RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)180818 (13) B1 (21 ) Numer zgłoszenia: 321039 (22) Data zgłoszenia: 29.12.1994 (86)Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 29.12.1994,PCT/US94/13268 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 11.07.1996, W096/20724, PCT Gazette nr 31/96 (51) IntCl7 Â61K 38/28 C12N 15/17 A61P3/10 (54) Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej, oraz polipepty d hybrydowy (43) Zgłoszenie ogłoszono: 24.11.1997 BUP 24/97 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.04.2001 WUP 04/01 (73) Uprawniony z patentu: BIO-TECHNOLOGY GENERAL CORP., Iselin, US (72) Twórcy wynalazku: Jacob R. Hartman, Holon, IL Simona Mendelovitz, Tel Aviv, IL Marian Górecki, Rehovot, IL (74) Pełnomocnik: Muszyński Andrzej, POLSERVICE PL 180818 B1 (57) 1. Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej obejmujący m ikrobiologiczną ekspresję rekombinowanego białka zawierającego insulinę, znam ienny tym, że obejmuje: (a)otrzymywanie polipeptydu hybrydowego zawierającego proinsulinę poprzez ekspresję tego polipeptydu hybrydowego w komórce bakteryjnej zawierającej DNA kodujący polipeptyd hybrydowy, przy czym ten DNA jest obecny w plazmidzie; (b) odzyskiwanie polipeptydu hybrydowego; (c)ufałdow yw anie i tworzenie wiązań dwusiarczkowych w polipeptydzie hybrydowym otrzymanym w (b), unikając uprzedniego poddawania polipeptydu hybrydowego siarczynolizie; (d)poddawanie uzyskanego w (c) ufałdowanego, z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi polipeptydu hybrydowego trawieniu enzymatycznemu w celu otrzymania insuliny; (e) oczyszczania tak wytworzonej insuliny.
Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej, oraz polipeptyd hybrydow y Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej obejmujący mikrobiologiczną ekspresję rekombinowanego białka zawierającego insulinę, znamienny tym, że obejmuje: (a)otrzymywanie polipeptydu hybrydowego zawierającego proinsulinę poprzez ekspresję tego polipeptydu hybrydowego w komórce bakteryjnej zawierającej DNA kodujący polipeptyd hybrydowy, przy czym ten DNA jest obecny w plazmidzie; (b)odzyskiw anie polipeptydu hybrydowego; (c)ufałdowywanie i tworzenie wiązań dwusiarczkowych w polipeptydzie hybrydowym otrzymanym w (b), unikając uprzedniego poddawania polipeptydu hybrydowego siarczynolizie; (d)poddawanie uzyskanego w (c) ufałdowanego, z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi polipeptydu hybrydowego trawieniu enzymatycznemu w celu otrzymania insuliny; (e)oczyszczania tak wytworzonej insuliny. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że plazmid został wybrany z grupy składającej się z pdbast-lat zdeponowanego pod numerem dostępu ATCC 69361, p λbast-lat zdeponowanego pod numerem dostępu ATCC 69363, pbast-r zdeponowanego pod numerem dostępu ATCC 69362. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekspresjonowanie z etapu (a) obejmuje fermentację w obecności glukozy, glicerolu lub galaktozy. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że odzyskiwanie w etapie (b) obejmuje: (i)niszczenie ściany komórkowej komórki bakteryjnej lub jej fragmentów w celu utworzenia lizatu; (ii) izolowanie wewnątrzkomórkowego precypitatu z lizatu przez wirowanie; i (iii)rozpuszczanie precypitatu. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ufałdowywanie i tworzenie wiązań dwusiarczkowych w etapie (c) obejmuje inkubację polipeptydu hybrydowego w temperaturze około 4-37 C w ciągu około 1-30 godzin w ph około 8,5-12,0. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że ph wynosi 11,0-11,25. 7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że inkubacja zachodzi w obecności kwasu askorbinowego. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że ph wynosi 11,0-11,25. 9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stężenie kwasu askorbinowego wynosi około 2 moli na mol grup SH obecnych w mieszaninie, w której zachodzi ufałdowywanie. 10. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że czas inkubacji wynosi około 5 godzin. 11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że czas inkubacji wynosi około 5 godzin. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (d) obejmuje ponadto: (i) doprowadzanie ph do około 8,8-9,0; i (ii) trawienie polipeptydu hybrydowego trypsyną i karboksypeptydazą B w temperaturze 16-37 C w ciągu 30 minut do 16 godzin. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie przez chromatografię na DEAE-Sepharose i RP-HPLC. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie przez ultrafiltrację i chromatografię na CM-Sepharose. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie przez chromatografię na DEAE-Sepharose i chromatografię na Phenyl-Sepharose.
180 818 3 16. Polipeptyd hybrydowy zawierający proinsulinę i peptyd liderowy połączony z N końcem proinsuliny, przy czym polipeptyd ten jest ufałdowany i posiada właściwe wiązania dwusiarczkowe. 17. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 16, znam ienny tym, że peptyd liderowy pochodzi z N końca CuZnSOD. 18. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 17, znam ienny tym, że peptyd liderowy obejmuje poprzedzone przez aminokwas Met, 62 aminokwasy, po których następuje reszta Arg. 19. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 16, znam ienny tym, że proinsulina zawiera łańcuch B insuliny kowalencyjnie związany z łańcuchem A insuliny pojedynczą resztą Arg. 20. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 16, znam ienny tym, że proinsulina zawiera łańcuch B insuliny kowalencyjnie związany z łańcuchem A insuliny dwupeptydem Lys-Arg. 21. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 16, znam ienny tym, że reszty cysteiny peptydu liderowego zostały zastąpione resztami seryny. * * * W opisie tym znajdująsię odniesienia do różnych publikacji poprzez liczby arabskie w nawiasach. Pełne informacje na temat tych odnośników można znaleźć przy końcu opisu. Ujawnienia tych publikacji, poprzez odnośniki literaturowe, włączono w ten sposób w całości do opisu w celu pełniejszego opisania stanu wiedzy, której dotyczy ten wynalazek. Insulina jest hormonem polipeptydowym mającym zasadnicze znaczenie w kontrolowaniu metabolizmu glukozy i podaje się ją codziennie pacjentom cierpiącym na cukrzycę, zaburzenie metaboliczne charakteryzujące się niedostatecznym dostarczaniem insuliny. In vivo hormon syntetyzowany jest najpierw w postaci długiej cząsteczki prekursorowej, następnie modyfikowany do jej postaci aktywnej biologicznie, składającej się z łańcucha A i łańcucha B. Bardziej szczegółowo, gen preproinsuliny ulega transkrypcji w komórkach beta gruczołu wydzielania wewnętrznego, trzustki, na prekursor mrna, z którego wycinane są następnie introny, z wytworzeniem dojrzałego mrna. mrna ten ulega translacji na preproinsulinę (NH2 preregion-łańcuch B-peptyd C-łańcuch A-COOH), która następnie ulega modyfikacjom z utworzeniem proinsuliny i ostatecznie insuliny. Pierwszym etapem modyfikacji jest proteolityczne usunięcie preregionu, który służy jako hydrofobowa sekwencja sygnałowa do przenoszenia powstającego łańcucha przez błony mikrosomalne szorstkiego retikulum endoplazmatycznego. W preproinsulinie ludzkiej długość preregionu wynosi 24 aminokwasy. W proinsulinie dwa regiony łańcucha polipeptydowego, które staną się dojrzałą insuliną, łańcuchy B i A, połączone są ze sobą peptydem C (lub łańcuchem C), który zawiera w końcach N i C dwie pary aminokwasów zasadowych. W większości peptydów C parami tymi są Arg-Arg i Lys-Arg. Ludzki peptyd C, włącznie z dwiema flankującymi parami aminokwasów zasadowych, obejmuje 35 aminokwasów. Peptyd C łączy dwie części polipeptydu w celu wspomagania tworzenia właściwych mostków dwusiarczkowych pomiędzy odcinkami A i B. Dlatego też, rola peptydu C nie zależy w znacznej mierze od jego struktury. W rzeczywistości, jego zastąpienie przez krótszy syntetyczny mostek nadal umożliwia właściwe ufałdowanie cząsteczki proinsuliny (1,2). Ufałdowywanie proinsuliny następuje z towarzyszącym utlenieniem dwóch międzyłańcuchowych wiązań dwusiarczkowych i jednego wiązania dwusiarczkowego w łańcuchu A. Na ostatnim etapie dojrzewania enzymy proteolityczne rozszczepiają przy aminokwasach zasadowych z uwolnieniem peptydu C i utworzeniem dojrzałej insuliny (3). W insulinie człowieka łańcuch A ma długość 21 aminokwasów, podczas gdy łańcuch B ma długość 30 aminokwasów. Światowe zapotrzebowanie na insulinę przekracza kilka ton rocznie i istnieje silny deficyt podaży. Tradycyjnie, insulinę wytwarzano z ograniczonych źródeł zwierzęcych, głównie preparatów trzustkowych bydła i świni. Insulina ta różni się od insuliny ludzkiej i może wywoływać niekorzystną reakcję immunologiczną. Badania przeprowadzone w latach 1960-tych zademonstrowały wytwarzanie insuliny in vitro. Syntezę insuliny uzyskano przez połączenie łańcuchów A i B w postaci S-sulfonowanej (4)
4 180 818 lub przez spontaniczne ponowne utlenianie zredukowanej proinsuliny (5).Ta ostatnia metoda nie była praktyczna do wytwarzania insuliny na dużą skalę z powodu bardzo niskiego stężenia białka w mieszaninie, w której zachodzi utlenianie. Insulinę można następnie odzyskać po traktowaniu trypsyną i karboksypeptydazą B (6). Ostatnio dostępna stała się półsyntetyczna i biosyntetyczna insulina ludzka. Półsyntetyczną insulinę ludzką wytwarza się z insuliny świni przez katalizowaną trypsyną wymianę alaniny na treoninę w pozycji 30 łańcucha beta (jedyna różnica pomiędzy insuliną świni i człowieka). Zrekombinowana insulina ludzka wytwarzana albo w E. coli, albo drożdżach, przypuszczalnie zastąpi insuliny wytwarzane wszystkimi innymi drogami. Biosyntetyczną zrekombinowaną insulinę ludzką produkuje się obecnie dwiema drogami: albo przez wytwarzanie oddzielnie łańcuchów A i B w E. coli i następnie ich łączenie (7,8), albo przez enzymatyczne przekształcenie polipeptydów podobnych do proinsuliny, otrzymywanych przez ekspresję albo w E. coli (1,8), albo drożdżach (2,9). W większości przypadków proinsulinę wytwarza się jako białko hybrydowe, które ulega akumulacji jako białko sprecypitowane wewnątrzkomórkowo. Hybrydę tę oczyszcza się normalnie i rozszczepia CNBr w celu uwolnienia polipeptydu proinsuliny. Ten ostatni modyfikuje się dalej przez oksydacyjną siarczynolizę do S-sulfonianu proinsuliny. Następnie S-sulfonian proinsuliny oczyszcza się i poddaje ufałdowaniu w warunkach redukujących z utworzeniem proinsuliny (8). Przekształcenie proinsuliny w insulinę uzyskuje się przez połączone działanie trypsyny i karboksypeptydazy B (6). Publikacja europejskiego opisu patentowego numer 195691 B 1, przyznanego Novo Nordisk A/S, opisuje proinsulinę o wzorze B-Lys-Arg-A i jej zastosowanie do przygotowywania insuliny w drożdżach. Publikacja europejskiego opisu patentowego numer 196056 B 1, przyznanego Chiron Corp., opisuje białko hsod-proinsuliny wytwarzane przez drożdże. Białko hsod-proinsuliny poddaje się przed ufałdowywaniem rozszczepieniu bromkiem cyjanu i siarczynolizie. Hoechst ujawnia w publikacji europejskiego opisu patentowego numer 379162, że błędne rekombinanty prekursorów insuliny (tj. zrekombinowane produkty insuliny z niewłaściwymi lub częściowo niewłaściwymi międzycząsteczkowymi mostkami dwusiarczkowymi) można przekształcać we właściwe produkty insuliny bez siarczynolizy przez poddawanie błędnych rekombinantów reakcji z nadmiarem markaptanu w środowisku wodnym w obecności organicznego układu oksydoredukcyjnego. Pierwotny etap siarczynolizy występuje po odszczepieniu (chemicznym lub enzymatycznym) z polipeptydu fuzyjnego rodnika aminokwasowego lub peptydowego (co zachodzi po lizie komórki gospodarza), po tym sześć reszt cysteiny prekursora insuliny przekształca się w ich S-sulfoniany. W kolejnym etapie renaturacji z tego S-sulfonianu proinsuliny wytwarza się naturalną proinsulinę przez utworzenie trzech właściwych mostków dwusiarczkowych. Podczas tego etapu renaturacji wytwarzane są tak zwane błędne rekombinanty. Hoechst ujawnia ponadto, w publikacji PCT międzynarodowego opisu patentowego numer WO 91/03550, sposób przygotowywania białek fuzyjnych obejmujących pożądane białko (np. proinsulinę) i składnik balastowy. Przed ufałdowywaniem przeprowadza się siarczynolizę, podczas gdy składnik balastowy odszczepia się jednocześnie z łańcuchem C proinsuliny, po ufałdowaniu. Ponadto, Hoechst opisuje w europejskim opisie patentowym numer 347781 B 1 mini-proinsulinę (B-Arg-A) i jej zastosowanie do przygotowywania mono-arg insuliny i insuliny. Opisują oni dalej białka fuzyjne, które obejmują B-Arg-A i składnik balastowy. Składnik balastowy odszczepia się przez działanie bromkiem cyjanu i przeprowadza siarczynolizę przed ufałdowywaniem polipeptydu. Wynalazek ten ujawnia wytwarzanie zrekombinowanej insuliny ludzkiej ulepszonym i wydajnym sposobem. Zrekombinowane polipeptydy hybrydowe proinsuliny, obejmujące sekwencję liderową, syntetyzuje się w E. coli. Po częściowym oczyszczeniu poddaje się je ufałdowaniu z wciąż przyłączonym peptydem liderowym w warunkach, które umożliwiają poprawne ufałdowanie. Aktywną biologicznie insulinę ludzką wytwarza się następnie przez łączne traktowanie trypsyną i karboksypeptydazą B, w wyniku czego enzymy te odszczepiają jednocześnie
180 818 5 peptyd łiderowy i łańcuch C. Oczyszczona insulina ludzka jest zatem identyczna z naturalnie występującą insuliną ludzką. Z tego nowego sposobu wyeliminowano niebezpieczne i niedogodne procedury związane z trawieniem polipeptydów hybrydowych CNBr i siarczynolizą stosowaną do blokowania licznych grup SH, ponieważ cały polipeptyd hybrydowy proinsuliny można efektywnie ufałdować w jego strukturę natywną nawet w obecności peptydu liderowego i nie zablokowanych reszt cysternowych. Aktywną zrekombinowaną insulinę ludzką uwalnia się przez trawienie proteolityczne i następnie oczyszcza. Krótki opis figur Mapy restrykcyjne trzech plazmidów przedstawionych na figurach 3-5 nie określają wszystkich miejsc restrykcyjnych obecnych w tych plazmidach. Jednakże, przedstawiono te miejsca restrykcyjne, które konieczne są do pełnego zrozumienia wynalazku. Figura 1: Wytwarzanie insuliny ludzkiej przez enzymatyczne rozszczepienie ufałdowanego, zawierającego wiązania dwusiarczkowe, polipeptydu hybrydowego proinsuliny wytworzonego przez ekspresję plazmidu pbast-r. Wskazano tylko część sekwencji liderowej SOD. Figura 2: Wytwarzanie insuliny ludzkiej przez enzymatyczne rozszczepienie ufałdowanego, zawierającego wiązania dwusiarczkowe, polipeptydu hybrydowego proinsuliny wytworzonego przez ekspresję plazmidu pdbast-lat lub p λjbast-lat. Wskazano tylko część sekwencji liderowej SOD. Figura 3: Struktura plazmidu pbast-r, plazmidu ekspresyjnego kodującego polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina, zdeponowanego w ATCC pod numerem dostępu ATCC 69362. Figura 4: Struktura plazmidu pdbast-lat, plazmidu ekspresyjnego kodującego polipeptydhybrydowy SOD-proinsulina, zdeponowanego w ATCC pod numerem dostępu ATCC 69361. Figura 5: Struktura plazmidu p λ,bast-lat, plazmidu ekspresyjnego kodującego polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina, zdeponowanego w ATCC pod numerem dostępu ATCC 69363. Figura 6: Sekwencja aminokwasowa i odpowiadająca sekwencja nukleotydowa DNA polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina, ulegającego ekspresji by plazmid pbast-r. Figura 7: Sekwencja aminokwasowa i odpowiadająca sekwencja nukleotydowa DNA polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina, eksprymowanego przez plazmidy pdbast-lat i p λbast-lat. Figura 8: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pbast w zależności od ph mieszaniny, w której prowadzi się ufałdowywanie. Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego proinsuliny (wytworzonego jak opisano w przykładzie 2) prowadzono w różnych ph, jak wskazano, w 100 mm buforze glicynowym, w temperaturze 4 C w ciągu około 16 godzin, przy stężeniu albo 1 mg/ml, albo 0,5 mg/ml polipeptydu hybrydowego. Ufałdowany materiał traktowano trypsyną(1 :500 w/w) w ciągu 30 minut w temperaturze 37 w ph 9 i oznaczano pod kątem immunoreaktywnej (IR) insuliny stosując oznaczenie radioimmunologiczne z wykorzystaniem 125J-insuliny (Amersham) i zrekombinowanej insuliny ludzkiej (Calbiochem) jako standardu. Figura 9: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat. Hybrydowy polipeptyd proinsuliny (wytworzony jak opisano w przykładzie 2) rozpuszczono w 8 M m oczniku, 5 mm H Cl w stężeniu około 30 m g/m l i rozcieńczono do stężenia 1 mg/ml 100 mm glicyną-naoh, ph 11,0. Ufałdowywanie prowadzono w temperaturze 22 C (temperatura pokojowa) w ciągu 20 godzin. ph roztworu doprowadzono następnie HCl do 8,8. Dodano karboksypeptydazę B (1:1000 w/w, Sigma) i trypsynę (1:2000 w/w, Sigma) i mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37 C w ciągu 60 minut. Mieszaniny, w których prowadzono trawienie zakwaszono do ph 3 przed rozcieńczeniem 10 mm HCl. Próbki o objętości 150 μl analizowano przez wysokociśnieniową chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC) na kolumnie 5 μ Lichrosphere 100 RP-8 (Merck) o wymiarach 250 x 4 mm, którą równoważono 50 mm fosforanem tetraetyloamonowym, 162 mm NaClO4, ph 3, zawierającym 31,5% (v/v)
6 180 818 acetonitryl. Kolumnę rozwijano liniowym gradientem 31,5-40,5% acetonitrylu podczas 75 minut przy szybkości przepływu 1 ml/minutę. Monitorowano absorbancję przy długości fali 220 nm. A: 5 μg insuliny standardowej (Boehringer-Mannheim); B: zrekombinowana insulina ludzka wytworzona w następstwie traktowania enzymatycznego; C: ufałdowany polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina. Figura 10: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat w zależności od ph mieszaniny, w której prowadzi się ufałdowywanie. Hybrydowy polipeptyd proinsuliny (wytworzony jak opisano w przykładzie 2) rozcieńczono do stężenia 1 mg/ml w 100 mm buforze glicyna-naoh posiadającym wskazane wartości ph i poddawano ufałdowaniu w temperaturze 22 C w ciągu 16 godzin. Traktowanie enzymami i analizę RP-HPLC przeprowadzono jak opisano dla figury 9. Ilość zrekombinowanej insuliny ludzkiej wytworzonej z polipeptydu hybrydowego obliczono na podstawie pola powierzchni piku, który posiadał ten sam czas retencji jak insulina standardowa. Figura 11: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat w zależności od stężenia kwasu askorbinowego w mieszaninie, w której prowadzi się ufałdowywanie. Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina (wytworzonego jak opisano w przykładzie 2) prowadzono przy stężeniu 1 mg/ml w 100 mm buforze glicyna-naoh w temperaturze 22 C w ph 11,2 w obecności wskazanych stężeń kwasu askorbinowego. Próbki traktowano trypsyną i karboksypeptydazą B (jak dla figury 9) po 5- i 25-godzinnych okresach ufałdowania. Wytwarzanie zrekombinowanej insuliny ludzkiej analizowano metodą RP-HPLC (jak dla figury 9). Figura 12: Autentyczność insuliny ludzkiej wytwarzanej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat. Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowgo SOD-proinsulina (wytworzonego jak opisano w przykładzie 2) prowadzono przy stężeniu 1 mg/ml w 100 mm buforze glicyna-naoh, ph 11,2, i w obecności 1,2 mm kwasu askorbinowego w temperaturze 22 C w ciągu 16 godzin. Po traktowaniu enzymatycznym (jak dla figury 9), mieszaninę poddano chromatografii na kolumnie z DEAE-Sepharose zrównoważonej 20 mm Tris-HCl, ph 8. Zrekombinowaną insulinę ludzką eluowano liniowym gradientem 0-0,4 M NaCl w 20 mm Tris-HCl, ph 8. Frakcje piku połączono i zakwaszono HCl do ph 3. Zrekombinowaną insulinę ludzką oczyszczono dalej od cząsteczek insulinopodobnych przez RP-HPLC, jak opisano dla figury 9. Główny pik zebrano, odsolono na kolumnie z Sephadex G-25 w 0,25 M kwasie octowym i zliofilizowano. Przygotowano próbki (5 μg zrekombinowanej insuliny ludzkiej) w 10 mm HCl i poddano analizie przez RP-HPLC w takich samych warunkach. A: insulina standardowa; B: zrekombinowana insulina ludzka oczyszczona przez HPLC; C: połączona próbka zrekombinowanej insuliny ludzkiej oczyszczonej przez HPLC i insuliny standardowej. Figura 13: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat w zależności od stężenia białka w mieszaninie, w której prowadzi się ufałdowywanie. Polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina (wytworzony jak opisano w przykładzie 2) poddawano ufałdowaniu w 100 mm buforze glicyna-naoh, ph 11,2, przy końcowym stężeniu białka od 0,5 mg/ml do 10 mg/ml, jak wskazano. Każdą mieszaninę, w której prowadzono ufałdowywanie, wzbogacono o 2,5 mola kwasu askorbinowego na mol grup SH. Ufałdowywanie przeprowadzono w temperaturze 24 C (temperatura pokojowa) w ciągu 16 godzin. Traktowanie enzymatyczne i analizę przez RP-HPLC przeprowadzono jak opisano dla figury 9. Figura 14: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat z nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego w zależności od czasu ufałdowywania.
180 818 7 Precypitat wewnątrzkomórkowy rozpuszczono w 20 mm buforze glicyna-naoh, 33 μm EDTA, ph 11,2 w stężeniu około 2,6 A280 na ml. ph doprowadzono do 12 10 N wodorotlenkiem sodowym. Roztwór pozostawiono z mieszaniem na 10 minut. ph zmiareczkowano do 11,2 stężonym kwasem solnym. Dodano węgiel aktywowany (przemyty kwasem, Sigma) do 0,1 % w/v stężenia końcowego i mieszaninę mieszano w ciągu 30 minut. Zawiesinę odwirowano (20 minut, 12 000 obrotów na minutę) w temperaturze 20 C. A280 sklarowanego supematantu wynosiła około 2,15. Uzupełniono kwas askorbinowy do 3 mm stężenia końcowego. Ufałdowywanie hybrydowego polipeptydu proinsuliny przeprowadzono jak przedstawiono, z energicznym mieszaniem w temperaturze pokojowej (22-23 C). W różnych punktach czasowych eksperymentu (począwszy od rozpuszczenia) pobierano próbki o objętości 10 ml, miareczkowano je do ph 8,8 i trawiono karboksydazą B (1:1000 w/w) i trypsyną(1 :2000 w/w) w ciągu 1 godziny w temperaturze 37 C w obecności 50 μm ZnCl2. Trawienie zakończono przez zakwaszenie. Zawartość insuliny w każdej poddanej trawieniu próbce określono przez analizę poprzez RP-HPLC, jak opisano dla figury 9. Postęp reakcji ufałdowania przejawia się zwiększeniem ilości insuliny (po strawieniu) i obniżeniem poziomu wolnych grup tiolowych, które oznaczano w reakcji Ellmana (16). Wynalazek ten dostarcza metodę wytwarzania insuliny ludzkiej, która obejmuje ufałdowywanie hybrydowego polipeptydu zawierającego proinsulinę w warunkach, które umożliwiają tworzenie właściwych wiązań dwusiarczkowych, poddawanie ufałdowanego polipeptydu z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi rozszczepieniu enzymatycznemu w celu utworzenia aktywnej insuliny ludzkiej oraz oczyszczanie aktywnej insuliny ludzkiej. Wynalazek ten dostarcza ponadto polipeptyd obejmujący proinsulinę oraz peptyd liderowy połączony z końcem N proinsuliny, przy czym polipeptyd jest ufałdowany i zawiera właściwe wiązania dwusiarczkowe. Plazmidy pbast-r, pdbast-lat i pa,bast-lat zdeponowano 26 lipca 1993 r. w E. coli stosownie do, i zgodnie z wymaganiami Porozumienia Budapesztańskiego o Międzynarodowym Uznawaniu Depozytu Mikroorganizmów do Celów Procedury Patentowej w American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, pod numerami dostępu ATCC odpowiednio 69362, 69361 i 69363. W znaczeniu tu stosowanym, polipeptyd hybrydowy obejmuje peptyd liderowy połączony kowalencyjnie z pożądanym polipeptydem. Polipeptyd hybrydowy według tego wynalazku obejmuje proinsulinę i korzystnie obejmuje SOD jako peptyd liderowy. W znaczeniu tu stosowanym, ufałdowywanie obejmuje ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego zawierającego proinsulinę bez rozszczepiania CNBr przed ufałdowywaniem i bez siarczynolizy dla zablokowania grup SH przed ufałdowywaniem, przy czym ufałdowywanie umożliwia tworzenie właściwych wiązań dwusiarczkowych polipeptydu hybrydowego. W znaczeniu tu stosowanym, tworzenie właściwych wiązań dwusiarczkowych polipeptydu hybrydowego obejmuje tworzenie trzech wiązań dwusiarczkowych pomiędzy CysB7-CysA7, CysB19-CysA20 i CysA6-CysA11 insuliny (reszty cysteiny ponumerowano według ich numeracji w dojrzałej insulinie). W znaczeniu tu stosowanym, proinsulina obejmuje polipeptyd obejmujący, kolejno od końca N do końca C, łańcuchy B, C i A insuliny. W znaczeniu tu stosowanym, peptyd łańcucha C insuliny obejmuje naturalnie występujący peptyd C oraz każdy inny oligopeptyd, dipeptyd lub pojedynczy aminokwas, który może zostać odszczepiony trypsynąi karboksypeptydazą B. W znaczeniu tu stosowanym, peptyd liderowy obejmuje każdy peptyd lub polipeptyd kowalencyjnie połączony z łańcuchem B insuliny, który umożliwia ufałdowanie i utworzenie wiązań dwusiarczkowych, i który można odszczepić stosując trypsynę. Korzystnie, peptydem liderowym jest SOD. W znaczeniu tu stosowanym, SOD obejmuje każdą zasadniczą część sekwencji aminokwasowej CuZnSOD lub MnSOD, i rzeczona część niekoniecznie posiada aktywność biologiczną SOD, ani niekoniecznie posiada identyczną sekwencję aminokwasową z sekwencją aminokwasową ta-
8 180 818 kiej części w porównaniu z naturalnie występującą SOD. DNA kodujący SOD można poddawać mutacji metodami znanymi specjalistom w tej dziedzinie, np. Bauer i in. (1985), Gene 37:73-81. Peptyd liderowy może obejmować, w miejsce SOD, każdy inny peptyd, polipeptyd lub białko, bądź każdą zasadniczą część sekwencji aminokwasowej takiego peptydu, polipeptydu lub białka, przy czym rzeczona część niekoniecznie posiada aktywność biologiczną rzeczonego peptydu, polipeptydu lub białka, ani niekoniecznie posiada identyczną sekwencję aminokwasową takiej części w porównaniu z sekwencją aminokwasową naturalnie występującego peptydu, polipeptydu lub białka; peptyd liderowy musi jednakże umożliwiać ufałdowanie i tworzenie właściwych wiązań dwusiarczkowych polipeptydu hybrydowego. W znaczeniu tu stosowanym, insulina może obejmować homolog naturalnie występującej insuliny. W znaczeniu tu stosowanym, proinsulina może obejmować homolog naturalnie występującej proinsuliny. W znaczeniu tu stosowanym, termin homolog dotyczący polipeptydu insuliny wytworzonego metodami według tego wynalazku, oznacza polipeptyd, który posiada zasadniczo taką samą sekwencję aminokwasową i zasadniczo taką samą aktywność biologiczną, jak insulina. A więc, homolog może różnić się od polipeptydu insuliny wytworzonego metodami według wynalazku przez dodanie, delecję lub podstawienie jednej lub więcej nie mających zasadniczego znaczenia reszt aminokwasowych, pod warunkiem, że otrzymany polipeptyd zachowuje aktywność biologiczną insuliny. Specjaliści w tej dziedzinie mogą łatwo określić, które reszty aminokwasowe można dodać, wydeletować lub podstawić (włącznie z tym, jakimi aminokwasami można dokonać podstawienia) stosując ustalone dobrze znane procedury, obejmujące na przykład konwencjonalne metody projektowania i wytwarzania kodujących sekwencji DNA do bakteryjnej ekspresji homologów polipeptydowych tego polipeptydu, modyfikację sekwencji cdna i genomowych technikami ukierunkowanej mutagenezy, konstruowanie zrekombinowanych białek i wektorów ekspresyjnych oraz pomiar aktywności biochemicznej polipeptydów z zastosowaniem konwencjonalnych oznaczeń biochemicznych. Powyższa d e f i nicja homologów insuliny w równym stopniu dotyczy homologów proinsuliny. Przykłady homologów insuliny wytworzonych metodami według tego wynalazku są homologi delecyjne, zawierające mniej niż wszystkie reszty insuliny występującej naturalnie, homologi substytucyjne, w których jedną lub więcej określonych reszt zastępuje się innymi resztami, i homologi addycyjne, w których jedną lub więcej reszt dodaje się do końców lub w środkowej części polipeptydu insuliny, przy czym wszystkie homologi wykazują aktywność biologiczną insuliny. Przykładami homologów są analogi insuliny ujawnione w europejskim zgłoszeniu patentowym numer 384472, a także analog insuliny Humalog Eli Lilly, jak ujawniono w Eli Lilly and Company Report to Shareholders 1992. Zasadniczo taką samą sekwencję aminokwasową określono w niniejszym opisie jako obejmującą podstawienia i/lub delecje i/lub addycje aminokwasów w sekwencji aminokwasowej i może obejmować ona do dziesięciu (10) reszt zgodnie z grupami homologicznymi lub równoważnymi, jak opisali np. Albert L. Lehninger, Biochemistry, wydanie drugie, Worth Publishers Inc. (1975), rozdział 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Anglia (1989) oraz Margaret O. Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, tom 5, The National Biomedical Research Foundation (1972), rozdział 9. Podstawienia takie są znane specjalistom w tej dziedzinie. DNA kodujący polipeptyd insuliny można poddawać mutacjom metodami znanymi specjalistom w tej dziedzinie, np. Bauera i in. (1985), Gene 37:73-81. Zmutowaną sekwencję można wstawiać do odpowiednich wektorów ekspresyjnych, jak opisano w niniejszym opisie, które wprowadza się do komórek, poddawanych następnie traktowaniu, w wyniku którego zmutowany DNA kieruje ekspresją homologu polipeptydu. Plazmidy według tego wynalazku, zawierające sekwencję kodującą polipeptyd hybrydowy obejmujący proinsulinę, m ogą być przystosowane do ekspresji w bakteriach, drożdżach,
180 818 9 grzybach lub komórkach ssaków, takich jak CHO, zarodkowe komórki kurczęcia, fibroblasty, bądź inne znane linie komórkowe, i dodatkowo zawierają elementy regulacyjne konieczne do ekspresji sklonowanego genu w bakteriach, drożdżach, grzybach lub komórkach ssaków, w taki sposób zlokalizowane w stosunku do kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd hybrydowy, aby umożliwiać jego ekspresję. Wymagane do ekspresji elementy regulujące obejm ują sekwencje promotorowe wiążące polimerazę RNA oraz miejsce wiążące rybosom. Plazmidy według tego wynalazku eksprym ują polipeptyd hybrydowy obejmujący proinsulinę. Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie zrozumiałe, że plazmidy zdeponowane w związku z tym zgłoszeniem można łatwo zmienić znanymi technikami (np. przez ukierunkowaną mutagenezę lub wstawianie łączników), aby kodowały ekspresję homologicznych polipeptydów. Techniki takie opisano np. w Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Odpowiednie elementy regulujące są położone w plazmidzie, w stosunku do DNA kodującego polipeptyd hybrydowy obejmujący proinsulinę, w taki sposób, że powodują ekspresję polipeptydu hybrydowego w odpowiedniej komórce gospodarza. W korzystnych rozwiązaniach wynalazku elementy regulujące umiejscowione są blisko przed DNA kodującym polipeptyd hybrydowy. W wynalazek ten włączone są także różne miejsca wiążące rybosomy (RBS) dla nadania mrna ulegającemu transkrypcji z DNA kodującego obejmujący proinsulinę polipeptyd hybrydowy zdolności wiązania z rybosomami w komórce gospodarza, takie jak RBS deo. Plazmidy według wynalazku zawierają także kodon inicjacji ATG. DNA kodujący polipeptyd hybrydowy obejmujący proinsulinę znajduje się w jednej ramce odczytu z kodonem inicjacji ATG. Plazmidy według wynalazku zawierają także sekwencję DNA obejmującą miejsce początku replikacji z plazmidu bakteryjnego zdolnego do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza. Odpowiednie miejsca początku replikacji można otrzymać z licznych źródeł, takich jak plazmid pbr322 (numer dostępu ATCC 37017). Plazmidy według tego wynalazku zawierają także sekwencję DNA, która zawiera gen odpowiedzialny za cechę fenotypową umożliwiającą selekcję lub identyfikację, która przejawia się, gdy plazmid obecny jest w komórce gospodarza, taki jak gen oporności, np. oporności na ampicylinę, chloramfenikol lub tetracyklinę. Przykładami wektorów, które można stosować do ekspresji kwasów nukleinowych kodujących polipeptydy hybrydowe (obejmujące proinsulinę) są wirusy, takie jak wirusy bakteryjne, np. bakteriofagi (takie jak fag lambda), kosmidy, plazmidy i inne wektory. Geny kodujące polipeptydy hybrydowe obejmujące proinsulinę wstawia się do odpowiednich wektorów metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Na przykład, wykorzystując konwencjonalne miejsca rozpoznawane przez enzym endonukleazę restrykcyjną można strawić zarówno wstawki, jak i wektor z utworzeniem końców z wzajemnie komplementarnymi parami zasad, które liguje się następnie stosując ligazę DNA. Alternatywnie, z DNA wstawki można zligować syntetyczne łączniki zawierające sekwencje zasad komplementarne do miejsca restrykcyjnego w DNA w e- ktora, który następnie trawi się enzymem restrykcyjnym przecinającym w tym miejscu. Dostępne są również inne sposoby. Korzystnymi komórkami gospodarza bakteryjnego są komórki E. coli. Przykładami odpowiednich komórek E. coli są szczepy SФ733 (cytrstra) lub 4300, ale inne szczepy E. coli i inne bakterie również można stosować jako gospodarzy plazmidów. Bakterie stosowane jako gospodarze mogą należeć do jakiegokolwiek szczepu, włącznie ze szczepami auksotroficznymi (takimi jak A 1645), prototroficznymi (takimi jak A4255) i litycznymi; szczepami F+ i F-; szczepami zawierającymi sekwencję represorową ci 857 profaga λ. (takimi jak A 1645 i A4255) oraz szczepami pozbawionymi represorów deo i/lub genu deo (patrz publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego numer 0303972, opublikowana 22 lutego 1989 r). Szczep E. coli SФ733 i szczep E. coli 4300 zdeponowano odpowiednio pod numerami dostępu ATCC 69361 i 69363.
10 180 818 Wszystkie opisane powyżej szczepy gospodarzy is. coli można wyleczyć z zawartych w nich plazmidów metodami dobrze znanymi w nauce, np. opisaną przez R.P. Novicka w Bacteriol. Review 33, 210 (1969) metodą z zastosowaniem bromku etydyny. Wynalazek ten dostarcza metodę wytwarzania insuliny, która obejmuje ufałdowywanie hybrydowego polipeptydu obejmującego proinsulinę w warunkach umożliwiających tworzenie właściwego wiązania dwusiarczkowego, poddawanie ufałdowanego, zawierającego wiązania dwusiarczkowe polipeptydu hybrydowego rozszczepieniu enzymatycznemu z wytworzeniem insuliny oraz oczyszczanie insuliny. Insulina posiada aktywność i właściwości komercjalnie dostępnej insuliny ludzkiej. W korzystnym rozwiązaniu, ufałdowywanie obejmuje inkubację polipeptydu hybrydowego w temperaturze około 4-37 C w ciągu okresu około 1-30 godzin w ph około 8,5-12,0. W innym korzystnym rozwiązaniu, ufałdowywanie obejmuje inkubację polipeptydu hybrydowego w temperaturze około 4-37 C w ciągu okresu około 1-30 godzin w ph około 8,5-12,0 w obecności kwasu askorbinowego. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, ph podczas ufałdowywania wynosi 11,0-11,25. W innym szczególnie korzystnym rozwiązaniu, stężenie kwasu askorbinowego wynosi około 2 moli na mol grup SH obecnych w mieszaninie, w której zachodzi ufałdowywanie. W jeszcze innym rozwiązaniu, okres inkubacji wynosi około 5 godzin. W innym rozwiązaniu, poddawanie ufałdowywaniu obejmuje doprowadzanie ph do około 8,8-9,0 i rozszczepianie polipeptydu hybrydowego trypsyną i karboksypeptydaząb w temperaturze około 16-37 C w ciągu około 30 minut do 16 godzin. W innym rozwiązaniu, oczyszczanie obejmuje chromatografię na DEAE-Sepharose i RP-HPLC. W jeszcze innym rozwiązaniu, oczyszczanie obejmuje ponadto ultrafiltrację i chromatografię na CM-Sepharose. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, oczyszczanie obejmuje ponadto chromatografię na DEAE-Sepharose i chromatografię na Phenyl-Sepharose. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, polipeptyd hybrydowy jest eksprymowany przez plazmid pdbast-lat zdeponowany pod numerem dostępu ATCC 69361. W innym korzystnym rozwiązaniu, polipeptyd hybrydowy jest eksprymowany przez plazmid pλbast-lat zdeponowany pod numerem dostępu ATCC 693363. W innym korzystnym rozwiązaniu, polipeptyd hybrydowy jest eksprymowany przez plazmid pbast-r zdeponowany pod numerem dostępu ATCC 69362. W korzystnym rozwiązaniu, polipeptyd hybrydowy otrzymuje się przez traktowanie komórki bakteryjnej zawierającym DNA kodujący polipeptyd hybrydowy, w taki sposób, aby DNA kierował jego ekspresją i odzyskiwanie polipeptydu hybrydowego z komórki. Uznaje się, że traktowanie obejmuje fermentację w obecności glukozy, glicerolu lub galaktozy. Uznaje się ponadto, że odzyskiwanie polipeptydu hybrydowego z komórki obejmuje zniszczenie ściany komórkowej komórki bakteryjnej lub jej fragmentów w celu utworzenia lizatu, izolowanie precypitatu wewnątrzkomórkowego z lizatu przez wirowanie, solubilizację precypitatu i ewentualnie oczyszczanie polipeptydu hybrydowego przez chromatografię lub ultrafiltrację. Wynalazek ten dostarcza ponadto polipeptyd obejmujący proinsulinę i peptyd liderowy połączony z końcem N proinsuliny, który to polipeptyd jest ufałdowany i zawiera właściwe wiązania dwusiarczkowe. W korzystnym rozwiązaniu, peptyd liderowy pochodzi z końca N CuZnSOD. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, peptyd liderowy obejmuje 62 aminokwasy poprzedzone aminokwasem M et i zakończone resztą Arg. W korzystnym rozwiązaniu, proinsulina obejmuje łańcuch B insuliny połączony z łańcuchem A insuliny pojedynczą resztą Arg. W innym rozwiązaniu, proinsulina obejmuje łańcuch B insuliny połączony z łańcuchem A insuliny dipeptydem Lys-Arg.
180 818 11 Powyższe dwie cząsteczki proinsuliny muszą zostać wytworzone jako białka hybrydowe, w innym przypadku poziomy ekspresji są skrajnie niskie i nie m ają znaczenia komercjalnego. We wszystkich korzystnych rozwiązaniach reszty cysteiny peptydu liderowego zastąpiono resztami seryny. Poniższe przykłady podano, aby pomóc w zrozumieniu wynalazku, ale nie są zam ierzone, i nie powinno się ich interpretować jako ograniczające w jakikolwiek sposób jego zakres. Przykłady nie obejmują szczegółowych opisów konwencjonalnych metod wykorzystanych podczas konstruowania wektorów, wstawiania genów kodujących polipeptydy do takich wektorów, oraz wprowadzania otrzymanych plazmidów do gospodarzy. Przykłady nie obejmują również opisu konwencjonalnych metod wykorzystanych do oznaczania polipeptydów w y- tworzonych przez takie układy gospodarz-wektor. Metody takie są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie i opisane zostały w licznych publikacjach, włącznie z podaną poniżej dla przykładu: Sambrook, J., Fritsch. E.F. i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, wydanie drugie, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Przykład 1. Konstruowanie plazmidów wytwarzających pbast-r, pdbast-lat i pa,bλ ST-LAT eksprymujących polipeptydy hybrydowe SOD-proinsulina Skonstruowano bakteryjne wektory ekspresyjne, które wytwarzają duże ilości białek hybrydowych w W.coli pod kontrolą albo promotora deo P1P2, albo λpl. Proinsulinę wytwarzano w postaci białka hybrydowego, ponieważ stwierdzono, że bakterie zawierające wektor ekspresyjny kodujący łańcuch B insuliny-lys-arg-łańcuch A insuliny nie wytwarzały wykrywalnego polipeptydu. Białka hybrydowe obejmują peptyd liderowy, o długości 62 aminokwasów, pochodzący z końca N CuZnSOD, poprzedzany od strony końca N resztą Met i zakończony od strony końca C resztą Arg łączącą go z łańcuchem B insuliny. Łańcuch B insuliny połączony jest z łańcuchem A insuliny krótkim peptydem łańcucha C, składającym się z Lys-Arg lub Arg. Dwie cysteiny oryginalnie występujące w części SOD zastąpiono resztami seryny. A. Plazmid pbast-r Skonstruowano szereg plazmidów zakończony pbast-r, który po transformacji właściwych komórek gospodarza E. coli był zdolny do kierowania wydajną ekspresją hybrydowego polipeptydu proinsuliny użytecznego do wytwarzania insuliny ludzkiej. Strukturę plazmidu pbast-r, kodującego hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-lys-arg-łańcuch A insuliny przedstawiono na figurze 3; sekwencję DNA i odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową polipeptydu hybrydowego przedstawiono na figurze 6. Plazmid pbast-r ma długość około 4380 bp i obejmuje następujące elementy (w kierunku odwrotnym do kierunku wskazówek zegara): 1. Fragment DNA o długości 1521 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami A atll-m scl w pbr322, który zawiera gen oporności na tetracyklinę. 2. Fragment DNA o długości 1497 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami S cal-h aell w pbr322, który zawiera skrócony gen oporności na ampicylinę i miejsce początku replikacji DNA. 3. Fragment DNA o długości 930 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami A vaii-n dei w D N A E. coli, który zaw iera promotory d eo P1P2 i miejsce wiążące rybosom (RBS) (13). 4. Fragment DNA o długości 188 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami N del-p pum I w cdna CuZnSOD człowieka. Cysteiny w pozycjach 6 i 57 dojrzałej SOD podstawiono resztami seryny przez mutagenezę ukierunkowaną wobec oligonukleotydu (12). 5. Syntetyczny fragment DNA o długości 172 bp, z końcami PpuM I i Bam HI. Region ten koduje Arg-łańcuch B insuliny-lys-arg-łańcuch A insuliny. 6. Syntetyczny poliłącznik o długości 36 bp, zawierający miejsce wielokrotnego klonowania, z końcami Bam HI i H indh II. 7. Syntetyczny oligonukleotyd o długości 44 bp, zawierający terminator transkrypcji TrpA, z końcami H indiii i AatII (10).
12 180 818 Plazmid pbast-r, który nadaje oporność na tetracyklinę i który koduje hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-lys-arg-łańcuch A insuliny, wprowadzono do szczepue. coli SФ733 (cytrstra) i zdeponowano 26 lipca 1993 r. w ATCC pod numerem dostępu ATCC 69362. B. Plazmid pdbast-lat Skonstruowano inny szereg plazmidów zakończony pdbast-lat, który po transformacji właściwych komórek gospodarza E. coli był zdolny do kierowania wydajną ekspresją hybrydowego polipeptydu proinsuliny użytecznego do wytwarzania insuliny ludzkiej. Strukturę plazmidu pdbast-lat, kodującego hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-arg-łańcuch A insuliny przedstawiono na figurze 4; sekwencję DNA i odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową polipeptydu hybrydowego przedstawiono na figurze 7. Plazmid pdbast-lat ma długość około 4377 bp i obejmuje następujące elementy (w kierunku odwrotnym do kierunku wskazówek zegara): 1. Fragment DNA o długości 1521 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami A atii-m sci w pbr322, który zawiera gen oporności na tetracyklinę. 2. Fragment DNA o długości 1497 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami S cal-h aell w pbr322, który zawiera skrócony gen oporności na ampicylinę i miejsce początku replikacji DNA. 3. Fragment DNA o długości 930 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami A vall-n deí w DNA E. coli, który zawiera promotory deo P 1P2 i RJBS (13). 4. Fragment DNA o długości 188 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami N del-ppum I w cdna CuZnSOD człowieka. Cysteiny w pozycjach 6 i 57 dojrzałej SOD podstawiono resztami seryny i zawartość par GC w tym fragmencie obniżono do 38% przez mutagenezę ukierunkowaną wobec oligonukleotydu (12). 5. Syntetyczny fragment DNA o długości 169 bp, z końcami PpuM I i Bam HI. Region ten koduje Arg-łańcuch B insuliny-arg-łańcuch A insuliny. 6. Syntetyczny poliłącznik o długości 36 bp, zawierający miejsce wielokrotnego klonowania, z końcami Bam HI i H indiii. 7. Syntetyczny oligonukleotyd o długości 44 bp, zawierający terminator transkrypcji TrpA, z końcami H indiii i AatII (10). Plazmid pdbast-lat, który nadaj e oporność na tetracyklinę i który koduj e hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-arg-łańcuch A insuliny, wprowadzono do szczepu E. coli SФ733 (cytrstra) i zdeponowano 26 lipca 1993 r. w ATCC pod numerem dostępu ATCC 69361. C. Plazmid p λbast-lat Skonstruowano inny szereg plazmidów zakończony p λbast-lat, który po transformacji zmienionych metodami inżynierii genetycznej komórek gospodarza E. coli (zawierających represor ci857) był zdolny do kierowania wydajną ekspresją hybrydowego polipeptydu proinsuliny użytecznego do wytwarzania insuliny ludzkiej. Strukturę plazmidu p λbast-r, kodującego hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-arg-łańcuch A insuliny przedstawiono na figurze 5; sekwencję DNA i odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową polipeptydu hybrydowego przedstawiono na figurze 7. Plazmid p λbast-lat ma długość około 3777 bp i obejmuje następujące elementy (w kierunku odwrotnym do kierunku wskazówek zegara): 1. Fragment DNA o długości 1521 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami A atii-m sci w pbr322, który zawiera gen oporności na tetracyklinę. 2. Fragment DNA o długości 1497 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami ScaI-H aell w pbr322, który zawiera skrócony gen oporności na ampicylinę i miejsce początku replikacji DNA. 3. Fragment DNA o długości 330 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami Bam HI-EcoRI w plazmidzie psodα13 (14), który zawiera promotor λpl i fragment A vrii-n dei o długości 30 bp zawierający miejsce wiążące rybosom deo.
180 818 13 4. Fragment DNA o długości 188 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami N dei -P pum I w cdna CuZnSOD człowieka. Cysteiny w pozycjach 6 i 57 dojrzałej SOD podstawiono resztami seryny i zawartość par GC w tym fragmencie obniżono do 38% przez mutagenezę ukierunkowaną wobec oligonukleotydu (12). 5. Syntetyczny fragment DNA o długości 169 bp, z końcami PpuM I i Bam HI. Region ten koduje Arg-łańcuch B insuliny-arg-łańcuch A insuliny. 6. Syntetyczny poliłącznik o długości 36 bp, zawierający miejsce wielokrotnego klonowania, z końcami Bam H I i Hind III. 7. Syntetyczny oligonukleotyd o długości 44 bp, zawierający terminator transkrypcji TrpA, z końcami H indiii i A atii (10). Plazmid pλ,bast-lat, który nadaje oporność na tetracyklinę i który koduje hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-arg-łańcuch A insuliny pod kontrolą promotora αxpl, wprowadzono do szczepu E. coli 4300 (F-, bio, cl857) i zdeponowano 26 lipca 1993 r. w ATCC pod numerem dostępu ATCC 69363. Komórki bakteryjne namnażano w temperaturze 30 C. Wytwarzanie polipeptydu hybrydowego indukowano po zmianie temperatury na 42 C. Przykład 2. Fermentacja, warunki wzrostu i oczyszczanie polipeptydów hybrydowych SOD-proinsulina I. Hodowle podstawowe Podstawową hodowlę szczepu E. coli SФ733, zawierającego plazmid pdblast-lat (lub pbast-r) namnażano na podłożu kazeinowym (29 g/litr hydrolizatu kazeinowego, 10 g/litr ekstraktu drożdżowego i 5 g/litr NaCl) wzbogaconego o tetracyklinę (10 mg/litr). Następnie hodowle rozcieńczano dwukrotnie podłożem do zamrażania i przechowywano w temperaturze -80 C. Podłoże do zamrażania: K2HPO4 6,3 g KH2PO4 1,8 g cytrynian sodowy 0,45 g M gs 04 7H2O 0,09 g (NH4)2SO4 0,9 g Glicerol 44 g Na 500 ml II. Inokulum Inokulum namnażano w podłożu do wytwarzania (patrz poniżej). Jałowe podłoże w kolbie do wytrząsania zaszczepiano hodowlą podstawową i inkubowano w ciągu 15 godzin na wytrząsarce w temperaturze 37 C i przy około 200 obrotach na minutę. Jeśli zachodziła potrzeba, przeprowadzano kolejne etapy namnażania inokulum w napowietrzanych fermentorach z mieszaniem. Jałowe podłoże zaszczepiano 2-10% hodowlą z kolby i inkubowano w ciągu 15 godzin w temperaturze 37 C w ph 7±0,5 z wytrząsaniem i napowietrzaniem dla utrzymania poziomu rozpuszczonego tlenu powyżej 20% nasycenia powietrzem. III. Wytwarzanie Podłoże do wytwarzania: K2HPO4 KH2PO4 cytrynian sodowy NH4Cl K2SO4 FeSO4 7H2O M gs04 7H2O 8 g/litr 2 g/litr 2 g/litr 3 g/litr 0,6 g/litr 0,04 g/litr 0,4 g/litr
14 180 818 CaCl2 roztwór pierwiastków śladowych tetracyklina glukoza glicerol Roztwór pierwiastków śladowych: MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O CoCl2 7H2O Na2M oo4 2H2O CaCl2 2H2O CuSO4 5H2O H3BO3 HCl (32%) M nso4 H2O M nso4 H2O MnSO4 H2O MnSO4 H2O 0,02 g/litr 3 ml/litr 0,01 g/litr 2 g/litr 1 ml/litr 1 g/litr 2,78 g/litr 2 g/litr 2 g/litr 3 g/litr 1,85 g/litr 0,5 g/litr 100 ml/litr 1 g/litr 1 g/litr 1 g/litr 1 g/litr Podłoże do wytwarzania zaszczepiano 0,5-10% hodowlą inokulum i inkubowano w temperaturze 37 C. Szybkości wytrząsania - napowietrzania ustawiono dla utrzymania poziomu tlenu powyżej 20% nasycenia powietrzem. ph utrzymywano na poziomie 7±0,2 stosując NH3. Dla dostarczenia źródeł energii i węgla wstrzykiwano jałowe roztwory 50% glukozy i 30% glicerolu. Po osiągnięciu stężenia komórek OD660 = 25, wstrzykiwano jałowe roztwory 10% glukozy i 30% glicerolu i namnażanie kontynuowano w ciągu około 5godzin, do uzyskania stężenia komórek około OD660 = 60. Następnie hodowlę schładzano i komórki odzyskiwano przez wirowanie. Fermentacja E. coli w obecności każdego związku spośród glukozy, glicerolu, galaktozy lub ich kombinacji jako źródła węgla ułatwiała ekspresję polipeptydów hybrydowych SOD-proinsulina. IV. Oczyszczanie Polipeptydy hybrydowe SOD-proinsulina eksprymowane przez plazmidy pbast-r i pdbast-lat ulegały akumulacji w precypitacie wewnątrzkomórkowym, który izolowano zgodnie z następującą procedurą: 1 g (mokrej masy) osadu bakteryjnego zawieszano w 10 ml buforu zawierającego 50 mm Tris-HCl, ph 8,0, 10 mm EDTA i traktowano lizozymem (Merck, 2500 u/ml) w temperaturze 37 C w ciągu 2 godzin. Następnie mieszaninę sonifikowano i dodawano Nonidet-P-40 (Sigma) lub Triton X 100 do 2% stężenia końcowego i mieszano w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Precypitat osadzano przez wirowanie i przemywano wodą. Polipeptyd hybrydowy oczyszczano prawie do homogenności przez chromatografię anionowymienną w następujący sposób. Precypitat rozpuszczono w 8 M moczniku, 20 mm Tris-HCl, 200 mm β-merkaptoetanolu, ph 8,2. Roztwór klarowano przez wirowanie i poddawano chromatografii na kolumnie z DEAE-Sepharose Fast-Flow (Pharmacia LKB), uprzednio zrównoważonej 8 M mocznikiem, 20 mm Tris-HCl, 20 mm β-merkaptoetanolem, ph 8,2. Zbierano materiał nie ulegający związaniu i białko hybrydowe wytrącano albo (NH4)2SO4 przy 40% nasycenia, lub zatężano przez ultrafiltrację przez membranę o przepuszczalności do 10 Kd, a następnie diafiltrację wobec 100 mm buforu glicyna-hcl, ph 3,1. Alternatywnie, polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina eksprymowany przez plazmid pbast-r oczyszczono prawie do homogenności przez rozpuszczenie w 8 M moczniku i przez ultrafiltrację kolejno przez membrany o przepuszczalności do 100 kd i 50 kd (Filtron). Polipeptyd hybrydowy zatężono na membranie o przepuszczalności do 10 kd i wytrącono (NH4)2SO4 przy 40% nasycenia.
180 818 15 Przykład 3. Ufałdowywanie i enzymatyczne rozszczepianie polipeptydów hybrydowych SOD-proinsulina Hybrydowe polipeptydy proinsuliny, otrzymane przez wytrącenie (NH4)2SO4 lub ultrafiltrację (przykład 2) rozpuszczano w 8 M moczniku, 5 mm HCl i rozcieńczano 100 mm buforem glicynowym, ph 8,5-12,0 do stężenia końcowego około 1 mg/ml. A. Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pbast-r odbywało się w temperaturze około 4-37 C w ciągu okresu około 1-24 godzin w celu umożliwienia utworzenia właściwych wiązań dwusiarczkowych. ph roztworu zawierającego ufałdowany polipeptyd hybrydowy z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi doprowadzano HCl do około 8,8-9,0 i białko traktowano trypsyną i karboksypeptydazą B w temperaturze 16-37 C w ciągu 30-120 minut. Po wielu eksperymentach stwierdzono, że optymalne warunki były następujące: polipeptyd hybrydowy eksprymowany przez plazmid pbast-r rozpuszczano w 8 M moczniku, 5 mm HCl i rozcieńczano 100 mm buforem glicynowym, ph 11,0 (figura 8) do stężenia końcowego około 1 mg/ml, po czym ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego odbywało się w ciągu 6-16 godzin w temperaturze 25 C, a następnie ufałdowany polipeptyd hybrydowy z utworzonymi mostkami dwusiarczkowymi rozszczepiano trypsyną (1:500 w/w) i karboksypeptydazą B (1:200 w/w) w temperaturze 37 C w ciągu 30-60 minut. Tworzenie insuliny przez enzymatyczne rozszczepienie ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi eksprymowanego przez plazmid pbast-r przedstawiono schematycznie na figurze 1. B. Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat odbywało się w temperaturze około 7-31 C w ciągu okresu około 5-30 godzin w celu umożliwienia utworzenia właściwych wiązań dwusiarczkowych. ph roztworu zawierającego ufałdowany polipeptyd hybrydowy z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi doprowadzano HCl do około 8,8-9,0 i białko traktowano trypsyną i karboksypeptydazą B w temperaturze 22-37 C w ciągu 30 minut do 16 godzin. Po wielu eksperymentach stwierdzono, że optymalne warunki były następujące: polipeptyd hybrydowy eksprymowany przez plazmid pdbast-lat rozpuszczano w 8 M moczniku, 5 mm HCl i rozcieńczano 100 mm buforem glicynowym, ph 11,0-11,25 (figura 8) do stężenia końcowego około 1 mg/ml, po czym ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego odbywało się w ciągu 5 godzin w temperaturze 25 C, a następnie ufałdowany polipeptyd hybrydowy z utworzonymi mostkami dwusiarczkowymi rozszczepiano trypsyną (1:15 000 w/w) i karboksypeptydazą B (1:10 000 w/w) w temperaturze 25 C w ciągu 16 godzin. Tworzenie insuliny przez enzymatyczne rozszczepienie ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat przedstawiono schematycznie na figurze 2. Przykłady warunków specyficznych dla obu powyższych both A i B podano szczegółowo w legendach do figur 8-14. Przykład 4. Analiza białkowa i oczyszczanie insuliny ludzkiej z polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pbast-r Tworzenie insuliny ludzkiej z polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pbast/r określano przez oznaczenie radioimmunologiczne i RP-HPLC, jako standard stosując komercjalną insulinę ludzką (Calbiochem). Teoretyczna wydajność zrekombinowanej insuliny ludzkiej, obliczona na podstawie sekwencji aminokwasowej polipeptydu hybrydowego proinsuliny, wynosi 45,6%. Na podstawie figury 8 jest oczywiste, że optymalne ufałdowywanie zachodzi w ph 11. Przy tej wartości ph wytwarzanie insuliny stanowi około 80% wydajności teoretycznej (co odpowiada około 40% wyjściowej ilości polipeptydu hybrydowego). Insulinę ludzką wytwarzaną z polipeptydu hybrydowego proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pbast-r wykrywano przez RP-HPLC. Stosowano kolumnę Vydac 218TP54 o wymiarach 250 x 4,6 mm (średnica wewnętrzna) (Separation Group), 5 μ, wielkość porów 300 Å w temperaturze pokojowej przy szybkości przepływu 1 ml/min. Jako eluent A stosowano 0,1 %
16 180 818 kwas trifluorooctowy (TFA) w H2O, a jako eluent B 0,08% TFA w acetonitrylu. Kolumnę przemywano w ciągu 5 minut buforem równoważącym (25% eluent B), a następnie, w ciągu 37,5 minut, liniowym gradientem 25-50% eluentu B. Absorbancję monitorowano przy długości fali 220 nm lub 280 nm. Analiza insuliny ludzkiej po trawieniu enzymatycznym ufałdowanego polipeptydu hybrydowego z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi z zastosowaniem wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami ujawniła główny pik o takim samym czasie retencji, jak standardowa insulina ludzka. Przygotowano dwie szarże na małą skalę, otrzymując odpowiednio 26 mg i 13 mg insuliny ludzkiej. Insulinę ludzką oczyszczono z roztworu poddanemu traktowaniu enzymatycznemu (ph 9) przez ultrafiltrację przez membranę o przepuszczalności do 3 Kd lub 5 Kd (Filtron), a następnie chromatografię na CM-Sepharose (bufor cytrynianowy, ph 3). Frakcje piku odsolono, zliofilizowano i poddano sekwencjonowaniu końca N i analizie składu aminokwasowego. Skład aminokwasowy obu szarży zrekombinowanej insuliny ludzkiej był zasadniczo identyczny z naturalnie występującą insuliną ludzką (patrz tabela 1, preparat 1). Sekwencję 5 aminokwasów końca aminowego preparatów insuliny określono przez degradację Edmana. Stwierdzono, że jest ona identyczna z końcem NH2 zarówno łańcucha A, jak i B insuliny ludzkiej, co potwierdza autentyczność produktu otrzymanego in vitro. Jednakże, wyniki sekwencjonowania wskazują na obecność dodatkowej reszty Arg w pierwszej pozycji w około 25% cząsteczek. Wynik ten odpowiada rozszczepieniu przez trypsynę pomiędzy Lys i Arg, wewnątrz sekwencji łącznikowej, z pozostawieniem zatem dodatkowej reszty Arg na końcu aminowym łańcucha A. Stwierdzono, że specyficzną hydrolizę przez trypsynę po C-końcowej stronie Arg można uzyskać przez przeprowadzenie reakcji w ph 11. W tym podwyższonym ph większość grup ɛ-aminowych Lys nie jest obdarzona ładunkiem (pk = 10,3), umożliwiając zatem selektywne rozszczepienie. Przez przeprowadzenie etapu trawienia trypsyną w ph 11 (patrz Tabela 1, preparat 2), po którym przeprowadzono trawienie karboksypeptydazą B w ph 8,5, uzyskano dwa preparaty 1 mg i 6,5 mg oczyszczonej insuliny. Sekwencjonowanie N-końców ujawniło, że ilość insuliny zawierającej dodatkową Arg została obniżona do około 5%. Aminokwas Tabela 1 Skład aminokwasowy zrekombinowanej insuliny ludzkiej Liczba reszt Teoretyczna Insulina standardowa Preparat 1 Preparat 2 1 2 3 4 5 Asx 3 3,20 3,38 3,26 Thr 3 2,98 2,83 2,68 Ser 3 2,84 2,53 2,77 Glx 7 7,15 7,73 7,23 Pro 1 1,28 1,13 1,09 Gly 4 4,24 4,39 4,25 Ala 1 1,00 1,28 1,04 Cys 6 5,88 5,11 5,79 Val 4 3,82 4,58 3,88 Ile 2 2,04 1,96 1,96
180 818 17 1 2 3 4 5 Leu 6 5,87 6,10 5,99 Tyr 4 3,80 3,80 3,87 Phe 3 3,15 3,56 3,03 His 2 2,04 2,05 2,08 Lys 1 1,01 1,05 1,02 Arg 1 0,96 1,30 1,18 c.d. tabeli 1 Preparat 1 i 2 przedstawiają skład aminokwasowy zrekombinowanej insuliny ludzkiej wytworzonej z polipeptydu hybrydowego proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pbast-r. Rozszczepienie trypsyną przeprowadzono w ph 9 (preparat 1) lub w ph 11 (preparat 2). Analizę składu aminokwasowego prowadzono po przeprowadzeniu utleniania reszt kwaśnych i hydrolizy w fazie gazowej oczyszczonych preparatów insuliny. Przykład 5. Analiza peptydowa oczyszczonej insuliny ludzkiej wytworzonej z polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pbast-r Oczyszczoną insuliną ludzką, wytworzoną jak opisano w powyższych przykładach, poddano analizie peptydowej wykorzystując endoproteinazę Glu-C (Sigma), która hydrolizuje wiązania polipeptydowego karboksylowej stronie reszt glutamylowych. Bardziej szczegółowo, próbki insuliny (100 μg), wytworzonej przez rozszczepienie ufałdowanego hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pbast-r, trawiono 5 μg Glu-C w ciągu 6 godzin w temperaturze 37 C w objętości 100 μl 0,1 M Tris-HCl, ph 7,8. Przeprowadzono analizę HPLC: próbki komercjalnie dostępnej (kontrolnej) insuliny i insuliny wytworzonej przez rozszczepienie ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi, eksprymowanej przez plazmid pbast-r zakwaszono do ph około 3 i rozdzielono przez RP-HPLC. Zastosowano kolumnę Vydac 218TP54, o wymiarach 250 x 4,6 mm (średnica wewnętrzna), 5 μ, wielkość porów 300 Å. Kolumnę zrównoważono 50 mm fosforanem tetraetyloamonowym, 162 mm NaClO4, ph3, zawierającym 31,5% (v/v) acetonitryl, i rozwijano liniowym gradientem 35-45% acetonitrylu w ciągu 75 minut z szybkością przepływu 1 ml/minutę. Absorbancję monitorowano przy długości fali 220 nm. Wszystkie peptydy oczekiwane na podstawie reakcji kontrolnej zostały utworzone, chociaż niewielki pik po piku odpowiadającym jednemu z fragmentów pochodzi prawdopodobnie z cząsteczki insulinopodobnej dez-thr(b30) (15). Przykłady 4 i 5 wskazują, że zrekombinowany polipeptyd eksprymowany przez plazmid pbast-r posiada sekwencję naturalnie występującej insuliny ludzkiej. M ała część wytwarzanego zrekombinowanego białka obejmowała takie formy, jak cząsteczki insulinopodobne Arg(Ao), dezamino- lub dez-thr(b30). Te niepożądane produkty uboczne można wyeliminować stosując procedury chromatograficzne, takie jak RP-HPLC, jak opisano powyżej. Przykład 6. Analiza białkowa i oczyszczanie insuliny ludzkiej wytworzonej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat W celu uniknięcia tworzenia produktu ubocznego, Arg(Ao) insuliny (przykład 4 i 5), plazmid ekspresyjny pbast-r zmodyfikowano, tak aby zawierał DNA kodujący tylko resztę Arg pomiędzy łańcuchami A i B polipeptydu hybrydowego proinsuliny, w przeciwieństwie do DNA kodującego Lys-Arg pomiędzy łańcuchami A i B polipeptydu hybrydowego proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pbast-r. W wyniku tego otrzymano plazmidy ekspresyjne pdba- ST-LAT (przykład 1B) i pλbast-lat (przykład 1C).
18 180 818 W następstwie ufałdowywania i traktowania enzymatycznego trypsyną i karboksypeptydazą B ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi, eksprymowanego przez nowy plazmid ekspresyjny pdbast-lat zachodziło wydajne wytwarzanie insuliny. Występowanie zanieczyszczeń insulinopodobnych było niskie (figura 9). Ufałdowywanie było optymalne w ph 11,25 (figura 10) i było znacząco wzmacniane w obecności około 2 moli kwasu askorbinowego na mol grup SH w mieszaninie reakcyjnej (figura 11). W pływ stężenia białka na wydajność insuliny wytwarzanej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny określono w szeregu reakcji uwzględniających optymalne w arunki ufałdow y- wania. Optymalną wydajność uzyskiwano, gdy stężenie białka nie przekraczało 1,5 mg/ml (figura 13). Insulinę oczyszczano przez chromatografię na DEAE-Sepharose, po której następowała RP-HPLC (jak opisano na figurze 9). Jak wynika z figury 12, wytworzona zrekombinowana insulina ludzka miała taki sam czas retencji, jak standardowa (dostępna komercjalnie) insulina ludzka. Skład aminokwasowy preparatu oczyszczonej zrekombinowanej insuliny ludzkiej jest identyczny, jak dla insuliny standardowej (patrz tabela 2, insulina zrekombinowana). Należy zauważyć, że tabela 2 wskazuje, iż insulina wytworzona z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowana przez plazmid pdbast-lat nie posiada dodatkowej reszty Arg połączonej z łańcuchem A insuliny (Arg(Ao) insulina), jak opisano w przykładzie 4. A zatem, preferowanym plazmidem do wytwarzania insuliny jest plazmid pdbast-lat, a preferowaną sekwencją hybrydowego polipeptydu proinsuliny jest ta przedstawiona na figurze 7. Aminokwas T abela 2 Skład aminokwasowy zrekombinowanej insuliny ludzkiej Liczba reszt Teoretyczna Insulina standardowa Insulina rekombinowana Asx 3 3,20 3,32 Thr 3 2,98 2,73 Ser 3 2,84 2,71 Glx 7 7,15 7,41 Pro 1 1,28 1,02 Gly 4 4,24 4,46 Ala 1 1,00 1,09 Cys 6 5,88 5,28 Val 4 3,82 4,00 Ile 2 2,04 1,91 Leu 6 5,87 6,34 Tyr 4 3,80 3,64 Phe 3 3,15 3,06 His 2 2,04 2,18 Lys 1 1,01 1,02 Arg 1 0,96 1,07
180 818 19 Przedstawiono skład aminokwasowy standardowej insuliny ludzkiej i zrekombinowanej insuliny ludzkiej wytworzonej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat. Analizę składu aminokwasowego prowadzono po przeprowadzeniu utleniania reszt kwaśnych i hydrolizy w fazie gazowej preparatów oczyszczonej insuliny. Przykład 7. Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat z nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego Stosując nieoczyszczony precypitat wewnątrzkomórkowy, przeprowadzono ulepszoną metodę ufałdowywania i enzymatycznego przekształcania hybrydowego polipeptydu proinsuliny w insulinę, pozwalającą na ominięcie potrzeby wstępnego etapu oczyszczania, opisanego w przykładzie 2, część IV. Wydajne wytwarzanie insuliny zachodziło po enzymatycznym rozszczepieniu ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi trypsyną i karboksypeptydazą B (figura 4 i tabela 3). Wydajności insuliny obliczano jako procent początkowego stężenia białka (A280) oznaczonego na etapie rozpuszczania precypitatu w ph 12 (figura 14). Wykazano, że ufałdowywanie hybrydowego polipeptydu SOD-proinsulina z nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego jest optymalne po około 4,5 godzinach od początku doświadczenia (figura 14). Tabela 3 podsumowuje częściowe oczyszczanie insuliny z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pbast-lat z nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego przygotowanego z hodowli fermentacyjnej o objętości jednego litra i o O.D.660 wynoszącej 45. Rozpuszczanie i ufałdowywanie przeprowadzono jak opisano dla figury 14. Po 4,5 godzinach od rozpuszczenia, cały roztw ór zawierający ufałdow any hybrydowy polipeptyd proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi, zmiareczkowano stężonym kwasem solnym do ph 8,8. Dodano ZnCl2 (do 50 μm stężenia końcowego), karboksydazę B (1:4000 w/w) i trypsynę (1:6000 w/w). Trawienie prowadzono w ciągu 3 godzin w temperaturze 37 C i zakończono przez dodanie fenylometylosulfonylofluorku (PMSF) do 0,5 mm stężenia końcowego. A naliza przez HPLC (jak opisano na figurze 9) wykazała, że wydajność insuliny wynosiła 169 mg. Insulinę oczyszczono przez kolejne etapy chrom atografii anionowymiennej i oddziaływań hydrofobowych. Poddaną trawieniu mieszaninę po ufałdowywaniu nałożono na kolumnę DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) zrównoważoną uprzednio buforem zawierającym 20 mm Tris-HCl, 10 mm NaCl, ph 8, w ilości około 50 jednostek A2g0na ml złoża. Związany materiał przemyto buforem zawierającym 20 mm Tris-HCl, 100 mm NaCl, ph 8, i insulinę wyeluowano 250 mm NaCl w tym samym buforze. Połączone frakcje zawierające insulinę odpowiadały 20% nałożonego białka i posiadały czystość 37,1%. Do połączonych frakcji wyeluowanych z DEAE dodano siarczanu amonowego do stężenia 410 mm i nałożono na kolumnę Phenyl-Sepharose Fast Flow uprzednio zrównoważoną buforem zawierającym 20 mm Tris HCl,540 mm siarczan amonowy w ilości około 12 jednostek A280 na ml złoża. Zw iązany m ateriał przemyto buforem do rów noważenia i insulinę wyeluowano buforem zawierającym 20 mm Tris HCl, 220 mm siarczan amonowy, ph 8. Frakcje zawierające insulinę odpow iadały 42,3% nałożonego białka i posiadały czystość 74,1%. W wyniku tego procesu częściowego oczyszczania wytworzono 120 mg insuliny, identycznej z insuliną standardową, co odpowiada wydajności insuliny 5,16%. Dalsze oczyszczanie insuliny można przeprowadzić stosując metody znane w tej dziedzinie, np. sączenie m olekularne, RP-HPLC i krystalizację (17).
20 180 818 Tabela 3 Oczyszczanie zrekombinowanej insuliny ludzkiej, wytworzonej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-laz, po rozpuszczeniu nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego, ufałdowywaniu i traktowaniu enzymatycznym trypsyną i karboksypeptydazą B Etap oczyszczania A280 Minimalna ilość insuliny wg. HPLC - w mg % czystości Rozpuszczanie precypitatu 2326 - - Traktowanie węglem drzewnym 1915 - - Ufałdowywanie i traktowanie enzymatyczne 1915 169 8,8 Połączone frakcje po DEAE-Sepharose 383 142 37,1 Połączone frakcje po Phenyl-Sepharose 162 120 74,1 A280 przedstawia całkowitą absorbancję przy długości fali 280 nm na każdym etapie oczyszczania. Obecność insuliny oznaczano przez analizę HPLC w stosunku do insuliny standardowej, jak opisano dla figury 9, i odpowiada ona głównemu pikowi insuliny standardowej.