IZOLACJA I WSTĘPNE OCZYSZCZANIE 1,2-DIOKSYGENAZY KATECHOLOWEJ WPROWADZENIE Stopniowa degradacja środowiska naturalnego człowieka spowodowała, że w ostatnich latach coraz więcej uwagi poświęca się problemom związanym z biologicznym oczyszczaniem wód i gleby z akumulujących się w środowisku trudno rozkładalnych związków ksenobiotycznych. Do jednych z najbardziej trwałych i cechujących się dużą toksycznością związków należą związki aromatyczne, w tym wielopierścieniowe węglowodory (naftalen, antracen, fenantren), jak również pochodne fenolowe (metylofenole, nitrofenole, aminofenole, chlorofenole itd.). Kluczową rolę w degradacji ksenobiotyków odgrywają dioksygenazy, enzymy katalizujące reakcje wprowadzenia obu atomów tlenu z cząsteczki O 2 do jednej lub dwóch cząsteczek substratów. Większość dioksygenaz wymaga obecności jonów żelaza związanych w układzie niehemowym i nie tworzących standardowych kompleksów Fe/S. Dioksygenazy biorące udział w katabolizmie pierścieni aromatycznych dzielimy na dwie główne klasy- pierwsza klasa to dioksygenazy hydroksylujące pierścień aromatyczny z równoczesnym utlenieniem NAD(P)H, a powstały w wyniku reakcji cis-dihydrodiol przekształca się do katecholu. Do drugiej grupy dioksygenaz należą dioksygenazy rozszczepiające pierścień aromatyczny. Podział dioksygenaz rozszczepiających pierścień na intradiolowe i ekstradiolowe jest związany z obecnością podstawników hydroksylowych przy atomach węgla, pomiędzy którymi dochodzi do rozerwania wiązania. Jeżeli rozcięciu ulega wiązania pomiędzy atomami węgla, z których każdy zawiera grupę hydroksylową jako podstawnik, reakcja ta jest katalizowana przez dioksygenazy intradiolowe, czyli pierwszy enzym szlaku orto rozkładu związków aromatycznych. Natomiast jeżeli tylko jeden z atomów węgla, pomiędzy którymi dojdzie do rozerwania wiązania, posiada podstawnik hydroksylowy, wówczas w proces ten zaangażowane są dioksygenazy ekstradiolowe, pierwsze enzymy szlaku meta rozkładu związków aromatycznych.
1,2-dioksygenaza katecholowa należy do dioksygenaz intradiolowych, będących najczęściej homomultimerami, zawierającymi różną ilość trójwartościowego żelaza na mol enzymu. Mimo różnego układu podjednostek, domeny katalityczne tych enzymów wykazują podobną strukturę pofałdowania oraz skład aminokwasowy. Ich podjednostki zbudowane są z około 300 reszt aminokwasowych, tworzących dwie domeny. Typową dla 1,2-dioksygenaz jest domena N-terminalna, pośrednicząca w dimeryzacji podjednostek. Składa się ona z około 100 aminokwasów, tworzących maksymalnie pięć helis. Helisy dwóch podjednostek przenikają się wzajemnie tworząc strukturę dimeru i jednocześnie hydrofobowy tunel, do którego mogą być dołączane cząsteczki fosfolipidów. Zestawienie sekwencji aminokwasowych 1,2-dioksygenaz katecholowych wykazuje, iż domena z motywem helikalnego zamka błyskawicznego (ang. helical-zipper) jest charakterystyczna dla enzymów z tej rodziny. Istnieje kilka hipotez wyjaśniających znaczenie tego motywu. Jedna z nich zakłada, iż hydrofobowy tunel odpowiada za wzrost miejscowej koncentracji substratu. Wydaje się to jednak mało prawdopodobne, gdyż katechol jest związkiem rozpuszczalnym w stężeniach znacznie przekraczających stężenia fizjologiczne. Ponadto nie stwierdzono występowania dla substratu bezpośredniej drogi od tunelu do centrum aktywnego enzymu. Uważa się również, iż fosfolipidy przyłączone do hydrofobowego tunelu służą jako cząsteczki efektorowe. Odpowiadają one za zmiany konformacyjne centrum aktywnego enzymu, co z kolei umożliwia przyłączenie do hydrofobowego fragmentu enzymu laktonizującego cis,cismukonian, czyli kolejnego enzymu szlaku orto. Dzięki temu w komórce zachowane jest niskie stężenie intermediatów, które mogą być dla niej potencjalnie toksyczne. Uważa się również, iż hydrofobowy fragment dioksygenaz może wpływać na płynność dwuwarstwy lipidowej. Związki aromatyczne znane są z antybakteryjnych właściwości ze względu na ich wpływ na integralność i funkcjonalność błony komórkowej. Wykazano jednak, iż niektóre mikroorganizmy rozwinęły mechanizmy pozwalające pokonać toksyczność związków aromatycznych. Mogą one wypompowywać z komórki węglowodory aromatyczne przy użyciu energo-zależnej pompy, utrzymując ich stężenie w komórce na bezpiecznym poziomie. Drugi, alternatywny mechanizm, polega na zmianie płynności warstwy fosfolipidowej. Przypuszcza się, iż dzięki hydrofobowemu regionowi, dioksygenazy intradiolowe mogą wiązać fosfolipidy błony komórkowej lub nowo zsyntetyzowane w
komórce fosfolipidy. Powoduje to uwalnianie z błony hydrofobowych węglowodorów aromatycznych i ich wiązanie w centrum aktywnym enzymu. Efektem tego procesu jest wzrost sztywności błony komórkowej, a w konsekwencji zmniejszenie jej przepuszczalności, co zabezpiecza komórkę przed toksycznym stężeniem związków aromatycznych w środowisku. Mechanizm rozszczepienia pierścienia aromatycznego przez dioksygenazy intradiolowe został zaproponowany na podstawie biochemicznych, spektroskopowych i strukturalnych badań tych enzymów. Reakcja wiązania substratu z enzymem jest procesem wieloetapowym, którego ostatecznym rezultatem jest zastąpienie aksjalnej tyrozyny i ekwatorialnego jonu wodorotlenkowego 1,2-dioksygenazy lub 3,4-dioksygenazy przez, odpowiednio, jon katecholanowy lub protokatecholanowy. Efektem tego jest ich aktywacja. W wyniku ataku żelaza na tlen, podczas którego dochodzi do redukcji żelaza z +3 na +2 stopień utlenienia i powstanie Fe 2+ -semichinonu, który reaguje bezpośrednio z dwoma atomami tlenu, wytwarza się struktura nadtlenku C-O-O-Fe. W powstałym intermediacie hydronadtlenkowym dochodzi do przegrupowania Criegee a względem wiązania węgielwęgiel poprzez migrację grupy acylowej, w konsekwencji której powstaje nietrwała struktura laktonowa. Efektem hydrolizy bezwodnika laktonowego jest uwolnienie produktu reakcji rozszczepienia pierścienia aromatycznego, czyli kwasu cis,cis-mukonowego. Celem ćwiczenia jest izolacja i częściowe oczyszczenie wyidukowanej kwasem benzoesowym 1,2-dioksygenazy katecholowej szczepu Stenotrophomonas maltophilia KB2. WYKONANIE A. Izolacja i wstępne oczyszczanie 1,2-dioksygenazy katecholowej szczepu KB2 48 godzinną hodowlę bakteryjną indukowaną 6 mm benzoesanu zwirować przy 5000 rpm przez 30 minut w temperaturze 4 C. UWAGA! W każdej frakcji należy wykonać oznaczenie aktywności 1,2- dioksygenazy katecholowej oraz stężenia białka metodą Bradford a. Z każdej frakcji pobrać 0,5 ml i przechowywać w lodówce.
Uzyskany osad rozpuścić w buforze fosforanowym o ph 7,2 i sonikować z częstotliwością 20 khz, w temperaturze 4 C, 6 razy po 15 sekund w odstępach 30 sekundowych z użyciem dezintegratora ultradźwiękowego Vibre Cell. UWAGA! Wszystkie operacje po rozbiciu komórek należy wykonywać w łaźni lodowej. Dla oddzielenia nie rozbitych komórek, zawiesinę zwirować przy 9500 rpm przez 20 minut. Uzyskany supernatant stanowi mieszaninę błon, peryplazmy i cytoplazmy (Frakcja F1). Do frakcji F1 wprowadzić PMSF w ilości takiej, aby finalne stężenie inhibitora wynosiło 0,5 mm, pobrać 2 ml tej frakcji i pozostawić w lodówce. Pozostałą część frakcji F1 wykorzystywać w dalszych etapach badań. Następnie supernatant zwirować przy 46 000 rpm przez 90 minut, w temperaturze 4 C, w ultrawirówce Beckman. Uzyskany osad zawiera błony, a supernatant (Frakcja F2) cytoplazmę i peryplazmę. Do supernatantu dodać 2% siarczanu protaminy w takiej ilości, aby końcowe stężenie w supernatancie wynosiło 0,01%. Supernatant wytrząsać 10 minut w temperaturze 4 C w celu wytrącenia kwasów nukleinowych. Zawiesinę zwirować przez 15 minut w temperaturze 4 o C, z szybkością 15 500 rpm w ultrawirówce Beckman (Frakcja F3). Białka supernatantu wysolić odpowiednim stężeniem siarczanu amonu. W tym celu odważyć siarczan amonu do 2 ml probówek typu Eppendorf, tak aby uzyskać stężenia 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 i 50% siarczanu amonu, po wprowadzeniu do probówki 1,0 ml supernatantu. Przygotowane mieszaniny wytrząsać przez 10 minut, w temperaturze 4 C, i odwirować prze 15 minut przy 14 000 rpm w celu oddzielenia wytrąconych białek. W uzyskanych supernatantach zmierzyć aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej. Stężenie siarczanu amonu przy którym aktywność enzymu jest największa zastosować do wysolenia pozostałego supernatantu.
Odwirowany po wysoleniu supernatant (Frakcja F4) przenieść na kolumienki Amicon Ultra 50K NMWL, skondycjonowane wcześniej zgodnie z instrukcją producenta i postępować dalej zgodnie z załączoną procedurą. Uzyskany przesącz przechowywać (Frakcja F5) w probówce typu Blue caps w temperaturze 4 C. B. Oznaczanie aktywności 1,2-dioksygenazy katecholowej W oznaczeniu aktywności 1,2-dioksygenazy katecholowej stosuje się metodę Hegeman a, polegającą na spektrofotometrycznym oznaczeniu pierwszego produktu rozkładu pirokatechiny kwasu cis,cis-mukonowego. Aktywność właściwą 1,2- dioksygenazy katecholowej oblicza się korzystając z wzoru: gdzie: A wł 6 ( At A0 ) 10 = ε l t biał mg białka w próbie 1 [ U mg ka ] A wł aktywność właściwa 1,2-dioksygenazy katecholowej, A 0 absorbancja światła w zerowym czasie reakcji enzymatycznej, A t absorbancja światła po czasie t reakcji enzymatycznej, ε molowy współczynnik absorbancji dla kwasu cis,cis-mukonowego ε =16800 dm 3 * mol -1 * cm -1, l grubość warstwy roztworu, cm, t czas pomiaru reakcji enzymatycznej, s mg białka w próbie białko oznaczone metodą Bradford a i przeliczone na objętość próby W celu oznaczenia aktywności 1,2-dioksygenazy katecholowej przygotować mieszaninę reakcyjną o objętości 1 ml, o składzie: 0,97ml 50 mm buforu fosforanowego o ph 7,4; 0,02ml 10 mm pirokatechiny oraz 0,016 ml odpowiedniej frakcji enzymatycznej. Pomiar prowadzić wobec próby ślepej nie zawierającej frakcji enzymatycznej, w temperaturze 30ºC przez 3 minuty od momentu zmieszania reagentów, przy długości fali λ=260 nm, przy użyciu spektrofotometru dwuwiązkowego z wykorzystaniem opcji Time plot.
C. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford a Do najczęściej stosowanych metod oznaczania białka należy metoda Bradforda. W metodzie tej wykorzystuje się wiązanie barwnika Coomassie Brilliant Blue G-250 z białkiem za pomocą wiązań jonowych i hydrofobowych. Z barwnikiem głównie reagują reszty argininy, w minimalnym stopniu reszty histydyny, lizyny, tyrozyny, tryptofanu i fenyloalaniny. Błękit brylantynowy CBB G-250 w środowisku kwasowym ma brunatne zabarwienie, które po reakcji z białkiem zmienia się na błękitne. Wiąże się z tym zmiana maksimum pochłaniania z 465 na 595 nm. Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze. W zależności od budowy białka, mogą zaistnieć różnice w wiązaniu barwnika, co powoduje uzyskiwanie różnego natężenia barwy przy tych samych stężeniach odmiennych białek. W celu oznaczenie stężenia białka w badanym materiale biologicznym pobrać 200 µl próby, dodać 1 ml odczynnika Bradford a i starannie wymieszać. Oznaczyć ekstynkcję przy długości 595 nm. Stężenie białka określić na podstawie krzywej wzorcowe, której współczynnik kierunkowy wynosi 0,0135. Jeśli wartość otrzymanej ekstynkcji przekroczy 1 próbę należy odpowiednio rozcieńczyć. LITERATURA Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-258 (1976). Gniot-Szulżycka J., Leźnicki A., Komoszyński M., Jakubowska A., Wojczuk B. Materiały pomocnicze do ćwic zeń z biochemii dla studentów biologii i chemii. Metody ilościowego oznaczania, rozdziału i oczyszczania cz. I białka. Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, Toruń 1994. Guzik U., Greń I., Hupert-Kocurek K., Wojcieszyńska D. Catechol 1,2-dioxygenase from the new aromatic compounds - degrading Pseudomonas putida strain N6. Int. Biodeter. Biodegr. 65, 504-512 (2011). Guzik U., Greń. I., Wojcieszyńska D., Łabużek S. Dioksygenazy kluczowe enzymy degradacji związków aromatycznych. Biotechnologia, 3 (82), 71-88 (2008)
Hegeman G.D. Synthesis of enzymes of the mandelate pathways by Pseudomonas putida. Synthesis of enzyme by the wild type. J. Bacteriol. 91, 1140-1154 (1966). Wojcieszyńska D., Greń I., Łabużek S. Dioksygenazy- kluczowe enzymy rozkładu związków aromatycznych. Post. Mikrobiol. 44, 63-70 (2005) Wojcieszyńska D., Hupert-Kocurek K., Greń I., Guzik U. Modulation of FAD-dependent monooxygenase activity from aromatic compounds-degrading Stenotrophomonas maltophilia strain KB2. Acta Biochim. Pol. 58, 421-426 (2011)
OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW Tabela I Aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej i stężenie białka w poszczególnych frakcjach uzyskanych podczas izolacji Absorbancja Czas (s) Frakcja F1 F2 F3 F4 F5 0 30 60 90 120 150 180 A A 595 białka Objętość frakcji (ml) Rozcieńczenie białka Stężenie białka mg/ml Białko całkowite Ilość białka w próbie Aktywność właściwa U/mg białka Aktywność całkowita (U) Stopień oczyszczenia Wydajność (%) Wyniki aktywności właściwej enzymu oraz stężenia białka w poszczególnych frakcjach przedstawić graficznie.
Tabela II Aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej i stężenie białka po zastosowaniu różnych stężeń siarczanu amonu w etapie wysalania Absorbancja Czas (s) C(NH 4 ) 2 SO 4 (%) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 30 60 90 120 150 180 A A 595 białka Rozcieńczenie białka Stężenie białka mg/ml Ilość białka w próbie Aktywność właściwa U/mg białka Wyniki aktywności właściwej enzymu oraz stężenia białka w poszczególnych frakcjach przedstawić graficznie.