(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/16 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07D 401/14 ( ) A61K 31/502 ( ) A61P 35/00 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Dwupodstawione pochodne ftalazyny będące antagonistami ścieżki hedgehog (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2012/17 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/08 (73) Uprawniony z patentu: Eli Lilly and Company, Indianapolis, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 PHILIP ARTHUR HIPSKIND, Indianapolis, US BHARVIN KUMAR PATEL, Indianapolis, US TAKAKO WILSON (NEE TAKAKUWA), Indianapolis, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Elżbieta Pietruszyńska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 25/P32421PL00 EP B1 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy antagonistów ścieżki Hedgehog, w szczególności zaś nowych 1,4- dwupodstawionych pochodnych ftalazyny oraz ich zastosowania terapeutycznego. Ścieżka przekazywania sygnału Hedgehog (Hh) odgrywa istotną rolę w tworzeniu struktur zarodkowych oraz w utrzymaniu dojrzałych tkanek przez kierowanie różnicowaniem i proliferacją komórek. Rodzina białek Hedgehog (Hh), do których należą Sonic Hedgehog (Shh), Indian Hedgehog (Ihh) i Desert Hedgehog (Dhh), stanowi wydzielane glikoproteiny ulegające modyfikacjom potranslacyjnym, w tym trawieniu autokatalitycznemu i sprzęganiu cholesterolu z peptydem aminokońcowym, z utworzeniem fragmentu mającego aktywność przekazywania sygnału. Hh wiąże białko transmembranowe Ptch mające dwanaście domen transmembranowych (Ptch1 i Ptch2), dzięki czemu zmniejsza się supresja receptora Smoothened (Smo) przez Ptch. Aktywacja Smo uruchamia serię procesów wewnątrzkomórkowych, których kulminację stanowi stabilizacja czynników transkrypcyjnych Gli (Gli1, Gli2 i Gli3) oraz ekspresja genów zależnych od Gli, odpowiedzialnych za proliferację, przeżycie komórek, angiogenezę i naciekanie. [0002] Przekazywanie sygnałów przez ścieżkę Hh skupia ostatnio znaczne zainteresowanie w związku z odkryciem, że nieprawidłowa aktywacja przekazywania sygnałów przez Shh prowadzi do rozwoju różnych nowotworów, np. raka trzustki, rdzeniaka, raka podstawnokomórkowego, raka drobnokomórkowego płuca i raka gruczołu krokowego.

3 2 WO ujawnia pewne 1,4-dwupodstawione pochodne ftalazyny, przy czym stwierdza się, że są one antagonistami ścieżki hedgehog. Podobnie WO ujawnia pewne 1,4-dwupodstawione pochodne ftalazyny związane z rozpoznawaniem i leczeniem stanów chorobowych związanych ze ścieżką hedgehog. WO ujawnia pewne 1,4-dwupodstawione pochodne ftalazyny, przy czym stwierdza się, że stanowią one opcję terapeutyczną w przypadku wszystkich nowotworów związanych z nieprawidłowym przekazywaniem sygnałów na ścieżce hedgehog. [0003] Nadal istnieje potrzeba dostarczenia silnych inhibitorów ścieżki hedgehog, w szczególności mających pożądany profil toksykologiczny. Niniejszy wynalazek dotyczy nowych 1,4-dwupodstawionych pochodnych ftalazyny będących silnymi antagonistami tej ścieżki. Konkretne związki według niniejszego wynalazku zapewniają pożądane interakcje lekowe oraz powiązane z nimi profile bezpieczeństwa w odniesieniu do odwracalnego i/lub nieodwracalnego (wskutek mechanizmu działania) potencjału hamowania układu CYP3A4. [0004] Niniejszy wynalazek dostarcza związek o wzorze I Wzór I w którym R 1 oznacza atom wodoru lub metyl; R 2 oznacza atom wodoru lub metyl; R 3, R 4, R 5, R 6 lub R 7 niezależnie oznaczają atom wodoru, fluoro, chloro, cyjano, trifluorometyl, trifluorometoksy, difluorometoksy, metylosulfonyl lub trifluorometylosulfonyl, pod

4 3 warunkiem, że co najmniej trzy spośród R 3, R 4, R 5, R 6 i R 7 oznaczają atom wodoru, lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól. [0005] Niniejszy wynalazek dostarcza także kompozycję farmaceutyczną zawierającą związek o wzorze I, lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól, w połączeniu z dopuszczalną farmaceutycznie substancją pomocniczą, nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. [0006] Niniejszy wynalazek dostarcza ponadto związek o wzorze I, lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól, do stosowania w leczeniu. Niniejszy wynalazek dostarcza ponadto związek o wzorze I, lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól, do stosowania w leczeniu raka. W szczególności, rak jest wybrany z grupy składającej się z następujących: rak mózgu, rak podstawnokomórkowy, rak przełyku, rak żołądka (ang. stomach cancer, gastric cancer), rak trzustki, rak dróg żółciowych, rak gruczołu krokowego, rak sutka, drobnokomórkowy rak płuca, niedrobnokomórkowy rak płuca, chłoniak z limfocytów B, szpiczak mnogi, rak jajnika, rak jelita grubego, rak wątroby, rak nerki, czerniak, rak głowy i szyi, międzybłoniak, mięsaki tkanek miękkich, mięsaki kości, białaczka i rak jądra. [0007] Ponadto niniejszy wynalazek dostarcza zastosowanie związku o wzorze I, lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli, do wytwarzania leku do leczenia raka. W szczególności, rak jest wybrany z grupy składającej się z następujących: rak mózgu, rak podstawnokomórkowy, rak przełyku, rak żołądka, rak trzustki, rak dróg żółciowych, rak gruczołu krokowego, rak sutka, drobnokomórkowy rak płuca,

5 4 niedrobnokomórkowy rak płuca, chłoniak z limfocytów B, szpiczak mnogi, rak jajnika, rak jelita grubego, rak wątroby, rak nerki, czerniak, rak głowy i szyi, międzybłoniak, mięsaki tkanek miękkich, mięsaki kości, białaczka i rak jądra. [0008] Ponadto niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję farmaceutyczną zawierającą związek o wzorze I, lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól, jako substancję czynną do leczenia raka wybranego z grupy składającej się z następujących: rak mózgu, rak podstawnokomórkowy, rak przełyku, rak żołądka, rak trzustki, rak dróg żółciowych, rak gruczołu krokowego, rak sutka, drobnokomórkowy rak płuca, niedrobnokomórkowy rak płuca, chłoniak z limfocytów B, szpiczak mnogi, rak jajnika, rak jelita grubego, rak wątroby, rak nerki, czerniak, rak głowy i szyi, międzybłoniak, mięsaki tkanek miękkich, mięsaki kości, białaczka i rak jądra. [0009] Konkretne związki o wzorze I lub jego dopuszczalne farmaceutycznie sole to związki, w których: (a) R 1 oznacza metyl; (b) R 2 oznacza metyl; (c) R 3, R 4, R 5, R 6 lub R 7 niezależnie oznaczają atom wodoru, fluoro, chloro, trifluorometyl lub metylosulfonyl; (d) R 3, R 4, R 5, R 6 lub R 7 niezależnie oznaczają atom wodoru, fluoro lub trifluorometyl; (e) co najmniej dwa spośród R 3, R 4, R 5, R 6 i R 7 niezależnie oznaczają fluoro, chloro, trifluorometyl lub metylosulfonyl, pod warunkiem, że R 3 i R 7 nie oznaczają jednocześnie atomu wodoru;

6 5 (f) co najmniej dwa spośród R 3, R 4, R 5, R 6 i R 7 niezależnie oznaczają fluoro lub trifluorometyl, pod warunkiem, że R 3 i R 7 nie oznaczają jednocześnie atomu wodoru; (g) R 4, R 6 i R 7 oznaczają atom wodoru; (h) R 3 i R 5 niezależnie oznaczają fluoro, chloro, trifluorometyl lub metylosulfonyl; oraz R 4, R 6 i R 7 oznaczają atom wodoru; (i) R 3 i R 5 niezależnie oznaczają fluoro lub trifluorometyl; oraz R 4, R 6 i R 7 oznaczają atom wodoru; (j) R 1 oznacza metyl; oraz R 2 oznacza metyl; (k) R 1 oznacza metyl; R 2 oznacza metyl; oraz R 3 R 4, R 5, R 6 lub R 7 niezależnie oznaczają atom wodoru, fluoro, chloro, trifluorometyl lub metylosulfonyl; (l) R 1 oznacza metyl; R 2 oznacza metyl; oraz R 3, R 4, R 5, R 6 lub R 7 niezależnie oznaczają atom wodoru, fluoro lub trifluorometyl; (m) R 1 oznacza metyl; R 2 oznacza metyl; oraz co najmniej dwa spośród R 3, R 4, R 5, R 6 i R 7 niezależnie oznaczają fluoro, chloro, trifluorometyl lub metylosulfonyl, pod warunkiem, że R 3 i R 7 nie oznaczają jednocześnie atomu wodoru; (n) R 1 oznacza metyl; R 2 oznacza metyl; oraz co najmniej dwa spośród R 3, R 4, R 5, R 6 i R 7 niezależnie oznaczają fluoro lub trifluorometyl, pod warunkiem, że R 3 i R 7 nie oznaczają jednocześnie atomu wodoru; (o) R 1 oznacza metyl; R 2 oznacza metyl; oraz R 4, R 6 i R 7 oznaczają atom wodoru; (p) R 1 oznacza metyl; R 2 oznacza metyl; R 3 i R 5 niezależnie oznaczają fluoro, chloro, trifluorometyl lub metylosulfonyl; oraz R 4, R 6 i R 7 oznaczają atom

7 6 wodoru; oraz (q) R 1 oznacza metyl; R 2 oznacza metyl; R 3 i R 5 niezależnie oznaczają fluoro lub trifluorometyl; oraz R 4, R 6 i R 7 oznaczają atom wodoru. [0010] Należy rozumieć, że następujące terminy, stosowane powyżej i w całej treści opisu wynalazku, mają następujące znaczenia, jeśli nie podano inaczej. [0011] Dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, rozcieńczalnik lub substancja pomocnicza to ośrodek ogólnie dopuszczony w dziedzinie do podawania środków czynnych biologicznie ssakom, np. ludziom. [0012] Sole dopuszczalne farmaceutycznie oznaczają stosunkowo nietoksyczne sole nieorganiczne i organiczne związków według niniejszego wynalazku. [0013] Ilość skuteczna terapeutycznie lub ilość skuteczna oznacza ilość związku o wzorze I, lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli, według niniejszego wynalazku lub kompozycji farmaceutycznej zawierającej związek o wzorze I, lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól, według niniejszego wynalazku, która powoduje odpowiedź biologiczną lub medyczną lub pożądane działanie terapeutyczne w tkance, układzie, u zwierzęcia, ssaka lub człowieka, do której dąży badacz, weterynarz, lekarz medycyny lub inny klinicysta. [0014] Terminy leczenie, leczyć, leczący i podobne mają obejmować spowolnienie lub odwrócenie postępu zaburzenia. Określenia te obejmują ponadto złagodzenie, poprawę stanu, osłabienie, wyeliminowanie lub ograniczenie jednego lub większej liczby objawów zaburzenia lub dolegliwości, nawet jeśli zaburzenie lub dolegliwość nie zostaną faktycznie wyeliminowane i

8 7 jeśli nawet sam postęp zaburzenia lub dolegliwości nie zostanie spowolniony lub odwrócony. [0015] Zgodnie ze standardowym nazewnictwem stosowanym w całej treści ujawnienia, część końcową określonego łańcucha bocznego podaje się najpierw, po czym następują kolejne grupy funkcyjne do miejsca połączenia. Na przykład podstawnik metylosulfonyl jest równoważny CH 3 -SO 2 -. [0016] Związki według niniejszego wynalazku mogą reagować, na przykład, z szeregiem kwasów nieorganicznych i organicznych tworząc dopuszczalne farmaceutycznie sole addycyjne z kwasami. Takie dopuszczalne farmaceutycznie sole oraz ogólna metodologia ich otrzymywania są dobrze znane w dziedzinie. Patrz np. P. Stahl i wsp., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, i wsp., Pharmaceutical Salts, Journal of Pharmaceutical Sciences, tom 66, nr 1, styczeń [0017] Ze związków według niniejszego wynalazku otrzymuje się preparaty farmaceutyczne w postaci kompozycji farmaceutycznych za pomocą dopuszczalnego farmaceutycznie nośnika, rozcieńczalnika lub substancji pomocniczej i podaje różnymi drogami. Takie kompozycje są korzystnie przeznaczone do podawania doustnego lub dożylnego. Takie kompozycje farmaceutyczne oraz sposoby ich otrzymywania są dobrze znane w dziedzinie. Patrz np. REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, i wsp., red., wyd. 19., Mack Publishing Co., 1995). [0018] Faktycznie podawaną ilość związków określa

9 8 lekarz po uwzględnieniu istotnych okoliczności, w tym stanu, który ma być leczony, wybranej drogi podania, faktycznego podawanego lub podawanych związków, wieku, masy ciała oraz odpowiedzi danego pacjenta na leczenie, a także nasilenia objawów u pacjenta. Dawka dobowa mieści się zazwyczaj w zakresie od około 0,1 do około 10 mg/kg masy ciała. W niektórych przypadkach odpowiednie mogą być poziomy dawkowania poniżej granicy dolnej powyższego zakresu, zaś w innych przypadkach można stosować jeszcze większe dawki. [0019] Związki o wzorze I, lub ich sole, można otrzymywać za pomocą różnych procedur znanych w dziedzinie, a także podanych na Schemacie oraz w Preparatykach i Przykładach poniżej. Konkretne etapy syntezy w przypadku każdej z opisywanych dróg można połączyć na różne sposoby w celu otrzymania związków o wzorze I lub ich dopuszczalnych farmaceutycznie soli. [0020] Jeśli nie zaznaczono inaczej, podstawniki są jak zdefiniowano wcześniej. Odczynniki i materiały wyjściowe są zasadniczo łatwo dostępne dla specjalistów w dziedzinie. Inne można otrzymać za pomocą standardowych metod chemii związków organicznych i heterocyklicznych, metod analogicznych do syntezy znanych związków o podobnej strukturze oraz procedur opisywanych w poniższych punktach Preparaty i Przykłady, w tym wszelkich procedur nowych. Nazwy w poniższych punktach Preparaty i Przykłady otrzymano wykorzystując funkcję nazywania Struct=Name w programie ChemDraw Ultra 10,0. [0021] Następujące pojęcia stosowane w niniejszym dokumencie mają podane znaczenia: Et 2 O oznacza eter

10 9 dietylowy; DMF oznacza dimetyloformamid; DMSO oznacza dimetylosulfotlenek; DMAC oznacza N,Ndimetyloacetamid; NMP oznacza N-metylopirolidynę; MeOH oznacza metanol; boc lub t-boc oznacza tertbutoksykarbonyl oraz IC 50 oznacza stężenie danej substancji pozwalające uzyskać 50% maksymalnej odpowiedzi hamującej możliwej dla tej substancji. [0022] Związek o wzorze I można otrzymać za pomocą reakcji przedstawionych na Schemacie. [0023] W etapie 1, ftalazynę dwupodstawioną fluorowcami (1) (X = Cl lub Br) poddaje się reakcji z piperydyną zabezpieczoną grupą 4-aminoboc (2) w reakcji aromatycznej substytucji nukleofilowej (SNAr), w wyniku czego otrzymuje się halopiperydyloftalazynę o wzorze (3). Reakcję prowadzi się w dipolarnym rozpuszczalniku aprotonowym, na przykład DMF, DMAC lub NMP, w obecności zasady organicznej lub nieorganicznej. Reakcję korzystnie prowadzi się w NMP, w obecności węglanu potasu, w temperaturze C.

11 10 [0024] W etapie 2, halopiperydyloftalazyna o wzorze (3) ulega reakcji sprzęgania krzyżowego według Suzuki z estrem kwasu pirazoloboronowego lub z samym kwasem (4). Na przykład halopiperydyloftalazynę (3) łączy się z estrem pinakolowym kwasu 1-metylo-1H-pirazolo-5- boronowego w obecności katalizatora palladowego, na przykład tetrakis(trifenylofosfino)palladu, i zasady nieorganicznej, na przykład wodorowęglanu sodu. Reakcję prowadzi się w mieszaninie rozpuszczalników toluenu/etanolu/wody otrzymując pirazoliloftalazynę o wzorze (5). [0025] Etap 3 stanowi proste odbezpieczenie grupy boc, które następuje w warunkach kwasowych, np. HCl w eterze dietylowym lub dioksanie, przy czym uzyskuje się aminopiperydynyloftalazynę o wzorze (6). Metody wprowadzania i usuwania grup zabezpieczających atomy azotu i tlenu są dobrze znane w dziedzinie (patrz np. Greene i Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, wyd. 3., John Wiley and Sons, New York, (1999)). [0026] W etapie 4, aminopiperydynyloftalazynę o wzorze (6) poddaje się acylowaniu uzyskując piperydynyloamid o wzorze I. W jednym sposobie, aminę poddaje się reakcji z odpowiednio podstawionym chlorkiem benzoilu w rozpuszczalniku obojętnym, na przykład dichlorometanie, w obecności zasady organicznej, na przykład trietyloaminy lub diizopropyloetyloaminy. Amid tworzy się ewentualnie przy użyciu odpowiednio podstawionego kwasu benzoesowego. Ester aktywny tworzy się za pomocą difenylofosfinianu pentafluorofenylu, a następnie w reakcji z aminą. Reakcja przebiega w mieszaninie rozpuszczalników DMF/DMSO w temperaturze około -10 do

12 C, w obecności zasady organicznej, na przykład trietyloaminy lub diizopropyloetyloaminy. Preparatyka 1 1-(4-Chloroftalazyn-1-ylo)piperydyn-4-ylo(metylo)- karbaminian tert-butylu [0027] [0028] Mieszaninę węglanu potasu (21,23 g, 153,6 mmol), 1,4-dichloroftalazyny (26 g, 128 mmol) oraz estru tertbutylowego kwasu metylopiperydyn-4-ylokarbamowego (30,01 g, 134,4 mmol) ogrzewano w N-metylopirolidynie (200 ml) w 80 C przez noc. Mieszaninę reakcyjną wylano do wody, ekstrahowano dichlorometanem, wysuszono nad Na 2 SO 4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano eter dietylowy i odsączono otrzymane ciało stałe (4- chloroftalazyn-1-ol powstały z zanieczyszczenia w materiale wyjściowym). Przesącz zatężono. Otrzymaną pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii błyskawicznej na żelu krzemionkowym (heksan : octan etylu = 2 : 1), uzyskując związek tytułowy w postaci białego ciała stałego (17,66 g, 37%). ES/MS m/z ( 37 Cl) 377,0. Preparatyka 2 1-(4-Chloroftalazyn-1-ylo)piperydyn-4-ylokarbaminian tert-butylu [0029] [0030] Związek tytułowy otrzymano zasadniczo zgodnie z

13 12 procedurą opisaną w preparatyce 1, stosując ester tertbutylowy kwasu piperydyn-4-ylokarbamowego. Mieszaninę reakcyjną schłodzono i wylano do wody (500 ml). Ekstrahowano octanem etylu, przemyto wodą, wysuszono nad Na 2 SO 4 i pod zmniejszonym ciśnieniem usunięto rozpuszczalniki otrzymując związek tytułowy w postaci żółtego ciała stałego (36 g, 97%). ES/MS m/z 363,0. Preparatyka 3 Metylo-(1-(4-(1-metylo-1H-pirazol-5-ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4-ylo)karbaminian tert-butylu [0031] [0032] Węglan sodu (3,82 g, 36,09 mmol), 1-(4- chloroftalazyn-1-ylo)piperydyn-4-ylo(metylo)karbaminian tert-butylu (6,8 g, 18,04 mmol) oraz ester pinakolowy kwasu 1-metylo-1H-pirazolo-5-boronowego (5,63 g, 27,1 mmol) umieszczono w kolbie z mieszaniną toluenu (50 ml), etanolu (17 ml) i wody (17 ml). Mieszaninę odgazowywano przez 10 min za pomocą gazowego azotu. Dodano tetrakis(trifenylofosfino)pallad (0,4 g, 0,35 mmol) i mieszaninę ogrzewano w 74 C przez noc. Mieszaninę schłodzono do temperatury otoczenia i rozcieńczono dichlorometanem. Warstwę organiczną przemyto solanką, wysuszono nad Na 2 SO 4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii błyskawicznej na żelu krzemionkowym (heksan : octan etylu : 2 M NH 3 w MeOH = 20 : 5 : 1), uzyskując związek tytułowy w

14 13 postaci żółtej pianki (5,33 g, 70%). ES/MS m/z 423,2. Procedura alternatywna otrzymywania metylo(1-(4-(1- metylo-1h-pirazol-5-ilo)ftalazyn-1-ylo)piperydyn-4- ylo)karbaminianu tert-butylu Preparatyki 4-6 Preparatyka 4 1,4-Dibromoftalazyna [0033] [0034] Do probówki ciśnieniowej wprowadzono pentabromek fosforu (24,5 g, 54,1 mmol) i 2,3-dihydroftalazyno-1,4- dion (5,00 g, 30,8 mmol). Probówkę zamknięto i ogrzewano w 140 C przez 6-7 h. Pozostawiono do schłodzenia przez noc. Ostrożnie otworzono probówkę uważając na ciśnienie. Zeskrobano ciało stałe i wylano do wody z lodem. Mieszano w wodzie z lodem i uzyskane ciało stałe zebrano za pomocą sączenia próżniowego. Wysuszono w piecu próżniowym otrzymując produkt końcowy (8,31 g, 93%). ES/MS ( 79 Br, 81 Br) m/z 288,8 (M+). Odnośnik: Can. J. Chem. 1965, 43, Preparatyka 5 1-(4-bromoftalazyn-1-ylo)piperydyn-4-ylo(metylo)- karbaminian tert-butylu [0035] [0036] Połączono 1,4-dibromoftalazynę (0,70 g, 2,38

15 14 mmol), N-metylopirolidon (7,0 ml), węglan potasu (395 mg, 2,86 mmol) i ester tert-butylowy kwasu metylopiperydyn-4-ylokarbamowego (532 mg, 2,38 mmol). Ogrzewano w 80 C przez noc. Schłodzono i wylano do wody. Zebrano ciało stałe i wysuszono w piecu próżniowym w temperaturze otoczenia przez noc otrzymując produkt końcowy (0,96 g, 95%). ES/MS m/z ( 81 Br) 421,0. Preparatyka 6 Metylo-(1-(4-(1-metylo-1H-pirazol-5-ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4-ylo)karbaminian tert-butylu [0037] [0038] Do probówki reakcyjnej wprowadzono 1-(4- bromoftalazyn-1-ylo)piperydyn-4-ylo(metylo)karbaminian tert-butylu (500 mg, 1,2 mmol), ester pinakolowy kwasu 1-metylo-1H-pirazolo-5-boronowego (370 mg, 1,8 mmol), węglan sodu (252 mg, 2,4 mmol), toluen (3,75 ml), etanol (1,25 ml) i wodę (1,25 ml). Mieszaninę reakcyjną odgazowywano azotem przez 10 min. Dodano tetrakis(trifenylofosfino)pallad (137,1 mg, 118,7 μmol). Przez kolejne 10 minut przez mieszaninę reakcyjną przepuszczano strumień azotu. Fiolkę reakcyjną zamknięto i ogrzewano w 90 C przez noc. Mieszaninę reakcyjną schłodzono i przesączono przez sączek z żelu krzemionkowego z elucją za pomocą 5% MeOH : CH 2 Cl 2. Frakcje zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym (2% 2 N NH 3 w

16 15 MeOH:CH 2 Cl 2 ) otrzymując produkt końcowy (345,6 mg, 69%). ES/MS m/z 423,2. Preparatyka 7 1-(4-(1H-Pirazol-5-ilo)ftalazyn-1-ylo)piperydyn-4- ylo(metylo)karbaminian tert-butylu [0039] [0040] Związek tytułowy otrzymano zasadniczo zgodnie z procedurą opisaną w preparatyce 3, stosując 1-(4- chloroftalazyn-1-ylo)piperydyn-4-ylo(metylo)karbaminian tert-butylu i ester pinakolowy kwasu 1H-pirazolo-3- boronowego; uzyskano 580 mg (67%). ES/MS m/z 409,2. Preparatyka 8 1-(4-(1-Metylo-1H-pirazol-5-ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4-ylokarbaminian tert-butylu [0041] [0042] Związek tytułowy otrzymano zasadniczo zgodnie z procedurą opisaną w preparatyce 3, stosując 1-(4- chloroftalazyn-1-ylo)piperydyn-4-ylokarbaminian tertbutylu; uzyskano 5,92 g (94%). ES/MS m/z 308,8 (M + ). Preparatyka 9 N-metylo-1-(4-(1-metylo-1H-pirazol-5-ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyno-4-amina [0043]

17 16 [0044] Metylo-(1-(4-(1-metylo-1H-pirazol-5- ilo)ftalazyn-1-ylo)piperydyn-4-ylo)karbaminian tertbutylu (7,77 g, 18,39 mmol) rozpuszczono w dichlorometanie (100 ml). Do roztworu dodano nadmiar 1 M chlorowodoru w eterze dietylowym (20 ml, 80 mmol) i mieszano w temperaturze otoczenia przez 2 h. Zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii błyskawicznej na żelu krzemionkowym (dichlorometan : 2 M NH 3 w MeOH = 10 : 1) uzyskując związek tytułowy w postaci żółtej pianki (5,83 g, 98%). ES/MS m/z 323,2. Produkty pośrednie podane w tabeli poniżej otrzymano zasadniczo zgodnie z procedurą opisaną w preparatyce 9, z następującym wyjątkiem: odpowiednią aminę zabezpieczoną grupą t-boc odbezpieczono za pomocą 4 M HCl w dioksanie. Preparatyka Nazwa chemiczna Struktura ES/MS m/z nr 10 1-(4-(1H-Pirazol-5-ilo)ftalazyn- 1-ylo)-N-metylopiperydyno-4- amina 309,2 (M+) amina 408,8 (M + ) 11 1-(4-(1-Metylo-1H-pirazol-5- ilo)ftalazyn-1-ylo)piperydyno-4- Przykład 1 4-Fluoro-N-metylo-N-(1-(4-(1-metylo-1H-pirazol-5- ilo)ftalazyn-1-ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (trifluorometylo)benzamid

18 17 [0045] [0046] Roztwór N-metylo-1-(4-(1-metylo-1H-pirazol-5- ilo)ftalazyn-1-ylo)piperrydyno-4-aminy (2,8 g, 8,68 mmol) i trietyloaminy (3,36 ml, 26,1 mmol) w CH 2 Cl 2 (30 ml) poddano reakcji z chlorkiem 4-fluoro-2- (trifluorometylo)benzoilu (2,14 ml, 10,42 mmol). Mieszano przez 3 h w temperaturze otoczenia. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii błyskawicznej na żelu krzemionkowym (heksan : octan etylu : 2 M NH 3 w MeOH = 20 : 5 : 1) uzyskując wolną zasadę w postaci żółtej pianki (3,83 g, 86%). ES/MS m/z 513,0. Przykład 1a Chlorowodorek 4-fluoro-N-metylo-N-(1-(4-(1-metylo-1H- pirazol-5-ilo)ftalazyn-1-ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (trifluorometylo)benzamidu [0047] 4-Fluoro-N-metylo-N-(1-(4-(1-metylo-1H-pirazol- 5-ilo)ftalazyn-1-ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (trifluorometylo)benzamid (7,13 g, 13,91 mmol) rozpuszczono w dichlorometanie (100 ml) i dodano nadmiar 1 N HCl w eterze dietylowym (30 ml, 30 mmol). Rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując związek tytułowy (7,05 g, 92%). ES/MS m/z 513,0. Analiza metodą NMR wykazała mieszaninę rotamerów amidu w stosunku 2:1. Rotamer główny: 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ 8,34 (m, 1H), 8,26 (m, 2H), 7,95

19 18 (m, 1H), 7,75 (m, 1H), 7,64 (m, 2H), 7,55 (m, 1H), 6,72 (d, 1H, J=2Hz), 5,15 (br, 1H), 4,71 (m, 1H), 4,22 (m, 2H), 3,84 (s, 3H), 3,48 (m, 2H), 2,65 (s, 3H), 2,19 (m, 2H), 1,89 (m, 2H). Rotamer poboczny: 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ 8,27 (m, 1H), 8,24 (m, 2H), 7,94 (m, 1H), 7,73 (m, 1H), 7,63 (m, 3H), 6,70 (d, 1H, J=2Hz), 5,15 (br, 1H), 4,71 (m, 1H), 4,07 (m, 2H), 3,81 (s, 3H), 3,16 (m, 2H), 2,92 (s, 3H), 1,90 (m, 2H), 1,62 (m 2H). [0048] Amidy podane w tabeli poniżej otrzymano zasadniczo zgodnie z procedurami opisanymi w przykładzie 1 i 1a, stosując odpowiednią piperydynyloftalazynę i podstawiony chlorek benzoilu. Przykład nr Nazwa chemiczna Struktura ES/MS m/z 2 Chlorowodorek 2-fluoro-N- metylo-n-(1-(4-(1-metylo- 1H-pirazol-5-ilo)ftalazyn- 513,0 1-ylo) piperydyn-4-ylo)-3- (trifluorometylo)- benzamidu 3 Chlorowodorek N-metylo-N- (1-(4-(1-metylo-1H- pirazol-5-ilo)ftalazyn-1-511,0 ylo)piperydyn-4-ylo)-4- (trifluorometoksy)- benzamidu 4 Chlorowodorek N-metylo-N- (1-(4-(1-metylo-1H- pirazol-5-ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (trifluorometoksy)- benzamidu 511,0 5 Chlorowodorek 5-fluoro-N- metylo-n-(1-(4-(1-metylo- 1H-pirazol-5-ilo)ftalazyn- 1-ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (trifluorometylo)- benzamidu 6 Chlorowodorek 3,5- dichloro-n-metylo-n-(1-(4- (1-metylo-1H-pirazol-5- ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4- ylo)benzamidu 513,0 ( 35 CI) 495,0

20 19 7 Chlorowodorek 4-cyjano-N- metylo-n-(1-(4-(1-metylo- 1H-pirazol-5-ilo)ftalazyn- 1-ylo)piperydyn-4- ylo)benzamidu 8 Chlorowodorek N-(1-(4-(1H- pirazol-5-ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4-ylo)-4- fluoro-n-metylo-2- (trifluorometylo)benzamidu 9 Chlorowodorek N-(1-(4-(1- metylo-1h-pirazol-5- ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4-ylo)-4- (trifluorometoksy)- benzamidu 10 Chlorowodorek N-(1-(4-(1- metylo-1h-pirazol-5-ilo) ftalazyn-1-ylo)piperydyn- 4-ylo)-2-(trifluorometoksy)benzamidu 526,2 499,0 497,0 497,0 11 Chlorowodorek 5-fluoro-N- (1-(4-(1 -metylo-1h- pirazol-5-ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (trifluorometylo)benzamidu 12 Chlorowodorek 4-fluoro-N- (1-(4-(1-metylo-1H- pirazol-5-ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (trifluorometylo)- benzamidu 13 Chlorowodorek 4-cyjano-N- (1-(4-(1 -metylo-1h- pirazol-5-ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4- ylo)benzamidu 499,0 499,0 438,0 Przykład 14 Chlorowodorek 4-chloro-N-metylo-N-(1-(4-(1-metylo-1H- pirazol-5-ilo)ftalazyn-1-ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (metylosulfonylo)benzamidu [0049]

21 20 [0050] N-Metylo-1-(4-(1-metylo-1H-pirazol-5- ilo)ftalazyn-1-ylo)piperydyno-4-aminę (100 mg, 0,31 mmol), kwas 4-chloro-2-(metylosulfonylo)benzoesowy (87 mg, 0,37 mmol) i diizopropyloetyloaminę (0,26 ml, 1,5 mmol) rozpuszczono w DMF : DMSO = 4:1 (2 ml) w 60 C. Schłodzono do 0 C i do roztworu dodano difenylofosfinian pentafluorofenylu (250 mg, 0,65 mmol) w DMF : DMSO = 1:1 (1 ml). Mieszaninę mieszano w 60 C przez noc. Mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury otoczenia i rozcieńczono CH 2 Cl 2, przemyto solanką, wysuszono nad Na 2 SO 4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii błyskawicznej na żelu krzemionkowym (heksan : octan etylu : 2 M NH 3 w MeOH = 20 : 5 : 1) otrzymując produkt. Do wyodrębnionego produktu dodano nadmiar 1 N HCl w eterze dietylowym (1 ml, 10 mmol) i usunięto rozpuszczalnik otrzymując związek tytułowy (150 mg, 84%). ES/MS m/z 539,0. [0051] Amidy podane w tabeli poniżej otrzymano zasadniczo zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 14, stosując odpowiednią piperydynyloftalazynę i podstawiony kwas benzoesowy.

22 21 Przykład nr Nazwa chemiczna Struktura ES/MS 15 Chlorowodorek N-metylo-N-(1- (4-(1-metylo-1H-pirazol-5- ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (metylosulfonylo)benzamidu m/z 505,0 16 Chlorowodorek 5-fluoro-Nmetylo-N-(1-(4-(1-metylo-1Hpirazol-5-ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (metylosulfonylo)benzamidu 17 Chlorowodorek N-metylo-N-(1- (4-(1-metylo-1H-pirazol-5- ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (trifluorometylosulfonylo)- benzamidu 18 Chlorowodorek 2-chloro-4- fluoro-n-metylo-n-(1-(4-(1- metylo-1h-pirazol-5- ilo)ftalazyn-1-ylo)- piperydyn-4-ylo)benzamidu 19 Chlorowodorek 2-cyjano-Nmetylo-N-(1-(4-(1-metylo-1Hpirazol-5-ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4- ylo)benzamidu 20 Chlorowodorek 4- (difluorometoksy)-n-metylo- N-(1-(4-(1-metylo-1H- pirazol-5-ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4- ylo)benzamidu 21 Chlorowodorek N-(1-(4-(1- metylo-1h-pirazol-5- ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (metylosulfonylo)benzamidu 22 Chlorowodorek 4-chloro-N-(1- (4-(1-metylo-1H-pirazol-5- ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (metylosulfonylo)benzamidu 476,0 559,0 ( 35 Cl) 479,0 452,0 493,0 491,0 ( 35 Cl) 525,0

23 22 23 Chlorowodorek N-(1-(4-(1- metylo-1h-pirazol-5- ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (trifluorometylosulfonylo)- benzamidu 24 Chlorowodorek 2-chloro-4- fluoro-n-(1-(4-(1-metylo-1h- pirazol-5-ilo)ftalazyn-1- ylo)piperydyn-4- ylo)benzamidu 545,0 ( 35 Cl) 465,0 [0052] Uważa się, że ścieżka Hedgehog stanowi czynnik przeżywalności dla następujących raków: rak podstawnokomórkowy; raki górnego odcinka przewodu pokarmowego (przełyku, żołądka, trzustki i dróg żółciowych); rak gruczołu krokowego; rak sutka; rak drobnokomórkowy płuca; rak niedrobnokomórkowy płuca; chłoniak z limfocytów B; szpiczak mnogi; rak żołądka; rak jajnika; rak jelita grubego; rak wątroby; czerniak; rak głowy i szyi; międzybłoniak; mięsaki tkanek miękkich; mięsaki kości; białaczka; rak jądra; rak nerek i rak mózgu. [0053] Stwierdzono, że pewne elementy ścieżki hedgehog mogą być potencjalnymi celami dla leków do leczenia raków. Linia komórkowa Daoy uzyskana z rdzeniaka (ATCC, HTB-186) reaguje na ligandy Hh. Kiedy komórki te poddaje się działaniu dodawanych z zewnątrz pożywek kondycjonowanych Shh, następuje aktywacja ścieżki przekazywania sygnału Hh, w wyniku czego zwiększa się ekspresja Gli1. Cyklopamina, alkaloid wyizolowany z lilii Veratrum californicum, jest słabym antagonistą ścieżki hedgehog; stwierdzono, że powoduje ona supresję ekspresji Gli1 w odpowiedzi na stymulację Shh. Niedawne obserwacje wskazują na to, że cyklopamina hamuje wzrost komórek rdzeniaka w hodowli oraz przeszczepów

24 23 alogenicznych. Jeśli stosuje się modelowy układ komórek Daoy, można zidentyfikować silne inhibitory szlaków przekazywania sygnałów hedgehog. Ponieważ związki według niniejszego wynalazku są antagonistami ścieżki hedgehog, nadają się do leczenia wymienionych powyżej rodzajów nowotworów. Oznaczanie aktywności biologicznej, IC 50 : Test czynnościowy do pomiaru hamowania Gli1 w komórkach Daoy [0054] Poniższy protokół badawczy oraz wyniki badań dodatkowo potwierdzają użyteczność i skuteczność związków oraz metod według niniejszego wynalazku. Testy czynnościowe wskazują, że związki według niniejszego wynalazku wykazują zdolność hamowania przekazywania sygnałów przez Shh. Wszystkie ligandy, rozpuszczalniki i odczynniki zastosowane w poniższym teście są łatwo dostępne w handlu lub specjalista w dziedzinie może je łatwo otrzymać. [0055] Aktywność biologiczną określa się stosując test czynnościowy na neuronalnych komórkach rakowych Daoy; poziom kwasu rybonukleinowego Gli1 mierzy się w układzie testowym bdna (rozgałęziony kwas dezoksyrybonukleinowy) (Panomics, Inc., Fremont, CA). Gli odkryto pierwotnie w linii komórkowej glejaka; koduje on białko stanowiące palec cynkowy, aktywowane wskutek przekazywania sygnału przez Shh. Maksymalną odpowiedź uzyskuje się indukując transkrypcję Gli1 w komórkach Daoy za pomocą pożywki kondycjonowanej (ludzkie komórki zarodkowe nerki HEK-293 wyrażające w sposób stabilny rekombinowane Shh) przez 24 godziny, po czym następuje pomiar ilości transkryptu Gli1 po stymulacji. Odpowiedź minimalna to ilość transkryptu

25 24 Gli1 w przypadku hamowania przy użyciu związku kontrolnego w komórkach Daoy, które stymulowano za pomocą pożywki kondycjonowanej (ludzkie komórki zarodkowe nerki HEK-293 wyrażające w sposób stabilny rekombinowane Shh) przez 24 godziny. [0056] Układ testowy bdna wykorzystuje technologię DNA o rozgałęzionym łańcuchu, co umożliwia amplifikację docelowego kwasu rybonukleinowego (transkryptu). W metodzie tej stosuje się trzy rodzaje syntetycznych, hybrydowych, krótkich sond cdna swoistych wobec Gli1, które określają swoistość transkryptu docelowego [elementy wydłużające do wychwytywania (CE), elementy wydłużające do znakowania (LE) i elementy blokujące (BL)], które hybrydyzują w postaci kompleksu z transkryptami docelowymi powodując wzmocnienie sygnału hybrydyzacji. Dodanie podłoża chemiluminescencyjnego w etapie amplifikacji umożliwia wykrywanie na podstawie luminescencji. [0057] Komórki Daoy hoduje się do konfluencji w kolbach T225 do hodowli tkankowych w pożywce hodowlanej do komórek Daoy zawierającej pożywkę podstawową (MEM) z 10% płodowej surowicy cielęcej (FBS) oraz 0,1 nm aminokwasów nieegzogennych i 1 mm pirogronianu sodu. Komórki wybiera się z kolb T225 za pomocą kompleksu trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA), odwirowuje, zawiesza w pożywce, a następnie dokonuje się zliczenia. [0058] Następnie komórki Daoy posiewa się w ilości komórek na studzienkę w pożywce hodowlanej w przezroczystych płytkach do hodowli tkankowych Costar 96 i pozostawia do inkubacji przez noc w 37 C w

26 25 atmosferze 5% dwutlenku węgla (CO 2 ). Komórki przemywa się jednokrotnie roztworem chlorku sodu buforowanym fosforanem (PBS), po czym dodaje 100 μl pożywki kondycjonowanej Shh (Shh-CM) w celu stymulacji poziomu ekspresji Gli1. Shh-CM rozcieńcza się, aby uzyskać stymulację maksymalną przy użyciu kontrolnej pożywki hodowlanej 0,1% FBS/DMEM (pożywka Eagle a w modyfikacji Dulbecco). Komórki Daoy traktowane Shh-CM poddaje się następnie działaniu różnych stężeń inhibitorów ścieżki hedgehog od około 1 μm do 0,1 nm. Związki badane pozostawia się do inkubacji przez 24 godziny w 37 C i 5% CO 2. [0059] Pomiar transkryptu Gli1 przeprowadza się za pomocą testu Quantigene 2.0 Gli1 zgodnie z instrukcjami producenta (Panomics, Inc.). Sporządza się bufor z rozcieńczoną mieszaniną do lizy (DLM), która zawiera proteinazę K. Po trwającej 24 godziny inkubacji ze związkiem komórki przemywa się jednokrotnie za pomocą PBS i do komórek dodaje się 180 μl DLM. Płytkę z komórkami zawierającą bufor do lizy zamyka się i umieszcza w 55 C na 30 do 45 minut. Następnie otrzymane lizaty komórkowe rozciera się pięciokrotnie. Roboczy zestaw sond zawierający sondy Gli1 sporządza się rozcieńczając sondy za pomocą DLM zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie na płytki do testów bdna wprowadza się 20 μl roboczego zestawu sond wraz z 80 μl lizatów komórek Daoy. Płytki zamyka się i inkubuje przez noc w 55 C. Z płytkami bdna postępuje się następnie zgodnie z instrukcjami producenta. Sygnał oznacza się ilościowo dokonując odczytu płytek za pomocą urządzenia Perkin Elmer Envision wykrywającego

27 26 luminescencję. Sygnał luminescencji jest wprost proporcjonalny do ilości transkryptu docelowego znajdującej się w próbce. [0060] Dane dotyczące sygnału luminescencji na podstawie testu czynnościowego wykorzystuje się do obliczenia wartości IC 50 w teście in vitro. Dane oblicza się na podstawie maksymalnych wartości kontrolnych (komórki Daoy traktowane Shh-CM) oraz minimalnej wartości kontrolnej (komórki Daoy traktowane Shh-CM z hamującym stężeniem związku kontrolnego 1 μm N-(3-(1H-benzo[d]imidazol-2-ilo)-4-chlorofenylo)-3,5- dimetoksybenzamidu). Do wyznaczenia wartości IC 50 wykorzystuje się czteroparametrowe dopasowanie krzywej logistycznej przy użyciu programów pakietu ActivityBase, wersja 5.3, równanie 205 (Instrukcja Assay Guidance Manual, wersja 5.0, 2008, Eli Lilly and Company oraz NIH Chemical Genomics Center). [0061] Zgodnie z opisanym protokołem związki, o których mowa w niniejszym dokumencie, wykazują wartości IC 50 < 40 nm. Na przykład związek z przykładu 1a wykazuje wartość IC 50 wynoszącą około 2,4 nm z błędem standardowym 0,5 (n=7, obliczonym jako średnia geometryczna i geometryczny błąd standardowy) w teście opisanym powyżej. Wyniki te potwierdzają, że związki według niniejszego wynalazku są silnymi antagonistami ścieżki hedgehog, w związku z czym są użyteczne jako środki antyrakowe. Test hamowania CYP3A4 [0062] Próbki do inkubacji sporządza się dodając Preparatyka ludzkich mikrosomów wątroby do badanego inhibitora (stężenia końcowe 0,05 mg/ml białka, 10 μm

28 27 inhibitora w 100 mm buforu NaPO 4 o ph 7,4) i miesza. Próbki poddaje się inkubacji wstępnej przez około pięć minut w 37 C. Po zakończeniu okresu inkubacji wstępnej rozpoczyna się reakcję dodając roztwór zawierający NADPH i midazolam jako substrat dla enzymu (stężenie końcowe 1 mm NADPH, 5 μm midazolamu). Po dodaniu roztworu NADPH próbki inkubuje się przez 3 minuty w temperaturze około 37 C. Po zakończeniu okresu inkubacji następuje zakończenie reakcji przez dodanie 50 μl metanolu (oraz wzorca wewnętrznego do chromatografii) i dokładnie miesza się próbki. Po zakończeniu reakcji mieszaninę odwirowuje się przy około 4000 obr/min przez 15 minut w temperaturze około 5 C i analizuje metodą LC/MS. [0063] Próbki analizuje się metodą HPLC/MS z elucją gradientową na krótkich, konwencjonalnych kolumnach C18 (faza ruchoma do obciążania - 95/5 Milli-Q H 2 O/metanol (v/v) z 1% kwasem octowym. Faza ruchoma B - 80/20 Milli-Q H 2 O/metanol (v/v) z 1% kwasem octowym. Faza ruchoma C - 5/95 Milli-Q H 2 O/metanol (v/v) z 1% kwasem octowym. Faza ruchoma do wypłukiwania - 75/25 Milli-Q H 2 O/acetonitryl (v/v)). [0064] Próbki wstrzykuje się do spektrometru masowego z monitorowaniem wybranych jonów (SIM) przy masie 342,1 (1-OH-midazolam) oraz 346,1 (α-hydroksymidazolam-d4, wzorzec wewnętrzny) przy użyciu rozpylania jonów turbo w warunkach dodatnich. Dane podaje się jako % hamowania tworzenia 1-OH-midazolamu w obecności inhibitora o stężeniu 10 μm. [0065] Zgodnie z opisanym protokołem związek z przykładu 1a wykazuje 13,5% hamowania CYP3A4. Związki,

29 28 takie jak związek z przykładu 1a, wykazujące niski i odwracalny potencjał hamowania CYP3A4, charakteryzują się zmniejszonym prawdopodobieństwem negatywnych interakcji z innymi lekami, które mogą powodować konieczność zmiany dawki leku lub odstawienia go u danego pacjenta. Dzięki temu takie związki są pożądane i charakteryzują się lepszym profilem bezpieczeństwa. Hamowanie CYP3A in vitro związane z mechanizmem działania enzymu [0066] Związek z przykładu 1a poddano ocenie jako inhibitor CYP3A związany z mechanizmem działania enzymu w celu uzyskania stałych kinetyki k inact i K I dla tego oddziaływania. (K inact jest maksymalną stałą szybkości tworzenia nieczynnego kompleksu enzymu. K I jest stężeniem dla połowy unieczynnienia maksymalnego). Związek poddaje się inkubacji z ludzkimi mikrosomami wątroby (pula ludzkich mikrosomów wątroby o dużej ekspresji aktywności CYP3A4) w trakcie dwuetapowej inkubacji in vitro: reakcja unieczynnienia, dzięki której inhibitor powoduje unieczynnienie enzymu, oraz test aktywności, w ramach którego ocenia się pozostałą aktywność białka mikrosomalnego wykorzystując 1 - hydroksylację midazolamu jako sondę. [0067] Reakcje unieczynnienia (objętość końcowa 100 μl) zawierające 100 mm buforu z fosforanem sodu (ph 7,4), 1 mm EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), bez dodatku lub w obecności 1 mm NADPH (fosforan dinukleotydu nikotynamidowo-adeninowego, zredukowany), przy stężeniach w zakresie od 0,75 μm do 24 μm związku badanego poddaje się inkubacji wstępnej przez 3 minuty w 37 C w trzech powtórzeniach. Reakcje unieczynnienia

30 29 rozpoczyna się dodając pulę mikrosomów o dużej aktywności CYP3A (CellzDirect, Austin TX, 0,5 mg/ml). W szeregu punktów czasowych (0, 2,5, 5, 10 i 30 minut), pobiera się porcje 5 μl mieszanin układów do unieczynniania i rozcieńcza w stosunku 1/20 do wstępnie ogrzanego (37 C) układu do inkubacji w teście aktywności CYP3A4 (95 μl), zawierającego 1 mm NADPH i midazolam (100 μm). Mieszaninę do testów aktywności w stężeniu końcowym białka wynoszącym 0,025 mg/ml i 1/20 stężenia inhibitora poddaje się inkubacji (37 C) przez dodatkową minutę, a następnie reakcję zatrzymuje się dodając 50 μl MeOH. Próbki miesza się i zdenaturowane białko usuwa przez wirowanie przy 4000 obr/min przez 10 minut. [0068] Tworzenie 1 -OH midazolamu określa się metodą LC/MS/MS z elucją gradientową na kolumnie Phenomenex Synergi 4μ Hydro-RP (faza ruchoma A - 95/5 Milli-Q H 2 O/metanol (v/v) z 5 mm octanu amonu, faza ruchoma B - 5/95 Milli-Q H 2 O/metanol (v/v) z 5 mm octanu amonu, rozpuszczalnik do przemywania igły A - 0,4% kwas trifluorooctowy w 90/10 acetonitrylu/milli-q H 2 O (v/v), rozpuszczalnik do przemywania igły B - 50/50 Milli-Q H 2 O/metanol (v/v)). Próbki wstrzykuje się do aparatu Sciex API 4000 z monitorowaniem wybranej reakcji przy masie 342,0 (1-OH-midazolam) i 347,0 (αhydroksymidazolam-d3, wzorzec wewnętrzny) przy użyciu rozpylania jonów turbo w warunkach dodatnich. [0069] Zmniejszenie tworzenia 1 -OH midazolamu (aktywność CYP3A4) podczas inkubacji mikrosomów wykreśla się jako logarytm procentowy pozostałej aktywności CYP3A4 w funkcji czasu inkubacji wstępnej

31 30 dla każdego stężenia związku badanego. Parametry kinetyczne unieczynniania wyznacza się za pomocą programu WinNonlin Professional dopasowując następujące równania do danych: Równanie nr 1: hamowanie procentowe (t) = 100 (t=0) * e (-λt) Gdzie λ definiuje się następująco Równanie nr 2: λ = (k inact * I)/(K I +1) [0070] Zmniejszenie aktywności związku z przykładu 1a pozostaje w zakresie 11% - 22% i nie zależy od stężenia. W związku z tym na podstawie równania nr 2 nie można określić wartości k inact i K I. Na podstawie tych danych stwierdza się, że związek z przykładu 1a nie jest inhibitorem CYP3A4 w związku z mechanizmem działania enzymu. Związki, takie jak związek z przykładu 1a, wykazujące niski nieodwracalny potencjał hamowania CYP3A4 w związku z mechanizmem działania enzymu lub brak takiego potencjału, charakteryzują się zmniejszonym prawdopodobieństwem negatywnych interakcji z innymi lekami, które mogą powodować konieczność zmiany dawki leku lub odstawienia go u danego pacjenta. Dzięki temu takie związki są pożądane i charakteryzują się lepszym profilem bezpieczeństwa. 1. Związek o wzorze Zastrzeżenia w którym: R 1 oznacza atom wodoru lub metyl;

32 31 R 2 oznacza atom wodoru lub metyl; oraz każdy spośród R 3, R 4, R 5, R 6 i R 7 niezależnie oznacza atom wodoru, fluoro, chloro, cyjano, trifluorometyl, trifluorometoksy, difluorometoksy, metylosulfonyl lub trifluorometylosulfonyl, pod warunkiem, że co najmniej trzy spośród R 3, R 4, R 5, R 6 i R 7 oznaczają atom wodoru; lub jego dopuszczalna farmaceutycznie sól. 2. Związek według zastrzeżenia 1, w którym R 1 oznacza metyl, lub jego dopuszczalna farmaceutycznie sól. 3. Związek według zastrzeżenia 1 lub 2, w którym R 2 oznacza metyl, lub jego dopuszczalna farmaceutycznie sól. 4. Związek według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-3, w którym każdy spośród R 3, R 4, R 5, R 6 i R 7 niezależnie oznacza atom wodoru, fluoro, chloro, trifluorometyl lub metylosulfonyl, lub jego dopuszczalna farmaceutycznie sól. 5. Związek według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-4, w którym każdy spośród R 3, R 4, R 5, R 6 i R 7 niezależnie oznacza atom wodoru, fluoro lub trifluorometyl, lub jego dopuszczalna farmaceutycznie sól. 6. Związek według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-5, w którym każdy spośród R 4, R 6 i R 7 oznacza atom wodoru, lub jego dopuszczalna farmaceutycznie sól. 7. Związek według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-6, który stanowi 4-fluoro-N-metylo-N-(1-(4-(1-metylo-1H- pirazol-5-ilo)ftalazyn-1-ylo)piperydyn-4-ylo)-2- (trifluorometylo)benzamid, lub jego dopuszczalna farmaceutycznie sól. 8. Związek według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-7, który stanowi chlorowodorek 4-fluoro-N-metylo-N-(1-(4-

33 32 (1-metylo-1H-pirazol-5-ilo)ftalazyn-1-ylo)piperydyn-4- ylo)-2-(trifluorometylo)benzamidu. 9. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-8, lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól, w połączeniu z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub substancją pomocniczą. 10. Związek według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-8, lub jego dopuszczalna farmaceutycznie sól, do stosowania w leczeniu. 11.Związek według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-8, lub jego dopuszczalna farmaceutycznie sól, do stosowania w leczeniu raka. 12.Związek lub jego dopuszczalna farmaceutycznie sól do stosowania według zastrzeżenia 11, przy czym rakiem jest rak mózgu, rak podstawnokomórkowy, rak przełyku, rak żołądka, rak trzustki, rak dróg żółciowych, rak gruczołu krokowego, rak sutka, drobnokomórkowy rak płuca, niedrobnokomórkowy rak płuca, chłoniak z limfocytów B, szpiczak mnogi, rak jajnika, rak jelita grubego, rak wątroby, rak nerki, czerniak, rak głowy i szyi, międzybłoniak, mięsaki tkanek miękkich, mięsaki kości, białaczka lub rak jądra. Eli Lilly and Company Pełnomocnik: