Wyznaczanie krzywej progresji reakcji i obliczenie szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez β-fruktofuranozydazy W organizmach żywych reakcje chemiczne rzadko zachodzą w nieobecności katalizatora. Katalizatorami są przede wszystkim swoiste białka zwane enzymami. ierwszym etapem katalizy enzymatycznej jest utworzenie kompleksu enzym substrat. ubstrat ulega związaniu w specyficznym regionie cząsteczki enzymu, zwanym miejscem (centrum) aktywnym i w kompleksie z enzymem przekształca się w produkt reakcji. W następnym etapie kompleks rozpada się na wolny enzym i cząsteczkę lub cząsteczki produktów. Najprostszy zapis każdej reakcji enzymatycznej jest zatem następujący: E E E E oczątkowa szybkość v reakcji enzymatycznych i aktywność enzymu oczątkową szybkość reakcji katalizowanej przez enzym przyjęto za miarę jego aktywności. Wylicza się ją z tzw. krzywej progresji. Krzywa ta ujmuje zależność ilości przetworzonego substratu (ubytek substratu Δ[]) lub też powstałego w reakcji produktu (Δ[]) od czasu jej trwania: [] = f(τ) lub [] = f(τ). Krzywa progresji obrazuje przebieg reakcji enzymatycznej w obecności enzymu o stałym stężeniu ([E] = const.) i przy wybranym początkowym stężeniu substratu ([ ] = const.) Wykres. Zależność czasu reakcji od początkowego stężenia substratu - τ = f([ ]) (krzywa ) oraz czasu reakcji od początkowego stężenia produktu - τ =f([ ]) (krzywa ) oczątkowa szybkość reakcji v równa jest tangensowi kąta α i można ją obliczyć z podanych poniżej wzorów:
v v lub v tg Gdzie,, i oznaczają stężenia substratu, a,, i - stężenia produktu po odpowiednich czasach reakcji (τ, τ, τ, τ ). zybkość reakcji wyliczona z powyższych równań ma stałą wartość: v k tylko w odpowiednio krótkim przedziale czasu (od τ do τ x, w podanym przykładzie τ = τ ). Krzywa progresji jest wówczas linią prostą, a reakcja ma charakter reakcji zerowego rzędu. zybkość początkowa reakcji odpowiada zatem tg kąta nachylenia w punkcie do krzywej progresji [] = f(τ) lub [] = f(τ). o dłuższym czasie trwania reakcji przyrost produktów reakcji Δ[] bądź ubytek substratu Δ[] przestaje być wprost proporcjonalny czasu jej trwania (tzn. krzywa progresji przestaje być funkcją liniową) i szybkość reakcji zmniejsza się. zybkość reakcji enzymatycznej w warunkach, w których przebiega ona według zerowego rzędu reakcji nazywa się szybkością początkową - v. zybkość początkowa reakcji enzymatycznej stanowi podstawę do oceny aktywności enzymu i badania jego właściwości kinetycznych. Z tego względu prawidłowe ustalenie wartości początkowej szybkości reakcji katalizowanej przez enzym jest bardzo ważne. Z kolei aktywność enzymu pośrednio określa jego stężenie w danym materiale biologicznym lub nieczyszczonym do homogenności preparacie enzymatycznym. tężenia enzymu w badanym materiale nie wyraża się z reguły w jednostkach wagowych, np. g L - lub g kg -, ponieważ wymagałoby to izolacji i oczyszczenia białka enzymatycznego, co jest na ogół bardzo pracochłonne, gdyż większość materiałów lub aktywnych preparatów enzymatycznych zawiera szereg innych substancji, w tym różnych białek. Aktywność enzymu określa się zwykle jako ilościowy przyrost produktów w odniesieniu do czasu reakcji katalizowanej przez enzym. W oznaczeniu stężenia produktów reakcji wykorzystuje się metody chemiczne, fizyczne i enzymatyczne. tężenie produktów wyraża się w tradycyjnych jednostkach [μm, Mm, μg cm -, mg cm -, itp.]. Według zaleceń Komisji Enzymowej z roku 964 jednostką standardową enzymu, oznaczaną symbolem J (ang. U), jest ta ilość enzymu, która katalizuje przemianę μmola substratu w ciągu minuty w standardowych warunkach reakcji przy stężeniu substratu gwarantującym maksymalna szybkość reakcji. Mianem jednostki standardowej aktywności enzymu jest więc [μmol min - ]. W roku 97 Komitet Enzymowy wprowadził zmiany w definicji jednostki aktywności enzymatycznej. Jednostką aktywności enzymatycznej jest ta aktywność (ilość lub wielkość aktywności), która przekształca mol substratu w czasie sekundy. Tę jednostkę nazwano katalem (kat.). Mianem katala jest mol s -. Obie jednostki wykorzystywane są w enzymologii równie często. Aby oznaczyć aktywność enzymu, inkubuje się jego roztwór przez określony czas z roztworem substratu w określonej temperaturze, a następnie przerywa reakcję (zwykle denaturując
enzym termicznie lub chemicznie) i ilościowo oznacza przyrost produktów reakcji (czasem ubytek substratu). Enzymatyczna hydroliza β-fruktofuranozydów Badania kinetyczne będą wykonywane na przykładzie reakcji katalizowanej przez β-fruktoforanozydazę (fruktohydrolaza β-d-fruktofuranozydów, EC...6). Enzym ten należy do klasy hydrolaz i podklasy hydrolaz glikozydowych. β-fruktoforanozydaza katalizuje hydrolityczny rozkład wiązania glikozydowego pomiędzy anomerycznym atomem węgla reszty β-d-fruktofuranozy i anomerycznym atomem węgla reszty α-d-glukopiranozy w β-d-fruktofuranozydach, takich jak sacharoza i rafinoza. Niektóre β-fruktoforanozydazy rozkładają także inulinę, która jest polimerem fruktozy o charakterze β-,-d-fruktanu. W wyniku hydrolizy sacharozy powstaje cząsteczka glukozy i cząsteczka fruktozy. onieważ sacharoza jest cukrem nieredukującym, a produkty jej hydrolizy (glukoza i fruktoza) to cukry redukujące, aktywność β-fruktoforanozydazy można obliczyć przez pomiar cukrów redukujących, uwolnionych w trakcie reakcji katalizowanej przez ten enzym. Często β-fruktoforanozydaza nazywana jest sacharazą albo inwertazą. Nazwa sacharaza pochodzi od nazwy substratu sacharozy, natomiast inwertaza od towarzyszącej działaniu enzymu zmiany kąta skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego. Roztwór sacharozy skręca tę płaszczyznę w prawo, natomiast mieszanina glukozy i fruktozy, tzw. cukier inwertowany w lewo. Bogatym źródłem β-fruktoforanozydazy są drożdże piekarskie. Zasada oznaczania aktywności β-fruktoforanozydazy W celu zaobserwowania przebiegu hydrolizy sacharozy pod działaniem β- fruktoforanozydazy wykorzystuje się metody pozwalające na pomiar przyrostu stężenia cukrów redukujących uwalnianych z substratu przez enzym. ą to między innymi metody: Fehlinga, omogyi - Nelsona, oraz Hagedorna Jensena, w których stężenia cukrów redukujących oznacza się na podstawie ilości Cu O powstającego na skutek redukcji jonów miedziowych przez wolne grupy redukujące cukrów, oraz metoda Millera z kwasem,5 - dinitrosalicylowym (DN) stosowana w niniejszym ćwiczeniu. W metodzie Millera aktywność enzymu oznacza się mierząc przyrost cukrów redukujących uwolnionych w czasie reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez β-fruktoforanozydazę przebiegającej w przyjętych warunkach temperatury i ph. Cukry te oznacza się ilościowo stosując alkaliczny roztwór kwasu,5 -dinitrosalicylowego (DN). W analogiczny sposób można oznaczyć aktywność dowolnej hydrolazy glikozydowej, stosując
odpowiedni dla niej substrat. DN nie tylko umożliwia oznaczenie stężenia cukrów redukujących, ale także pełni rolę inaktywatora enzymu, hamującego katalizowaną przez niego reakcję. W środowisku alkalicznym i w temperaturze C DN ulega redukcji pod działaniem cukrów redukujących, dając pochodną aminową, zabarwioną w środowisku alkalicznym na kolor pomarańczowy. Natężenie barwy, o maksimum absorbancji przy długości fali λ = 54 nm, jest proporcjonalne do stężenia cukrów redukujących w badanym roztworze. tężenie cukrów redukujących w próbie odczytuje się z krzywej wzorcowej A 54 = f(c glukozy ), przygotowanej w warunkach oznaczenia. Wykres. Krzywa wzorcowa. Zależność absorbancji przy λ = 54 nm od stężenia glukozy - A 54 = f(c glukozy ) Obliczanie aktywności enzymu rzyrost stężenia cukrów redukujących w mieszaninie reakcyjnej oblicza się na podstawie różnicy absorbancję próby właściwej i kontrolnej: A A wlasc A 54. kontr. Aktywność preparatu enzymu (A) oblicza się ze wzoru: [ molsubstr c[ mol ml ] A ],5 min. mg [min.] [ E][ mg ml ] enzymu Współczynnik,5 we wzorze wynika z tego, że hydroliza cząsteczki sacharozy daje dwie cząsteczki cukrów redukujących. c stężenie cukrów redukujących w pierwotnej mieszaninie reakcyjnej w [µmol/ml] (Masa molowa glukozy: 8,6 g/mol) [E] ilość enzymu w pierwotnej mieszaninie reakcyjnej w [mg/ml] t czas reakcji w minutach
mol Uzyskany wynik, podany w [ min. mg ], czyli jednostkach standardowych w przeliczeniu na mg preparatu β-fruktofuranozydazy, należy wyrazić także w katalach [mol s - ] w odniesieniu do tej samej ilości preparatu. Literatura: tryer L., Biochemia, WN, Withers G, Mechanisms of glycosyl transferases and hydrolases, Carbohydr olym 44: 5-7, Miller G.L.; Use of dinitriosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem.,, 46 48, 959 ODCZYNNIKI-MATERIAŁY-RZĘT preparat β-fruktofuranozydazy z drożdży (inwertazy) (,5 mg/ml) 5 mm roztwór sacharozy w, M buforze sodowo-octanowym o ph 4,7 % alkaliczny roztwór kwasu,5 -dinitrosalicylowego (DN) woda destylowana pipety drożdże aceton probówki termoblok stoper spektrofotometr ROCEDURY Izolowanie β-fruktofuranozydazy z drożdży. Naważkę,5 g drożdży piekarskich dokładnie rozetrzeć w moździerzu z,5 g piasku. Dodać 5 ml wody i rozcierać dalej do otrzymania homogennej konsystencji.. Dodać jeszcze 5 ml wody i po wymieszaniu przelać homogenat do probówki wirówkowej na 5 ml. Moździerz przepłukać dodatkowo 5 ml wody i połączyć wodę z homogenatem znajdującym się w probówce.. robówki wirówkowe zrównoważyć parami po czym wirować homogenat przez 5 min przy szybkości 4 x g. 4. o odwirowaniu znajdujący się nad osadem supernatant ostrożnie przelać do cylinderka i zmierzyć objętość. 5. rzenieść preparat do probówki wirówkowej na 5 ml i dodać 5-krotną objętość zimnego acetonu. Aceton należy dodawać powoli, mieszając zawartość probówki. 6. o 5 min odwirować wytrącone białka z szybkością x g. 7. upernatant ostrożnie przelać do pojemnika na zlewki acetonowe, a osad rozpuścić w ml wody.
rzygotowanie prób właściwych. Do dwóch ciągów po 6 probówek odmierzyć po,5 ml 5 mm roztworu sacharozy (oznaczenia będą wykonywane w dwóch powtórzeniach).. Dodać do każdej z probówek po,5 ml roztworu enzymu (postarać się aby do wszystkich probówek dodać enzym w tym samym czasie).. Tak przygotowane mieszaniny reakcyjne inkubować w temperaturze pokojowej w ciągu,5; ; ; ; 4 i 5 minut 4. o upływie kolejnych czasów reakcji przerwać hydrolizę sacharozy w dwóch probówkach poprzez dodanie do każdej probówki po,5 ml roztworu DN. 5. Zawartość probówek dokładnie wymieszać i inkubować w ciągu 5 minut w termobloku C. 6. o inkubacji probówki schłodzić pod bieżącą wodą do temperatury pokojowej, następnie z każdej probówki przenieść po, ml mieszaniny reakcyjnej do nowych probówek. 7. Dodać do każdej po,4 ml wody destylowanej i zmierzyć absorbancję otrzymanych mieszanin dla λ = 54 nm (A 54 ) wobec próby odczynnikowej. rzygotowanie próby kontrolnej. Do,5 ml roztworu enzymu dodać,5 ml roztworu DN, a następnie,5 ml 5 mm roztworu sacharozy (dokładnie w takiej kolejności).. Zawartość wymieszać i inkubować w ciągu 5 minut w termobloku C.. o 5 minutach probówkę schłodzić pod bieżącą wodą do temperatury pokojowej, przenieść z niej, ml mieszaniny do nowej probówki i dodać,4 ml wody destylowanej. 4. Zmierzyć absorbancję próby dla λ = 54 nm (A 54 ) wobec próby odczynnikowej. rzygotowanie próby odczynnikowej. Do,5 ml wody destylowanej dodać,5 ml roztworu DN. Zawartość wymieszać i inkubować w ciągu 5 minut w termobloku C.. o schłodzeniu probówki do temperatury pokojowej, przenieść z niej, ml mieszaniny do nowej probówki i dodać do niej,4 ml wody destylowanej i otrzymany roztwór zastosować do kalibracji spektrofotometru. Opracowanie wyników. Obliczyć ΔA 54 i na jej podstawie obliczyć przyrost stężenia cukrów redukujących uwolnionych w różnym czasie reakcji.. Wykonać wykres zależności ilości uwolnionych cukrów redukujących (glukozy) od czasu reakcji [] = f(t reakcji ) i obliczyć wartość początkowej szybkości reakcji (v ).. Obliczyć aktywność preparatu β-fruktofuranozydazy.