Węglowodany metody jakościowe oznaczania cukrów reakcja Molisha, Fehlinga, Selivanowa; ilościowe oznaczanie glukozy metodą Somogyi Nelsona

Transkrypt

1 Ćwiczenie nr 7 Węglowodany metody jakościowe oznaczania cukrów reakcja Molisha, Fehlinga, Selivanowa; ilościowe oznaczanie glukozy metodą Somogyi Nelsona Celem ćwiczenia jest: zapoznanie z metodami jakościowej analizy cukrów ilościowe oznaczenie glukozy metodą Somogyi Nelsona oznaczenie poziomu glukozy przy użyciu glukometru Węglowodany (cukrowce, sacharydy) stanowią jedną z najważniejszych klas cząsteczek biologicznych występujących w przyrodzie. Dzielą się na cukry proste (inaczej monosacharydy, jednocukry) oraz na cukry złożone, do których zaliczyć można oligosacharydy (np. disacharydy) oraz polisacharydy (wielocukry). Monosacharyd zbudowany jest z łańcucha węglowego, z licznymi grupami hydroksylowymi oraz jednej z grup: aldehydowej (aldozy, będące homologami aldehydu glicerynowego) lub ketonowej (ketozy, będące homologami dihydroksyacetonu). aldehyd glicerynowy (aldoza) dihydroksyaceton (ketoza) C C C 2 C 2 C C 2 Ze względu na liczbę atomów węgla w cząsteczce cukry proste dzielimy na: triozy, tetrozy, pentozy, heksozy, itp. Aldozy które zawierają co najmniej trzy atomy węgla, a ketozy zbudowane co najmniej z czterech atomów węgla, posiadają centra chiralne wynikające z obecności węgla asymetrycznego, są zatem związkami optycznie czynnymi. becne w cząsteczce cukrowców grupa aldehydowa lub grupa ketonowa mogą reagować z grupą hydroksylową (półacetale) i tworzyć struktury pierścieniowe o strukturze piranu lub furanu, np. glukoza najczęściej ulega cyklizacji do sześcioczłonowego pierścienia piranozowego, a fruktoza tworzy pierścienie furanozowe. piran glukoza furan fruktoza C 2 C 2 C 2 1

2 Disacharydy (dwucukry) powstają w reakcji grupy aldehydowej lub grupy ketonowej z jednej cząsteczki cukru z grupą hydroksylową drugiej cząsteczki cukru. Powstające wiązanie pomiędzy tymi dwoma cząsteczkami nazywa się wiązaniem glikozydowym. Rozróżnia się wiązanie α- lub β-glikozydowe, w zależności od konfiguracji anomerycznego atomu węgla, uczestniczącego w tworzeniu wiązania. Do najczęściej występujących disacharydów zaliczyć możemy sacharozę (powstającą poprzez połączenie cząsteczki glukozy i fruktozy), laktozę (powstającą poprzez połączenie cząsteczki galaktozy i glukozy) oraz maltozę (powstającą poprzez połączenie dwóch cząsteczek glukozy). laktoza sacharoza C 2 C 2 C 2 C 2 C 2 maltoza C 2 C 2 Polisacharydy są długimi, liniowymi lub rozgałęzionymi łańcuchami jednostek cukrów. Do najważniejszych polisacharydów zaliczyć możemy: glikogen, skrobię, dekstran, celulozę. Zasada metody jakościowej analizy cukrów Węglowodany pod wpływem stężonych kwasów nieorganicznych ulegają dehydratacji z utworzeniem pochodnych furfuralowych. eksozy tworzą 5-hydroksymetylenofurfural, a pentozy furfural. Powstałe związki kondensują z fenolami, chinonami, czy aminami aromatycznymi tworząc połączenia triarylometanowe o charakterystycznym zabarwieniu. Reakcje te wykorzystywane są do identyfikacji, różnicowania i oznaczeń ilościowych węglowodanów. 2

3 1. Reakcja Molischa Jest to najbardziej ogólna reakcja mająca na celu wykrycie węglowodanów, zarówno wolnych jak i związanych w badanej próbie. Jej ujemny wynik wyklucza obecność węglowodanu w próbce, a dodatni może wskazywać na jego obecność. Dodatni wynik reakcji mogą dawać również aldehydy, aceton, kwas szczawiowy i cytrynowy. Reakcja polega na powstaniu czerwono-fioletowego zabarwienia w wyniku kondensacji pochodnych furfuralowych z α-naftolem. 2. Reakcja Seliwanowa Pod wpływem kwasu solnego ketozy i aldozy przekształcają się w pochodne furfuralowe, które reagując z rezorcyną dając związek o barwie czerwonej. Jednakże próba ta pozwala na odróżnienie aldoz od ketoz, ponieważ w obecności 3-krotnie rozcieńczonego roztworu Cl tylko ketozy ulegają odwodnieniu w czasie ogrzewania w 100 C przez 30 sekund. Bardzo ważne jest zachowanie warunków doświadczenia!!! 3. Reakcja Fehlinga dczyn Fehlinga polega na redukcji jonów miedzi Cu 2+ do Cu +. dczynnik Fehlinga jest mieszaniną CuS 4, Na oraz winianu sodowo-potasowego. Po dodaniu odczynnika Fehlinga do mieszaniny węglowodanu następuje utlenianie jego grupy aldehydowej i jednocześnie następuje redukcja jonów miedzi. W wyniku tego powstaje trudno rozpuszczalny tlenek miedzi (Cu 2 ) o charakterystycznym ceglastoczerwonym zabarwieniu. Zasada metody ilościowego oznaczenia glukozy metodą Somogyi Nelsona Metoda Somogyi-Nelsona polega na kolorymetrycznym oznaczeniu glukozy w badanej próbce. Glukoza w obecności winianu sodowo-potasowego redukuje jon Cu 2+ do Cu +. Tlenek miedziowy (Cu 2 ) wchodzi w reakcję z kwasem fosfomolibdenowym, łatwo ulegającym redukcji do błękitu molibdenowego. Natężenie barwy błękitu molibdenowego jest proporcjonalne do ilości Cu 2, a tym samym do ilości glukozy obecnej w badanej próbce. 3

4 Zasada metody oznaczenia glukozy przy użyciu glukometru Metoda oznaczenia glukozy przy użyciu glukometru stanowi najprostszy, dostępny dla pacjenta sposób kontroli stężenia glukozy. Metoda ta opiera się o reakcje enzymatyczne, w których to glukoza przekształcana jest w dany produkt końcowy a przemianie tej towarzyszy zmiana barwy (pomiar natężenia światła odbitego od powierzchni paska testowego zawierającego produkt reakcji metoda reflektometryczna, fotometryczna, fotochemiczna) lub zmiana natężenia pola elektrycznego (pomiar natężenia mikroprądu przepływającego przez pole reaktywne paska testowego zawierającego produkt reakcji metoda elektrochemiczna, sensoryczna). Rejestrowane zmiany zachodzące w pasku testowym są proporcjonalne do ilości glukozy w badanej próbie. Glukometr odczytuje ich wielkość i przelicza na jednostki liczbowe wyświetlane na ekranie urządzenia. Procedura Jakościowa analiza węglowodanów 1. Do 1 ml roztworu badanego węglowodanu dodać 2-3 krople 10% alkoholowego roztworu α-naftolu, a następnie dodawać ostrożnie, po ściance pochylonej probówki, 0,5 ml stężonego kwasu siarkowego (VI) tak, aby podwarstwić nim płyn. Wyniki obserwacji zanotować w sprawozdaniu. 2. Do 1 ml roztworu badanego węglowodanu dodać 1 ml 36% Cl i krople roztworu rezorcyny. Po zmieszaniu próbę wstawić do wrzącej łaźni wodnej. Po około upływie 30 sekund reakcję przerwać, a wynik zanotować w sprawozdaniu. 3. Do każdej z probówek dodać 1 ml roztworu odczynnika Fehlinga I oraz 1 ml roztworu odczynnika Fehlinga II. Następnie do 2 ml odczynnika Fehlinga dodać 2 ml roztworów badanych weglowodanów i ogrzewać w łaźni wodnej przez 3 minuty. Wyniki obserwacji zanotować w sprawozdaniu. Ilościowe oznaczenie glukozy metodą Somogyi Nelsona 1. Przygotowanie krzywej kalibracyjnej Seryjne rozcieńczenia standardowego 0,06M roztworu glukozy służą do przygotowania krzywej wzorcowej. Przygotuj w 8 probówkach szklanych próby zgodnie z poniższą tabelą. W 6 probówkach (próby 3-8) przygotuj rozcieńczenia standardowego 0,06 M roztworu glukozy, a w dwóch probówkach (próby 1-2) przygotuj próby ślepe. 4

5 Nr próby 0,06 M r-r glukozy [µl] 2 [µl] 1 (ślepa) (ślepa) Przygotowanie prób badanych Przygotuj w dwóch probówkach (próby B1 i B2) próby badane według poniższej tabeli. Nr próby x M r-r glukozy [µl] 2 [µl] B B2* * Uwaga: x M r-r glukozy należy rozcieńczyć trzykrotnie do przygotowania próby B2. 3. Do wszystkich badanych próbek (8 próbek krzywej wzorcowej i 2 próbek badanych (B1, B2)) dodaj 0,5 ml odczynnika miedziowego i ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 15 minut. 4. Schłodzić próbki w strumieniu letniej, a później zimnej wody. 5. Dodaj do każdej próbki po 0,5 ml odczynnika fosforo-molibdenowego i po 3,5 ml wody. 6. Dokonaj pomiaru absorbancji wszystkich przygotowanych prób (próby 3-8 oraz próby B1 i B2) w obecności próby ślepej, przy długości fali λ=660 nm, wyniki zanotuj w sprawozdaniu. 7. blicz stężenie glukozy w próbach 3-8, a uzyskane wyniki umieść w sprawozdaniu. 8. Na podstawie wyznaczonej krzywej kalibracyjnej określ stężenie glukozy w badanych próbach B1 i B2, a wyniki i komentarz umieść w sprawozdaniu. znaczenie poziomu glukozy przy użyciu glukometru znaczenie stężenia glukozy wykonaj zgodnie z zaleceniami prowadzącego! 1. Przygotuj ponownie próbę badana B1 według wcześniejszej tabeli. 2. Umieść pasek testowy w urządzeniu 5

6 3. Za pomocą pipety nanieś 10 μl badanej próby B1 na powierzchnię reakcyjną paska testowego. 4. Zanotuj w sprawozdaniu uzyskany wynik i porównaj go z rezultatem uzyskanym za pomocą metody redukcyjnej. 6