spektropolarymetrami;

Transkrypt

1 Ćwiczenie 12 Badanie własności uzyskanych białek: pomiary dichroizmu kołowego Niejednakowa absorpcja prawego i lewego, kołowo spolaryzowanego promieniowania nazywa się dichroizmem kołowym (ang. circular dichroism, CD). Jeżeli dysponujemy prawym i lewym, kołowo spolaryzowanym promieniowaniem o określonej długości fali, można zjawisko dichroizmu kołowego badać ilościowo. Dla określonej długości fali: A A L A R (1.1) gdzie: ΔA to różnica w absorpcji pomiędzy lewo- (A L ) i prawoskrętnie (A R ) kołowo spolaryzowanym promieniowaniem. Gdy zastosujemy prawo Lamberta-Beera powyższe równanie można zapisać: A Rcl L (1.2) gdzie ε L i ε R to molowe współczynniki absorpcji dla lewo- (A L ) i prawoskrętnie (A R ) kołowo spolaryzowanego promieniowania, c stężenie molowe, l długość drogi optycznej w cm. Miarą wielkości dichroizmu kołowego jest współczynnik Δε, który wyraża różnice współczynników molowych absorpcji lewego i prawego kołowo spolaryzowanego promieniowania: ( R) L (1.3) Istnieje prosta zależność pomiędzy ΔA a eliptycznością (θ): 32.98A (1.4) W przypadku pomiarów CD można wprowadzić wielkość, która uwzględnia długość drogi optycznej oraz stężenie badanej substancji, jest to eliptyczność właściwa (Ψ): 100c` l gdzie: c` oznacza stężenie wyrażone w g/ml. (1.5) Aby móc porównywać wartości CD dla różnych substancji wprowadzono wielkość zwaną eliptycznością molową (Θ): 10cl (1.6) Typowe widma CD białek pokazane są na rys. 1. Ponieważ dichroizm kołowy polega na różnicy między dwiema wartościami absorbancji, widmo CD w zależności od długości fali - może być dodatnie lub ujemne; kształt widma zależy od konformacji badanych cząsteczek. Białka zbudowane są z aminokwasów, które są (z wyjątkiem glicyny) związkami chiralnymi. Widma CD w dalekim nadfiolecie ( nm), gdzie za absorpcję 1

2 odpowiedzialne są wiązania peptydowe, dostarczają informacji dotyczących różnych regularnych struktur drugorzędowych: helisy α, struktury β i zwrotu β. Aktywność optyczna polipeptydów i białek w dalekim nadfiolecie jest wynikiem zaburzeń przejść elektronowych typu π π* i n π*. Sygnały CD obserwowane w bliskim UV ( nm) pochodzą głównie od aminokwasów aromatycznych (fenyloalaniny, tryptofanu, tyrozyny) oraz w mniejszym stopniu od wiązań dwusiarczkowych i dostarczają informacji na temat struktury trzeciorzędowej białek. Rysunek 1. Charakterystyczne kształty widm CD różnych typów struktur drugorzędowych występujących w białkach. Pomiary dichroizmu kołowego pozwalają oszacować zawartość struktur drugorzędowych w badanym białku, a także umożliwiają detekcję zmian konformacyjnych spowodowanych wprowadzeniem mutacji, dołączeniem znacznika, czy denaturacją. Widma CD rejestruje się za pomocą przyrządów zwanych spektropolarymetrami; działają one w zasadzie podobnie jak jednowiązkowe spektrofotometry, tyle że stosowane w nich światło jest spolaryzowane kołowo. Ponieważ jednak efekty CD są na ogół dość niewielkie, a pomiary muszą obejmować także zakres dalekiego UV, konieczne są tu źródła światła o znacznie większym natężeniu, a stosowane przyrządy mają dość wyspecjalizowany charakter. 2

3 Rysunek 2. Schemat ukazujący podstawowe elementy typowego spektropolarymetru, gdzie S- próbka, R- odnośnik, L/R- światło spolaryzowane lewo- i prawoskrętnie. Wykonanie ćwiczenia: Przygotować spektropolarymetr JASCO-710 do wykonania pomiaru (uruchomić strumień azotu z butli około 30 min. przed rozpoczęciem pomiaru. Azot ma usunąć tlen z otoczenia lampy ksenonowej): a. włączyć zasilanie lampy; b. włączyć zasilanie pozostałej części aparatu i komputera; Oznaczyć stężenie przygotowanego białka: λ=280 nm, ε=17600m -1 cm -1, l=1 cm. Oczyszczone białko jest w 10 mm buforze fosforanowym ph 7.5. Przygotować kuwety kwarcowe do pomiarów CD (umyć, przepłukać wodą i wysuszyć); a. do pomiarów CD w dalekim UV w kuwecie o drodze optycznej 1.0 cm użyć białka o stężeniu mg/ml; b. do pomiarów CD w bliskim UV w kuwecie o drodze optycznej 0.1 cm użyć białka o stężeniu mg/ml. W razie potrzeby rozcieńczyć białko buforem pomiarowym. Wykonać pomiar buforu referencyjnego ( Spectra Manager Spectrum Measurement) i wprowadzić dane do ustawienia pomiaru (Measurement Parameter). Wykonać pomiary dla buforu przy analogicznych parametrach jak dla roztworu białka (patrz pkt. 5 i 6), pomiary zapisać. 3

4 Zrzut ekranu z programu sterującego aparatura pomiarową. Przykładowe parametry przy jakich można wykonać pomiar CD. Pomiar widma CD białka w zakresie fal świetlnych nm (dalekie UV). Uruchomić program sterujący pracą urządzenia (Spectra menager -> Spectrum Measurment) i wprowadzić podane przez prowadzącego ćwiczenia ustawienia pomiaru (Measurment -> Parameter). Proszę te dane zapisać, celem późniejszego 4

5 umieszczenia ich w sprawozdaniu. Umieścić roztwór białka w kuwecie pomiarowej i wykonać pomiar widma CD przy identycznych parametrach, jak dla buforu referencyjnego. Pomiar widma CD białka w zakresie fal świetlnych o długości nm bliskie UV. Uruchomić program sterujący pracą urządzenia (Spectra menager -> Spectrum Measurment) i wprowadzić podane przez prowadzącego ćwiczenia ustawienia pomiaru (Measurment -> Parameter). Proszę te dane zapisać, celem późniejszego umieszczenia ich w sprawozdaniu. Umieścić roztwór białka w kuwecie pomiarowej i wykonać pomiar widma CD przy identycznych parametrach, jak dla buforu referencyjnego. Pomiar zapisać. Zapisać pomiary w pliku tekstowym ASCI, gdzie wynik będzie podany w jednostkach eliptyczności różnicowej (mdeg). Usystematyzować nazwy wszystkich plików. Zagadnienia do sprawozdania (sprawozdanie obejmuje materiał z ćw. 12): 1. Przeprowadzić analizę i dyskusję uzyskanych wyników. Wykorzystać program K2D2 ( lub inne komercyjnie dostępne programy do analizy zawartości struktur drugorzędowych w białkach. Proszę podać procentowe zawartości struktur drugorzędowych oraz przedstawić uzyskane widma dichroizmu kołowego. Uwaga: K2D2 przyjmują dane jako pojedyncza linie kolumnę w jednostkach Δε uporządkowanych od krótszych do dłuższych długości fali w zakresach nm (51pkt.) lub nm (41pkt.) z rozdzielczością co 1 nm. 2. Na poniższych rysunkach przedstawiono zarejestrowane widma CD dwóch białek (nazwanych A i B) o nieznanej strukturze. Proszę napisać, jaki typ struktury drugorzędowej dominuje w każdym z nich. 5

6 Sprawozdanie powinno zawierać: krótko sformułowany cel ćwiczenia; właściwie opisane wyniki eksperymentów; odpowiedzi na zagadnienia odnoszące się do danego ćwiczenia. Proszę nie umieszczać w sprawozdaniu: wstępu teoretycznego; opisu wykonania ćwiczenia. Sprawozdanie można oddać w wersji papierowej (pokój C020) lub przesłać w formie elektronicznej: ewelina.fic@uj.edu.pl. Ostateczny termin oddawania sprawozdania to 7 dni od daty wykonania ćwiczenia nr 12. Polecana literatura: Siemion I Biostereochemia PWN, Warszawa, 1985; Kelly SM, Price NC. The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function. Curr Protein Pept Sci Dec;1(4): (publikacja jest dostępna na stronie www kursu w zakładce Zagadnienia do referatu nr 8 ); Kelly SM, Jess TJ, Price NC. How to study proteins by circular dichroism. Biochim Biophys Acta Aug 10;1751(2): (publikacja jest dostępna na stronie www kursu w zakładce Zagadnienia do referatu nr 8 ). 6