REAKTORY PRZEPŁYWOWE Wyznaczanie stałych równania kinetycznego reakcji izomeryzacji D- fruktozy do D-glukozy

Transkrypt

1 REATORY PRZEPŁYWOWE Wyznaczanie stałych ównania kinetycznego eakcji izomeyzacji D- fuktozy do D-glukozy Cel ćwiczenia: zapoznanie się z pacą eaktoa pzepływowego ze złożem upakowanym oaz poceduą postępowania pzy wyznaczaniu stałych ównania kinetycznego eakcji ównowagowej Izomeyzacja glukoza fuktoza Reakcja enzymatycznej izomeyzacji D-glukozy jest pzykładem eakcji ównowagowej, w któej enzym wykazuje powinowactwo zaówno do substatu, jak i poduktu eakcji. Reakcję izomeyzacji glukozy () i fuktozy () pzedstawia schemat (1), któy, pzy założeniu, że szybkości pzekształcania kompleksów aktywnych (E ) są badzo duże upaszcza się do schematu (2). + E E + E (1) + E E + E (2) W badaniach kinetycznych szybkość eakcji w obecności óżnych początkowych stężeń substatu miezona jest zazwyczaj w badzo wczesnym stadium eakcji, zanim stężenie poduktu wzośnie do znaczącego poziomu (stopień pzeeagowania substatu 3%). Pzy spełnieniu tego waunku, można wyznaczyć paamety kinetyczne eakcji zaówno w kieunku, jak i, stosując odpowiednie ównania Michaelisa-Menten: : : max (3) C max (4) C gdzie: max, max stałe szybkości eakcji dla glukozy lub fuktozy jako substatu;, stałe Michaelisa dla glukozy lub fuktozy jako substatu Rozpatując pzebieg pocesu izomeyzacji, należy wziąć pod uwagę fakt obecności substatu i poduktu eakcji w mieszaninie eakcyjnej, co m. in. pozwala oszacować kieunek pzebiegu eakcji. ieunek eakcji zależy od elacji między stosunkiem C / C a stosunkiem ównowagowym (eq). Np., jeżeli eq = 1, C = 5 mm i C = 1 mm, to eakcja będzie 1

2 pzebiegać w kieunku i osiągnie stan ównowagi temodynamicznej dla C* = 3 mm i C* = 3 mm (C*,C* - stężenie glukozy i fuktozy w stanie ównowagi temodynamicznej). Natomiast szybkość eakcji () dla danych watości C i C nie może być policzona jako óżnica szybkości eakcji = z ównań (1) i (2), gdyż ównania te opate są na założeniu, że, odpowiednio, C lub C są ówne zeo. W takim pzypadku należy zastosować ównanie uwzględniające wpływ obu eagentów, tzn. w miaę postępu eakcji obniżające się wysycenie enzymu substatem i wzastający udział eakcji w kieunku pzeciwnym. Jeżeli założymy, że część enzymu nie jest dostępna dla substatu, gdyż eaguje z poduktem, to możemy to zjawisko pzybliżyć modelem pzewidzianym dla inhibicji kompetycyjnej. Wówczas: : C (1 ) C max (5) : C (1 ) C max (6) a szybkość eakcji np. w kieunku : = (7) Po pzekształceniach algebaicznych ównanie (7) pzyjmuje postać: dc dt max C 1 C max (8) W ównaniu (8) 4 stałe kinetyczne ze stałą ównowagi eq wiąże ównanie Haldana: eq = C * / C * = max (9) max Powyższe ównanie ma badzo duże znaczenie paktyczne. Między innymi służy do szybkiej weyfikacji popawności wyznaczonych stałych z uposzczonych ównań (3) i (4). Jeżeli dysponuje się doświadczalnie wyznaczoną watością eq, to można ją poównać z watością obliczoną na podstawie ównania Haldana. Różnica między watością ekspeymentalną i obliczoną ze stałych ównań kinetycznych zędu błędu analitycznego pozwala stwiedzić popawność wyznaczonych watości stałych. 2

3 MATERIAŁY I METODY Mateiały - immobilizowana izomeaza glukozowa (popawnie: izomeaza ksylozowa) otzymana nieodpłatnie z fimy Novozymes; - objętość całkowita złoża 20 cm 3 - objętość wolna eaktoa () podana pzez powadzącą - tempeatua pocesu - 40 C - fuktoza, glukoza M bufo tis-hcl + 3 mmol Mg, ph 7.8 w 40 - odczynniki do enzymatycznego oznaczania stężenia glukozy Apaatua - spektofotomet U-IS Shimadzu; - temostatowane eaktoy kolumnowe - pompy tłokowe Pominent - temostatowane zbioniki do podgzewania substatu Metody: Pomia zmiany stężeń eagentów w waunkach początkowej szybkości eakcji M bufo tis-hcl ozcieńczyć 20 azy pzygotować 4L bufou. 2. W pzygotowanym bufoze ozpuścić po 500 cm 3 tzech oztwoów fuktozy albo dwóch glukozy o stężeniach podanych pzez osobę powadzącą. Substat wsypywać powoli do ok. 400 ml bufou, jednocześnie mieszając. Po całkowitym ozpuszczeniu, dopełnić w cylindze do 500 ml. Dobze wymieszać. 3. Do temostatowanych (40) eaktoów mieszalnikowych wlać substat o najniższym stężeniu, włączyć mieszanie i inkubować 10 min. 4. W czasie inkubacji pzygotować pobówki: Substat fuktoza (do 1 stężenia): 4 pobówki na póbki z eaktoa, pobówki z 1 ml odczynnika do oznaczania stężenia glukozy; uwzględnić 3-kotne powtózenia póbek badanych, standadu glukozy oaz 1 póbę odczynnikowa dla każdej seii pomiaowej. Substat glukoza (do 1 stężenia): (i) 4 pobówki na póbki z eaktoa i wyjściową póbkę substatu, (ii) pobówki z wodą lub bufoem do ozcieńczeń póbek badanych i wyjściowego substatu, uwzględnić 3-kotne powtózenia, (iii) pobówki z 1 ml odczynnika do 3

4 oznaczania stężenia glukozy; uwzględnić 3-kotne powtózenia póbek standadu glukozy oaz 1 póbę odczynnikowa dla każdej seii pomiaowej. 5. Po zakończeniu inkubacji substatu, do eaktoów kolumnowych ze złożem upakowanym dozować substat z podanymi szybkościami obotów pompy (szybkości zapisane są na pompie). Zacząć od największych stumieni. 6. Dla każdego ustawienia pompy zmiezyć stumień (zmiezyć czas napełnienia cylinda na 50 cm 3 ), a następnie pobać póbkę do analiz z wylotu z eaktoa, płynnie zmniejszyć wydajność pompy i czynność powtózyć dla pozostałych ustawień pompy. UWAA! Dla glukozy, jako substatu, pobać dodatkowo póbkę substatu ze zbionika na substat. Bak tych analiz to dyskwalifikacja pacy podgupy. UWAA!!! Stosując jako substat glukozę, należy wykonać ozcieńczenia pobanych póbek według tabeli: Stężenie glukozy [mm] Rozcieńczenie [-] Objętość oztwou badanego [l] Objętość wody [ml] 50 2x , x , x , x 500 9, x 500 9, x 250 9, x 250 9, x 200 9, x 200 9, x 100 9,9 Oznaczanie stężenia glukozy testem enzymatycznym. Zasada metody. lukoza pod wpływem oksydazy glukozowej utlenia się do kwasu glukonowego z wytwozeniem nadtlenku wodou, któy w obecności peoksydazy powoduje zmianę zabawienia chomogenu. 4

5 1. Z 4 póbek pobanych z wylotu eaktoa (substat: fuktoza; analizy wykonać w 3 powtózeniach) lub z 15 upzednio ozcieńczonych według tabeli póbek (substat glukoza) pobać po 10 l oztwou i wpowadzić do wcześniej pzygotowanych pobówek z odczynnikiem do enzymatycznego oznaczania stężenia glukozy. ażdoazowo kilkakotnie pzepłukać końcówkę odczynnikiem. 2. Z pojemnika z oztwoem standadu pobać po 10 l do tzech kolejnych pobówek z odczynnikiem analitycznym. 3. Pzygotować kontolę (zeowanie spektofotometu), gdzie zamiast badanej póby wpowadzić 10 L wody lub bufou. 4. Pobówki w statywie wstawić na 5 min do łaźni wodnej o tempeatuze 37, a następnie zmiezyć absobancję (500 nm) wobec póby kontolnej. Obliczanie stężenia glukozy. Watość absobancji dla standadu glukozy pzyjąć zgodnie z oznaczeniem na pojemniku.. Z popocji obliczyć stężenie glukozy w póbkach badanych. Wyznaczanie watości eq eakcji izomeyzacji. Wykozystać pzygotowane wcześniej 2 pobówki: jedną z 50 mm glukozą (C0), dugą z 50 mm glukozą oaz natywną izomeazą ( + E). Obie pobówki znajdują się w łaźni wodnej o tempeatuze 40. Zadaniem każdej podgupy pacującej z daną pompą jest pobanie póbki z obu oztwoów, ozcieńczenie dwukotne póbek wodą destylowaną oaz oznaczenie stężenie glukozy metodą enzymatyczną (obowiązują 3 powtózenia dla ozcieńczeń i 3 powtózenia standadu). Poszę pzygotować póbę odnośnikową. WYNII I ICH OPRACOWANIE 1. Dla każdego stężenia substatu w takcie ćwiczeń pzedstawić osobie powadzącej tabele wyników (pzykład: Tabela 1 i Tabela 2) z obliczonym: stężeniem poduktu (Cp), stężeniem glukozy (Cg), stumieniem ( ), czasem pzebywania (τ), stopniem pzeeagowania (α) oaz szybkością eakcji (). 2. Umieścić w spawozdaniu tabele zbiocze wyników, opatzone infomacją, co się obiło i po co oaz jakie były podstawy selekcji punktów do dalszych obliczeń. 5

6 3. Obliczyć paamety ównania Michaelisa-Menten, pamiętając o specyfice pepaatów immobilizowanych. 4. Obliczyć stałą ównowagi eq z otzymanych watości stałych ównania kinetycznego i poównać z watością eq, wyznaczoną ekspeymentalnie. 5. Dane poównać z danymi liteatuowymi (NIE BRENDA z danymi dla óżnych enzymów natywnych). 6. Obsewacje, wnioski. Spawozdanie winno zawieać: wstęp (np. chaakteystykę eaktoów pzepływowych ze szczególnym uwzględnieniem eaktoów ze złożem upakowanym, pzykłady eaktoów pzepływowych w biotechnologii, wykozystanie badanego enzymu w pzemyśle; uwaga! poziom Wiki to za mało), metodykę (należy pamiętać o fomie bezosobowej np. dodano, zmiezono...), pzykładowe obliczenia, wyniki i dyskusję wyników, obsewacje (analiza tabel) i wnioski. ZAADNIENIA DO WEJŚCIÓWI: 1. Instukcja. 2. Równanie bilansowe dla eaktoa pzepływowego. 3. Szybkość eakcji w eaktoze pzepływowym. 4. Definicja stanu ustalonego. 5. Czas pzebywania w eaktoze pzepływowym. Uwaga! Enzymatyczna metoda oznaczania stężenia glukozy jest mikometodą. Zlewki, cylindy, pobówki, itd. należy pzed myciem pzepłukać wodą z kanu, następnie umyć wodą z dodatkiem niewielkiej ilości Ludwika, po czym płukać dużą ilością wody z kanu (15x) i 3x wodą destylowaną. I należy pamiętać, że wszystko ma też powiezchnię zewnętzną. Ponieważ spawozdanie opiea się na wynikach wszystkich gup ćwiczeniowych, nieuwaga 1 osoby może być pzyczyną złych wyników gup następnych. onsekwencje baku utzymania odpowiedniej czystości szkła laboatoyjnego: kłopoty z wyznaczeniem stałych ównania kinetycznego, bak zgodności ze stałą ównowagi eakcji, poblemy z oceną z ćwiczeń. Podkeślam, że mikometoda nie jest odpowiedzialne za niepawidłowe wyniki. 6

7 Tabela 1 (uktoza, jako substat) C s,z,0 RP t Cp τ α [mm] [-] [s] [mm] [ml/s] [s] [%] [mm/s] Naważone * 50/t / Cp/C s,z,0*100% Cp/τ Standad Póbki z eaktoa Abs st.1 RP Abs 1 Abs 2 Abs 3 Abs ś Abs st.2 Abs st.3 Abs st.ś Tabela 2 (glukoza, jako substat) C s,z,0 RP t Cg Cp τ α [mm] [-] [s] [mm] [mm] [ml/s] [s] [%] [mm/s] C s,z,0 - Cg 50/t / Cp/C s,z,0*100% Cp/τ standad Abs st. 1 Abs st. 2 Abs st. 3 Abs st. ś. substat Abs subst1 Abs subst2 Abs subst3 Abs subst ś. póbki z eaktoa RP Abs1 Abs2 Abs3 Abs ś 7