Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych

Transkrypt

1 Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Zalety w porównaniu z analizą trankryptomu: analiza transkryptomu komórki identyfikacja mrna nie musi jeszcze oznaczać pojawienia się w komórce produktu białkowego genu badając proteom analizujemy ostateczne elementy strukturalne i funkcjonalne komórki

2 Etapy klasycznej analizy proteomu komórki dwukierunkową elektroforeza poliakrylamidową białek identyfikacja poszcególnych białek poprzez spektrometrię mas np. typu MALDI-TOF

3

4 Zadania proteomiki funkcjonalnej: Identyfikacja i charakterystyka białek uczestniczących w złożonych procesach biochemicznych Analiza oddziaływań białek z innymi białkami, kwasami nukleinowymi, ligandami niskocząsteczkowymi Określanie składu i funkcji kompleksów makromolekularnych Badanie powiązań pomiędzy kaskadami przemian biochemicznych Poznanie mechanizmów ich regulacji

5 Interakcje DNA-białko Technika opóźnienia (reterdacji) migracji fragmentów DNA w żelu poliakrylamidowym EMSA (electrophoretic mobility shift assay) lub Gel shif assay Technika badania odcisku stopy ang. footprinting Przykładowe zastosowania: Badanie oddziaływań czynników transkrypcyjnych wiążących się z operatorami, enhacerami, silencerami

6 EMSA- Gel Shift Assay

7 Footprinting to metoda pozwalająca nie tylko stwierdzić wiązanie białka do DNA, ale także precyzyjne określić pozycję wiązania Wyznakować jeden koniec odcinka DNA np. izotopowo Poddać trawieniu DNA za pomocą DNazy I, która trawi DNA przypadkowo (UWAGA!!! Należy zastosować łagodne warunki trawienia, tak aby każda cząsteczka została przecięta tylko raz) Reakcję trawienia fragmentów DNA robi się w dwu powtórzeniach: do jednego dodaje się białko, które ma oddziaływać z fragmentem DNA Powstanie mieszanka wyznakowanych fragmentów DNA, różnej długości (różniących się o jeden nt), które rozdziela się na żelu poliakrylamidowym Związanie białka zapobiega trawieniu DNA przez DNazę I Uzyskujemy przerwę w prążkach tzw. odcisk stopy footprint powstały w miejscu związania z białkiem.

8 Jeśli równocześnie fragment użyty do doświadczenia podda się sekwencjowaniu to możemy także podać sekwencję nukleotydów w miejscu wiązania białka A T G C G C T G A T G G C C Przez porównanie z wzorem prążków próbki bez białka możemy dokładnie zlokalizować miejsce wiązania

9 Interakcje białko-białko Test prezentacji na fagu (ang. phage display) System wykorzystuje się najczęściej do pokazania oddziaływania jakiegoś zidentyfikowanego (znanego) białka z białkiem nieznanym (X) Używa się wektora bakteriofagowego (pochodnego lambda czy M13), z pojedynczym miejscem restrykcyjnym do klonowania w genie kodującym białko płaszcza wirusa. Sekwencje DNA kodujące poszukiwane białka klonuje się do wektora wirusowego tak, by uzyskać fuzję genową (fuzję ramek odczytu), czyli takie połączenie, w którym seria kodonów jest nieprzerwana od białka płaszcza wirusa do testowanego białka

10 Po transformacji bakterii zrekombinowane cząsteczki DNA pozwalają fagom syntetyzować białka hybrydowe i prezentować nieznane białko w płaszczu wirusa

11 Kolekcję fagów prezentujących umieszcza się na specjalnej membranie i poddaje oddziaływaniu (typu western) ze znanym białkiem (test protein). Oddziaływanie białek wykrywa się dzięki temu, że białko badane jest wyznakowane, albo stosuje się przeciwciała przeciw badanemu białku sprzężone np. alkaliczną fosfatazą.

12 System dwuhybrydowy służy do badania interakcji białko-białko (zwykle są to dwa znane białka) (tzw. przynęta i zdobycz) pozwala precyzyjnie zmapować takie interakcje podobnie jak -komplementacja opiera się na łączeniu dwóch cząsteczek białek w tym systemie wykorzystujemy geny reporterowe

13 Bezpośrednie oddziaływanie dwóch białek możemy pokazać przez pośrednie połączenie dwóch domen czynnika transkrypcyjnego Funkcjonalny czynnik transkrypcyjny złożony z domeny wiążącej się z DNA i aktywującej transkrypcję) powstanie nawet wtedy, kiedy obie te domeny znajdą się w komórce w postaci osobnych polipetydów, które mogą one ze sobą asocjować (podobnie jak w -komplementacji) gen reporterowy

14 białko fuzyjne zgodne połączenie ramek odczytu genu X i genu domeny wiążącej się z DNA czynnika transkrypcyjnego

15 przynęta zdobycz

16 Macierze peptydowe (ang. peptide arrays) Bezkomórkowe układy peptydów przeznaczone do równoczesnych analiz stanowiące reprezentację wszystkich lub prawie wszystkich białek danego organizmu Zawierają szereg peptydów o różnych sekwencjach, połączonych kowalencyjnie z powierzchnią stałego nośnika, pokrytego warstwą odpowiedniego polimeru.

17 Pomiędzy peptydem a podłożem znajduje się tzw. grupa dystansowa (ang. spacer), który zapewnia większą swobodę konformacyjną i ułatwia dostęp składników badanej próbki do immobilizowanych peptydów. W przeciwieństwie do kwasów nukleinowych, białka stanowią populację bardzo heterogennych cząsteczek pod względem stabilności i własności fizykochemicznych. Utrzymanie poprawnie zwiniętych i funkcjonalnych peptydów na macierzy jest trudne, ale dzięki bezkomórkowym systemom ich otrzymywania powielanie macierzy peptydowych jest dość łatwe i nie ma potrzeby długiego przechowywania gotowych macierzy

18 Przykładowe zastosowania: Badanie specyficzności substratowej enzymów proteolitycznych Mapowanie epitopów Badanie oddziaływań fragmentów białek z innymi białkami i DNA