Biochemia Ćwiczenie 2

Transkrypt

1 Imię i nazwisko Uzyskane punkty Nr albumu data /3 podpis asystenta ĆWICZENIE 2 IZOLACJA BIAŁEK NA PRZYKŁADZIE KATALAZY Wstęp merytoryczny Katalaza (oksydoreduktaza nadtlenek wodoru: nadtlenek wodoru, EC ) jest hemoproteiną zawierającą 4 grupy hemowe, w których atomy Ŝelaza występują na III stopniu utlenienia (Fe 3+ ). KaŜdy monomer tego tetramerycznego enzymu zawiera jedno ugrupowanie hemowe umieszczone we wnętrzu wąskiego hydrofobowego kanału, co umoŝliwia dostęp jedynie cząsteczkom mniejszym niŝ cząsteczka H 2 O 2. Ponadto kaŝdy monomer katalazy zawiera 1 związaną cząsteczkę NADPH+H +, zapobiegającą m.in. inaktywacji enzymu przez substrat, który jest silnym utleniaczem. Katalaza rozkłada nadtlenek wodoru utworzony przez oksydazy. W większości procesów katalizowanych przez ten enzym, zarówno substratem jak i akceptorem elektronów jest H 2 O 2. Alternatywnym donorem protonów moŝe być inny zredukowany związek. Enzym obecny jest w komórkach roślin, zwierząt oraz bakterii. U człowieka wysoką aktywność katalazy obserwuje się we krwi, szpiku kostnym, błonach śluzowych, nerkach i wątrobie. W wątrobie oraz wielu innych tkankach stwierdzono w komórkach obecność peroksysomów, charakteryzujących się duŝą aktywnością oksydaz i katalazy. Znacznie mniejszą aktywność tego enzymu obserwuje się w mitochondriach i siateczce śródplazmatycznej. Źródłem H 2 O 2 mogą być takŝe, poza enzymami peroksysomalnymi, reakcje katalizowane przez mitochondrialny i mikrosomalny układ transportujący elektrony oraz oksydazę ksantynową. Katalaza jest enzymem wykazującym aktywność katalazy i peroksydazy. Aktywność katalazowa umoŝliwia prowadzenie reakcji dysproporcjonowania nadtlenku wodoru do wody i tlenu: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Aktywność peroksydazowa katalazy umoŝliwia redukcję H 2 O 2 do wody przy udziale związków będących donorami wodoru (XH 2 ): H 2 O 2 + XH 2 2 H 2 O + X Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 1

2 Schemat działania katalazy (aktywność katalazowa): Schemat działania katalazy (aktywność peroksydazowa): Na podstawie: Kato S., Ueno T, Fukuzumi S., Watanabe Y.: Catalase reaction by myoglobin mutants and native catalase: mechanistic investigation by kinetic isotope effect. J Biol Chem 2004; 279(50): Celem ćwiczenia jest: a) izolacja katalazy z wątroby wołowej b) oznaczenie stęŝenia białka na poszczególnych etapach izolacji c) oznaczenie aktywności enzymu na poszczególnych etapach izolacji d) ocena stosowanej metody izolacji Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 2

3 Cel: Izolacja katalazy z wątroby wołowej. Zasada metody: Doświadczenie 1 Izolacja pojedynczego białka z mieszaniny wielu białek jest moŝliwa dzięki zróŝnicowaniu ich właściwości fizykochemicznych, takich jak: rozpuszczalność, masa cząsteczkowa, ładunek elektryczny, powinowactwo jednych cząsteczek do drugich. Pierwszym zasadniczym elementem działań prowadzących do otrzymania czystego białka jest wybór materiału biologicznego. Powinien on przede wszystkim charakteryzować się wysoką zawartością danego białka. W przypadku wyboru procedur izolacyjnych waŝne jest takŝe rozmieszczenie danego białka w materiale biologicznym (białko pozakomórkowe, wewnątrzkomórkowe, białko błonowe), gdyŝ warunkuje ono dobór wstępnej techniki izolacyjnej umoŝliwiającej jego uwolnienie do roztworu (krojenie, mielenie, homogenizacja, sonikacja, liza osmotyczna, prasa frencza, zastosowanie detergentów itp.). Zastosowanie pojedynczej techniki izolacyjnej nie pozwala jednak na uzyskanie w pełni oczyszczonego białka. Postępowanie wymaga zastosowania wielu kolejno po sobie następujących procedur, aby na kaŝdym etapie izolacji danego białka uzyskać coraz to wyŝszy stopień jego oczyszczenia. Postępowanie: Odczynniki do etapów 2-4 znajdują się pod wyciągami 1) Do cylindra o pojemności 25 cm 3 pobierz od personelu technicznego około 10 ml 30% homogenatu wątroby. 2)* Dodaj do niego mieszaninę etanol: chloroform (1:1) w ilości 2,5 ml na kaŝde 10 ml homogenatu. Dokładnie wytrząsaj przez 20 sek. Przenieś do szklanej zamykanej probówki wirowniczej i wiruj 10 min przy 3000 obr / min. Po zwirowaniu przelej supernatant (płyn znad osadu) do umytego cylindra, zmierz objętość supernatantu (wynik wpisz do tabeli), pobierz 0,5 ml do oznaczenia zawartości białka oraz aktywności katalazy. Wszystkie próbki przeznaczone do badania aktywności przechowuj w lodzie! 3)* Resztę supernatantu przenieś do nowej szklanej zamykanej probówki wirowniczej, zakwaś jedną kroplą kwasu octowego lodowatego (jedna kropla pobrana pipetą o pojemności 0.02 ml) i dobrze wymieszaj (unikaj spienienia płynu). Wytrącony osad usuń przez wirowanie 10 min przy 3000 obr / min. Zmierz objętość supernatantu (wynik wpisz do tabeli), pobierz 0,5 ml do oznaczenia zawartości białka oraz aktywności katalazy. 4) Do reszty supernatantu przeniesionego do kolejnej szklanej zamykanej probówki wirowniczej na kaŝde 10 ml płynu dodaj 2,5 ml Ŝelu fosforanowo-wapniowego, mieszaj około min (unikaj spienienia płynu). Zbierz osad przez wirowanie przy 3000 obr / min przez 5min. 5)* Zaadsorbowaną na Ŝelu katalazę eluuj 4 ml 0,1mol/l buforem fosforanowym o ph 8.0. Eluat wiruj 5 min. przy 3000 obr / min. Zmierz objętość supernatantu (wynik wpisz do tabeli), pobierz 0,5 ml do oznaczenia zawartości białka oraz aktywności katalazy. Pozostały supernatant przenieś do czystej probówki wirowniczej. 6) Do supernatantu dodaj porcjami siarczan amonu w ilości 0,3 g na 1 ml płynu. Siarczan amonu dodawaj powoli, stale mieszając bagietką aŝ do całkowitego rozpuszczenia (unikaj spienienia płynu). 7) Po zakończeniu dodawania siarczanu amonu powstały osad zwiruj przez 10 min przy 3000 obr/min. Supernatant odrzuć a osad rozpuść w 0,5ml 0,06 mol/l buforu fosforanowego o ph 7.2. Jest to surowy preparat katalazy. 8) Surowy preparat katalazy przenieś do worka dializacyjnego. PomoŜe w tym personel techniczny. NaleŜy go umieścić w zlewce z zimną wodą destylowaną. Czas dializy: 7 dni w temperaturze 5 C. Objętość supernatantu na poszczególnych etapach izolacji Etap 2* Etap 3* Etap 5* Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 3

4 Obserwacje: Wnioski: Doświadczenie 2 Cel: Oznaczanie zawartości białka na poszczególnych etapach oczyszczania Zasada metody: Reakcja biuretowa jest reakcją barwną, której podlegają: większość peptydów, białka, dimocznik (biuret), diamidy. Wolne aminokwasy i dipeptydy nie dają dodatniej próby. Nazwa reakcji wywodzi się od nazwy biuretu, czyli dimocznika, który jest najprostszym ze związków podlegających tej reakcji. W środowisku zasadowym wiązanie peptydowe ulega tautomeryzacji do formy enolowej, zdolnej do dysocjacji. W tych warunkach jon Cu 2+ tworzy dwa wiązania z dwiema sąsiednimi grupami enolowymi i dwa wiązania koordynacyjne z atomami azotu. Powstaje kompleks o barwie czerwonofioletowej lub niebieskofioletowej, a intensywność barwy jest wprost proporcjonalna do ilości zaangaŝowanych w reakcji wiązań peptydowych. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 4

5 Postępowanie: Z kaŝdą z trzech próbek supernatantu uzyskanych w doświadczeniu 1 (etapy zaznaczone gwiazdką) postępuj według poniŝszego schematu. 1) Przygotuj 4 krótkie probówki i podpisz 0 (próbka odnośnikowa), B1 (supernatant pobrany po etapie 2), B2 (supernatant pobrany po etapie 3), B3 (supernatant pobrany po etapie 5) 2) Do 0.1 ml supernatantu dodaj 0.4 ml wody. Zawartość probówki wymieszaj, a następnie dodaj 2,5 ml odczynnika biuretowego i ponownie wymieszaj. 3) W celu przygotowania próbki odnośnikowej, do 0,5 ml wody dodaj 2,5 ml odczynnika biuretowego i wymieszaj zawartość. 4) Po 30 min zmierz ekstynkcję wobec próby odnośnikowej na spektrofotometrze Marcel przy długości fali 540 nm. 5) StęŜenie białka odczytaj z krzywej wzorcowej wykonanej w trakcie ćwiczenia 1. Odczytane stęŝenie odpowiada zawartości białka w 0.1 ml supernatantu. etap izolacji 2* 3* 5* stęŝenie białka w badanej próbce c (mg/ml) zawartość białka w badanym supernatancie c x v Obserwacje: Wnioski: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 5

6 Cel: Oznaczanie aktywności katalazy Zasada metody: Doświadczenie 3 Aktywność katalazy mierzymy na podstawie szybkości rozkładu nadtlenku wodoru przebiegającego wg reakcji: 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 NierozłoŜony nadtlenek wodoru reaguje z jodkiem potasowym: H 2 O 2 + 2KI + 2H + I 2 + 2H 2 O + 2K + Wydzielony ilościowo wolny jod, związany powierzchniowo z kwasem molibdenowym, odmiareczkowuje się roztworem tiosiarczanu do uzyskania jasnosłomkowej barwy. I 2 + 2S 2 O 3 2-2I - + S 4 O 4 2- Po uzyskaniu wspomnianej wyŝej barwy do roztworu naleŝy dodać 2-3 krople roztworu skrobi. Roztwór przybiera niebieskie zabarwienie pochodzące od powstającego kompleksu skrobi z jodem. Roztwór miareczkujemy dalej do całkowitego odbarwienia. Postępowanie: Aby oznaczyć aktywność katalazy naleŝy oznaczyć ilość substratu (H 2 O 2 ) w buforze reakcyjnym przed rozpoczęciem reakcji (stan początkowy A 0 ) i porównać go ze stanem po 4 min trwania reakcji enzymatycznej (stan A 4 ). Preparat katalazy naleŝy wstępnie rozcieńczyć 500 razy (np ml supernatantu uzupełnić zimną wodą destylowaną do 5 ml). JeŜeli przy próbie A 4 po dodaniu 0,5 ml 5% KI i 0.25 ml nasyconego roztworu kwasu molibdenowego nie pojawia się Ŝółte zabarwienie przygotowujemy wyŝsze rozcieńczenia katalazy np. 1:1000, 1:1500, 1:2000. JeŜeli jest zbyt mała róŝnica między ilością tiosiarczanu sodu zuŝytego na zmiareczkowanie wydzielonego jodu pomiędzy próbką A 0 i A 4 katalaza jest za bardzo rozcieńczona. Prawidłowa róŝnica to co najmnej 6 ml. Przygotuj kolby stoŝkowe i postępuj zgodnie z tabelą A 0 A 4 Do kolby stoŝkowej kolejno odpipetuj a potem wymieszaj 0,06mol/l bufor fosforanowy o H 2 O 1 mol/l H 2 SO 4 ph 6.8 z H 2 O 2 Do kolby stoŝkowej kolejno odpipetuj a potem wymieszaj katalaza 0,06mol/l bufor rozcieńczona po 4 min reakcji fosforanowy o zimną wodą enzymatycznej ph 6.8 z H 2 O 2 destylowaną 2,5 ml 0,1 ml 2,5 ml 2,5 ml 0,1 ml 1 mol/l H 2 SO 4 2,5 ml 5% KI nasycony roztwór kwasu molibdenowego 5% KI nasycony roztwór kwasu molibdenowego 0,5 ml 0.25 ml 0,5 ml 0,25 ml Wymieszaj i pozostaw na 3 min Wymieszaj i pozostaw na 3 min Wydzielony jod odmiareczkuj roztworem mol/l tiosiarczanu sodowego, dodając pod koniec miareczkowania 2-3 krople1% roztworu skrobi (miareczkować do pierwszego trwałego zaniku barwy). Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 6

7 Obserwacje: A 0 (ml) A 4 etapu 2* (ml) A 4 etapu 3* (ml) A 4 etapu 5* (ml) Wnioski: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 7

8 Cel: Ocena zastosowanych metod izolacji Doświadczenie 4 Zasada metody: Prawidłowość zastosowanych metod ocenia się na podstawie wyliczonych wartości aktywności katalazy na kolejnych etapach izolacji, obliczenie aktywności właściwej i stopnia oczyszczenia Postępowanie: Aktywność katalazy naleŝy wyliczyć ze wzoru: gdzie: K = 1/t log A 0 /A 4 K - aktywność katalazy (współczynnik szybkości reakcji min -1 ); A 0 - ilość ml Na 2 S 2 O 3 zuŝyta na zmiareczkowanie próby w czasie 0; A 4 - ilość ml Na 2 S 2 O 3 zuŝyta na zmiareczkowanie próby w czasie 4; t - czas w min (4 min). Aktywność właściwą katalazy naleŝy wyliczyć ze wzoru: gdzie: K 0 = (K / C) R [1/min x ml/mg] K 0 - aktywność właściwa katalazy; K - aktywność katalazy na poszczególnych etapach izolacji; C - stęŝenie białka w mg/ml; R - rozcieńczenie. Stopień oczyszczenia enzymu naleŝy wyliczyć ze wzoru: gdzie: Stopień oczyszczania = Ko(n) /K 0 (1) K 0 (n) - aktywność właściwa na etapie n (3*, 5*) K 0 (1) - aktywność właściwa na etapie 1 (2*) Obliczenia: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 8

9 Etap K K 0 Stopień oczyszczenia 2* - 3* 5* Wnioski: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 9