Lowry'ego, RNA oznczone orcyną, DNA oznczone difenylominą, orz cukrów oznczne mieszniną fenol H2SO4, dl poszczególnych preprtów. Podne w tblicy ilości oznczją suchą msę (mg). T b e 1 IV. Frkcj Wydjność Biłko RNA DNA Cukry Aktywność włściw Osd Oczyszczon frkcj I Oczyszczon frkcj 11 Oczyszczon frkcj III Biłko CRP ,5 197,3 265,9 260,1 258,3 202,6 197,3 43,6 11,3 3,6 śldy śldy 6,3 ' 1,2 0,8 śldy śldy 14,3 12,1 11,2 2,9 śldy 9,1 11,7 11,8 16,9 17,6 Podn w Tblicy 4 ktywność włściw ozncz względną ktywność obniżeni cholesterolu przez kżdą frkcją u konwencjonlnych szczurów n jednostkę wgi, przy czym wspomnine wyżej, poddne obróbce termicznej komórki bkteryjne przyjęto z 1. Sposoby oznczni ktyw ności pod względem obniżni poziomu cholesterolu we krwi w toku eksperymentów n zwierzę tch podno poniżej w przykłdzie II. Pondto potwierdzono, że w przedstwionym w tym przykłdzie sposób biłko CRP możn wyodrębnić i oczyszczć korzystjąc z innych, wymienionych w Tblicy 1 szczepów bkteryjnych, przy czym występują jedynie niewielkie różnice w wydjności. Przykłd II. Dziłnie frmkologiczne biłk CRP 1. Aktywność pod względem obniżni poziomu cholesterolu we krwi (1) Przygotowno próbki biłk CRP w fizjologicznym roztworze soli, zwierjące odpowiednik 50 mg/kg wgi cił liofilizownego biłk CRP. Próbki te podwno doustnie w dziennej dwce 1 ml konwencjonlnym szczurom (18-tygodniowe smce, przeciętn wg cił 246 g, po 10 szczurów w kżdej grupie) orz konwencjonlnym i jłowym myszom (18-tygodniowe smce, przeciętn wg cił 30 g, po 10 myszy w kżdej grupie). Szczury i myszy hodowno przez 8 do 12 tygodni. Nstępnie pobierno krew tętniczą z tętnic brzusznych tych zwierząt i przez wirownie z pełnej krwi oddzielono próbki surowicy. Zwrtość cholesterolu oznczono metodą Żurkowskiego (Choleskit, Knto Kgku K. K., Jponi). Wyniki oznczeń zestwiono w Tbeli 5. Podne w Tbeli wrtości oznczją spdek (%) względem wrtości dl grup kontrolnych, którym nie podno próbek leku. Skłd podwnej zwierzętom bez ogrniczeń diety (w % wgowych) podno w Tbeli 6.

8 T b e 1 V. Zwierzęt Spdek (9C) Konwencjonlne szczury (12 tygodni) 25,2 0,7 Konwencjonlne myszy (8 tygodni) 33,5 1,1 Jłowe myszy (8 tygodni)_ 21,7 0,9 T b c 1 VI Kzein Olej sojowy Skrobi pszeniczn Sole minerlne Miesznk witminow Skłd Sproszkown bibuł filtrcyjn Wg, % Aktywność pod względem obniżni cholesterolu we krwi (2) Wyżej wspomnine próbki podwno doustnie w dziennej dwce 1 ml konwencjonlnym szczurom (18-tygodniowe smce, przeciętn wg cił 238 g, po 15 szczurów w kżdej grupie) orz konwencjonlnym i jłowym myszom (18-tygodniowe smce, przeciętn wg cił 31 g, po 10 myszy w kżdej grupie) przez 12 tygodni. Zwrtość cholesterolu we krwi oznczonojk opisno powyżej, zś wyniki zestwiono w Tbeli7. Zstosownie w tej Tbeli określeni z dodtkiem cholesterolu" i z dodtkiem fruktozy" oznczją odpowiednio dodtek 1% cholesterolu do wyżej podnej diety orz zstąpienie fruktozą cłej ilości skrobii pszenicznej w powyższej diecie. Podne w Tbeli wrtości oznczją spdek zwrtości cholesterolu (%) względem wrtości dl grupy kontrolnej, której nie podno próbek leku. Tbel VII. ł1 j Dict l dodtkiem cholesterolu Zwierzęt Spdek (9f) Jłowe myszy*1 ' 35,4 1,3 Konwencjonlne myszy*1 ' 38,90,7 Konwencjonlne szczury*1 ' 49,2l,l Konwencjonlne szczury*2' 41,5 1,3 * ' Diet z dodtkiem fruktozy 3. Aktywność pod względem obniżni poziomu cholesterolu we krwi (3) Próbki w fizjologicznym roztworze soli, zwierjące 10 mg/ml biłk CRP podwno doust nie w dziennej dwce 1 ml n szczur przez 2 tygodnie szczurom wykzującym podwyższony poziom cholesterolu we krwi (18-tygodniowe smce, przeciętn wg cił 250 g, po 5 szczurów w kżdej grupie), krmionym dietą z dodtkiem cholesterolu". Poziom cholesterolu we krwi ozn czono jk opisno powyżej, zś wyniki zestwiono w Tbeli 8. Wrtość podn dl grupy, której podwno lek ozncz spdek poziomu cholesterolu (%) względem wrtości dl grupy kontrolnej, której nie podwno próbek leku. Tbel VIII Zwierzęt Spdek (%) Gnip?, której podwno próbki lek u 49,9 Grup kontroln 0 4. Rekcj n dwkę Próbki w fizjologicznym roztworze soli, zwierjące 0,1 mg-20 mg/ml biłk CRP podwno

9 doustnie w dziennej dwce 1 ml n szczur konwencjonlnym szczurom (6-tygodniowe smce, przeciętn wg cił 216 g, po 5 szczurów n grupę) przez 4 tygodnie. Poziom cholesterolu we krwi oznczno jk opisno powyżej (grupie kontrolnej nie podwno próbek leku). Wyniki oznczeń zestwiono w Tbeli 9. TbelIX Dwkownie (mg/szczur) Grup kontroln 0.1 ) Spdek (przeciętnie 9c) 0 9,80,7 14,31, J 51,10,9 5. Ostr toksyczność Próbki w fizjologicznym roztworze soli (0,5 ml/mysz) zwierjące 1,10 i 100 mg biłk CRP podwno śródotrzewnowo myszom ICR (6-tygodniowe smce, przeciętn wg cił 31,4t0,6 g, po 10 myszy w kżdej grupie). Bdni tntobiologiczne myszy prowdzono przez 14 dni. Grupie kontrolnej podwno fizjologiczny roztór soli. Wrtość LD50 obliczono według metody Behrens-Krber i wynosił powyżej 802 mg/kg wgi cił. Przy podwniu doustnym substncj t był zsdniczo biorąc nietoksyczn. 6. Preprty frmceutyczne (1) 50 mg oczyszczonego biłk CRP zmieszno dokłdnie z 250 mg oczyszczonej sproszko wnej skrobii i uformowno tbletki do podwni doustnie. Tbletkt odpowid dwce 1010 obrbinych termicznie komórek bkteryjnych/kg wgi cił dl dorosłej osoby o wdze cił 50 kg. (2) Biłko CRP możn jednorodnie zmieszć z podłożmi rozcieńczjącymi tkimi,jk węgln wpniowy, lktoz, itp., środkmi poślizgowymi tkimijk kws sterynowy, tlk itp. orz innymi dodtkmi i możn nstępnie uformowć tbletki do podwni doustnie. Tbletkt nhnnwśd dziennej dwce 0,1 mg 100 mg/kg wgi cił. (3) 900 mg biłk CRP zwieszono i rozpuszczono w 30 ml wody destylownej osłodzonej i nstępnie wykonno z niego syropy. Zstrzeżeni ptentowe 1. Sposób wytwrzni biłk obniżjącego poziom cholesterolu we krwi, które powoduje obniżenie poziomu cholesterolu we krwi ssków i posid nstępujące cechy chrkterystyczne: ) ms cząsteczkow oznczon metodą chromtogrfii żelowej: , b) punkt izoelektryczny: 7,90,2, c) skłd minokwsów (% molowe): glicyn glutminin lizyn wlin treonin seryn rginin metionin cystein 25,23 lnin 10,34 sprginin 6,39 leucyn 5,41 izoleucyn 4,23 tyrozyn 3,46 prolin 2,60 fenylolnin 1,56 histydyn 0,16 10,98 8,20 5,58 5,18 4,19 2,62 2,51 1,30 d) obrz elektroforezy:wyrźne psmo po stronie nody przy elektroforezie n żelu polikrylomidu, znmienny tym, że hoduje się mikroorgnizm nleżący do rodzju Streptococcus w odpowiedniej pożywce hodowlnej i z tej hodowli wyodrębni się biłko obniżjące poziom cholesterolu we krwi. 2. Sposób według zstrz. 1, znmienny tym, żejko hodowny miokroorgnizm stosuje się co njmniej jeden mikroorgnizm tki jk S. fecium, S. feclis, S. vium, S. bovis, S. slivrius, S. durns, S. mitis i S. equinus.

10 Sposób według zstrz. 1, znmienny tym, że jko hodowny mikroorgnizm stosuje się co njmniej jeden szczep tki jk S. fecium FERM BP-296, S. feclis FERM BP-297, S. vium FERM BP-299, S. durns FERM BP-300, S. mitis FERM BP-301 i S. eąuinus FERM BP Sposób według zstrz. 1, znmienny tym, że biłko obniżjące poziom cholesterolu we krwi otrzymuje się z hodowli tk, że rozryw się zebrne z hodowli komórki bkteryjne i wyodrębni się z nich frkcję biłkową. Fig. I 0

11 r Fig [ ;A ;B ;C ;D (67) Objętość roztworu eluującego [ml]

12 Fig F h Objętość roztworu eluującego [ml]

13 Fig. 4 O Objętość roztworu eluujgcego [ml]