Adam Dawidowski Klasa III b. mgr Beata Ulczyńska

Transkrypt

1 Adam Dawidowski Klasa III b (autor) mgr Beata Ulczyńska (opiekun)

2 BADANIE WPŁYWU GENU orf654 Z OPERONU mboii NA ZJAWISKO PRZESUNIĘCIA RAMKI ODCZYTU TRANSLACJI -1 W ZMUTOWANYM GENIE mboiim2δ

3 I Akademickie Liceum Ogólnokształcące im. Zasłużonych Ludzi Morza ul Narcyzowa Gdynia (szkoła)

4 STRESZCZENIE W celu zbadania wpływu genu orf654 na powstawanie zjawiska przesunięcia ramki odczytu rybosomów (PROT) podczas translacji mrna genu mboiim2δ dzięki uprzejmości prof. dr hab. Mariana Sęktasa z Katedry Mikrobiologii Uniwersytetu Gdańskiego podjąłem projekt badawczy pod jego kierunkiem. Projekt polegał na założeniu hodowli komórek trzech szczepów pałeczki okrężnicy (Escherichia coli Tuner (DE3) ). Pierwszy szczep był nosicielem plazmidu zawierającego gen metylotransferazy DNA MboII (mboiim2) dzikiego typu, drugi szczep zawierał komórki z plazmidem kodującym gen mboiim2δ z mutacją wywołującą zaburzenia procesu translacji (PROT) wraz z genem orf654 o nieznanej funkcji, a w trzecim szczepie znajdował się plazmid zawierający gen mboiim2δ. Otrzymane hodowle komórek poddano lizie a następnie wszystkie wyprodukowane białka rozdzielono za pomocą metody elektroforetycznej w żelu poliakryloamidowym. Analiza żelu wykazała, że białko metylotransferazy o normalnej masie (32 kda) jest produkowane przez wszystkie trzy szczepy. Następnie sprawdzono czy produkowane białko jest aktywne biologicznie wykorzystując metodę analizy protekcji wyizolowanego z komórek poszczególnych szczepów plazmidowego DNA przed trawieniem endonukleazą R.MboII, przed i po indukcji ekspresji genów mboiim2. Doświadczenie wykazało, że syntezowana metylotransfreaza jest aktywna i chroni plazmid przed cięciem endonukleazy restrykcyjnej we wszystkich przypadkach, co pokazuje, że obecność genu orf654 jest zbędna do zaistnienia zjawiska PROT. WSTĘP Translacja jest podstawowym procesem biochemicznym zachodzącym w komórkach żywych. Umożliwia produkcje białek strukturalnych i enzymatycznych istotnych w funkcjonowaniu komórki. W komórkach prokariotycznych funkcjonalnie pokrewne geny są zebrane w operony. W przeważającej liczbie przypadków, proces translacji to odczytywanie kolejnych tripletów nukleotydowych, kodujących kolejne aminokwasy budujące strukturę kodowanego białka, od kodonu startowego AUG do kodonu stopu (3 różne). Odbywa sie w sposób ciągły, bez ominięć bądź przeskoków. Zjawisko przesunięcia ramki odczytu translacji jest unikatowe, rzadkie i wiąże się z nieciągłym sposobem odczytywania informacji genetycznej przez rybosomy. Opisywane zjawisko ma miejsce w przypadku genu kodującego metylotransferazę DNA M2.MboII. Ekspresja genu mboiim2δ zawierającego delecję pojedynczego nukleotydu z plazmidu zawierającego dodatkowo gen orf654, powinna dać produkcję zmniejszonego wariantu białka M2.MboII o masie 14,5 kda oraz białka Orf654 o masie 25 kda. Nieoczekiwanie jest produkowane również białko dzikiego typu o masie 32 kda. Być może zjawisko to jest odpowiedzią komórki na zachodzącą mutację - w ten sposób może ona nadal produkować potrzebne białko. Celem tej pracy jest zbadanie czy obecność genu (białka) orf654 jest niezbędna w procesie przesunięcia ramki odczytu translacji. Projekt ma na celu ustalenie wpływu genu wraz z zawartą w nim sekwencją krzyżową znajdującą się za miejscem delecji. Wydaje się, że sekwencja krzyżowa przez swoją specyficzną budowę mogłaby oddziaływać na proces translacji. Ryc. 1. Struktura genetyczna operonu mboiirm z Moraxella bovis

5 Materiał badawczy: Escherichia coli Tuner (DE3) królestwo typ klasa rząd rodzina rodzaj gatunek Materiały: MATERIAŁY I METODY wytrząsarka wodna, aparat do rozdziału w żelu akryloamidowym i żelu agarozowym, zasilacz prądu, łaźnia wodna, inkubator, system fotodokumentacji Metody: Komórka kompetentna bacteria proteobakterie gammaproteobakterie Enterobacteriales Enterobacteriaceae Escherichia Escherichia coli królestwo typ klasa rząd rodzina rodzaj gatunek transformacja komórek kompetentnych plazmidowym DNA, hodowla komórek trans formantów w pożywce LB i LA(pożywki wzrostowe LA: ekstraktu drożdżowego, peptonu bakteriologicznego, NaCl. LB zawiera dodatkowo agar), elektroforetyczny rozdział lizatów komórkowych w żelu poliakryloamidowym, barwienie żelu poliakrylamidowego roztworem barwnika Coomassie Brilliant Blue, oczyszczanie plazmidowego DNA metodą lizy alkalicznej, trawienie plazmidowego DNA enzymami restrykcyjnymi, rozdział elektroforetyczny próbek DNA na żelu agarozowym.(1) DOŚWIADCZENIE I Fragment operonu bacteria proteobakterie Gammaproteobakterie Pseudomonadales moraxellaceae moraxella Moraxella bovis Do przygotowanych wcześniej komórek kompetentnych E. coli Tuner(D3) wprowadzono trzy rodzaje plazmidowego DNA (B1 - plazmid z genem kodującym metylotransferazę DNA M2.MboII, ΔBP - plazmid ze zmutowanym genem M2.MboIIΔ i genem orf654 oraz plazmid ΔB4 ze zmutowanym genem M2.MboII). Każdą z prób inkubowano w łaźni lodowej przez 30 minut, następne przeprowadzono szok cieplny w 42 C trwający 3 minuty. Dodano pożywkę LB i wytrząsano w 37 C przez 45 minut. Następnie wysiano mieszaniny bakteryjne na płytki z podłożem LA i antybiotykiem kanamycyną, używając do tego celu jałowej głaszczki szklanej. Płytki inkubowano w cieplarce w 37 C do momentu pojawienia się wyraźnych kolonii bakteryjnych (około 15 godzin). Pobrano pojedyncze kolonie i umieszczono je w kolbach z płynną pożywką i kanamycyną. Po jednej godzinie każdą z 3 hodowli podzielono na próbę kontrolną i próbę badawczą z dodatkiem IPTG (syntetyczny analog galaktozy indukujący ekspresję operonu lac w E. coli) tak uzyskane 6 roztworów pozostawiono na 2h. Następnie każdy roztwór umieszczono w dwóch probówkach i poddano wirowaniu w celu oddzielenia pożywki od komórek bakterii. Po usunięciu pożywki z nad osadu komórek, próbki zamrożono do elektroforezy. Następnego dnia do próbek dodano składnika redukującego i gotowano w celu denaturacji białek. Następnie każdą z próbek umieszczono w kolumnach żelu poliakrylamidowego. Rozdział elektroforetyczny przeprowadzono przy natężeniu prądu ma przez 2,5h. Następnie żel poddano barwieniu roztworem barwnika Coomassie Brilliant Blue przez 30 min. żel sfotografowano w świetle UV z odpowiednim filtrem.

6 DOŚWIADCZENIE II Następnie z hodowli indukowanych i nieindukowanych ΔB4 wyizolowano DNA plazmidowy w celu oceny stopnia jego modyfikacji specyficznej metylotransferazą M2.MboII. Do obu prób dodano enzymu endonukleazy restrykcyjnej MboII. Po trawieniu próbki DNA wprowadzono do odpowiednich studzienek w żelu agarozwym. Elektroforezę przeprowadzono przy natężeniu prądu 40mA przez 1,5h. Po zakończeniu rozdziału w żelu prążki DNA z barwnikiem bromkiem etydyny sfotografowano w świetle UV (412 nm) przy użyciu systemu do fotodokumentacji. WYNIKI Elektroforeza umożliwia poznanie składu białkowego komórki, której białka rozdzielane są pod względem masy. Na żelu otrzymanym w doświadczeniu I frakcje białek przyrównujemy do wzorca białkowego znajdującego się po jego prawej stronie. W celu sprawdzenia czy białko o danej masie jest produkowane. Wnioski: białko M2.MboII produkowane jest w każdej z prób białko z genu orf654 produkowane jest tylko w próbie ΔBP

7 WYNIKI c.d. Otrzymane preparaty plazmidowego DNA z doświadczenia II na żelu agarozowym ukazują stan modyfikacji DNA podczas represji i indukcji operonu laktozowego kodującego metylazę. Każdą z prób podzielono na próbę kontrolną i próbę zawierającą endonukleazę. Według założeń próba indukowana powinna zawierać zmetylowane plazmidy odporne na trawienie enzymem, natomiast przy represji niezmetylowane plazmidy powinny zostać strawione. Strawione DNA widzimy w próbie + represji. Wnioski: podczas represji białko metylotransferazy nie jest syntezowane, stąd miejsca GAAGA nie są modyfikowane i ulegają degradacji plazmidowego DNA, po indukcji genu w próbie ΔB4 jest produkowane białko dzikiego typu M2.MboII i metyluje plazmid chroniąc go przed degradacją endonukleazą restrykcyjną. Ryc. 3. Schemat doświadczenia oraz obraz żelu agarozowego

8 DYSKUSJA Zjawisko przesunięcia ramki odczytu translacji jest stosunkowo nowym odkryciem. Opisał to Philip J. Farabaugh w 1996r (3).W omawianym przykładzie w genie mboiim2 z bakterii Moraxella bovis zaszła mutacja - delecji adeniny z nici DNA. W wyniku czego następuje całkowita zmiana kolejności i rodzaju tripletów nukleotydowych oraz powstanie kodonu STOP kończącego proces translacji. Efektem tego jest zmiana sekwencji i ilości aminokwasów w białku - produkcja krótszego i nieaktywnego białka. Badania wykazują jednak, że produkowane jest krótsze jak i dłuższe białko. Pewien procent zachodzących translacji produkuje białko o takiej sekwencji aminokwasów jak w genie bez mutacji - dzikiego typu (WT). Tłumaczy to zjawisko przesunięcia ramki odczytu, które występuje najprawdopodobniej w miejscu delecji dzięki czemu produkowane jest pełne białko z niezmienioną sekwencją aminokwasów. Jest to sytuacja analogiczna jak w wirusach infekujących organizmy eukariotyczne opisanych w źródle (4) w roku była to pierwsza publikacja dotycząca przesunięcia ramki odczytu translacji. Ryc. 4. Zmiana sekwencji aminokwasów po zajściu delecji nukleotydu (Δ).

9 DYSKUSJA c.d. Rycina 4. przedstawia sekwencję zasad azotowych w nici DNA przed jaki i po delecji adeniny. Pogrubiona sekwencja zasad AAAAACA jest układem podatnym na zjawisko przesunięcia ramki odczytu translacji (5). Opisywany operon koduje białka metylaz, które chronią plazmid przed trawieniem przez metylację specyficznych odcinków DNA o sekwencji GAAGA (2). Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że białko MboII produkowane jest w zarówno w nici DNA z genem orf654 jak i w nici DNA bez tego genu. Co oznacza, że gen orf654 z operonu kodującego determinantę R-M MboII z Moraxella bovis nie wpływa na zjawisko przesunięcia ramki odczytu translacji -1 w zmutowanym genie mboiim2 w komórkach Escherichia coli. Proces translacji przebiegał następująco: Ryc. 5. Sekwencja aminokwasów w zmutowanym genie mboiim2 PIŚMIENNICTWO 1. MOLECULAR CLONING a laboratory manual second edition J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Moniatis Cold Spring Harboor Laboratory Prees (1989). 2. Furmanek-Blaszk B., Boratyński R., Żółcińska N i Sęktas M. (2009). M1.MboII and M2.MboII type IIS methyltransferases: different specificities, the same target Microbiology, 155, Farabaugh P. J. (1996). Programmed Translational Frameshifting Microbiological reviews, p Jacks T, Varmus HE (1985). Expression of the Rous sarcoma virus pol gene by ribosomal frameshifting, Science 230(4731): Edwin B. Ten Dam, Cornelius W.A. Pleij, And Leendert Bosch (1990) RNA Pseudoknots: Translational Frameshifting and Readthrough on Viral RNAs, Virus Genes 4:2, ,