Oznaczanie aktywności enzymów amylolitycznych.

Transkrypt

1 Oznaczanie aktywności enzymów amylolitycznych. Zajęcia 3 godzinne część A, zajęcia 4 godzinne część A i B. Cel ćwiczenia Ćwiczenie poświęcone jest zapoznaniu się z metodami oznaczania aktywności enzymów amylolitycznych, na podstawie pomiaru przyrostu redukcyjności mieszaniny reakcyjnej metoda z heksacyjanożelazianem (III) potasu oraz na podstawie zmiany zabarwienia skrobi z jodem metoda SKB (Sandstedta, Kneena i Blisha). Wprowadzenie Enzymy amylolityczne występują powszechnie w roślinach, drobnoustrojach, zwierzętach oraz w organizmie człowieka. Rozkładają one skrobię, glikogen oraz pokrewne im oligo- i polisacharydy. Są jednymi z najwcześniej poznanych enzymów zaliczanych do klasy hydrolaz, podklasy α-glukanaz. Najważniejsze z nich to: α-amylaza (EC ), β- amylaza (EC ) oraz glukoamylaza (EC ). Szczególnie duże ilości α- i β-amylazy znajdują się w skiełkowanych ziarniakach zbóż (słód pszenny lub jęczmienny), natomiast sok z ssaczej trzustki składa się głównie z α-amylazy, niewielkiej ilości glukoamylazy, natomiast nie występuje w nim β-amylaza. Wykorzystywany na ćwiczeniach substrat - skrobia jest polisacharydem zbudowanym z reszt sześciowęglowego, redukującego cukru α-d-glukozy. Cząsteczki glukozy połączone są wiązaniami α-1,4- i α-1,6-glikozydowymi. Wskutek polimeryzacji glukozy w cząsteczce skrobi dochodzi do wytworzenia jej dwóch frakcji: amylozy i amylopektyny. Amyloza zbudowana jest z nierozgałęzionych łańcuchów połączonych wiązaniami α-1,4- glikozydowymi, podczas gdy cząsteczki amylopektyny są rozgałęzione, a rozgałęzienia w łańcuchach utworzone są przez wiązania α-1,6-glikozydowe. α-amylaza katalizuje rozrywanie wyłącznie wiązań α-1,4-glikozydowych wewnątrz cząsteczki substratu (endoamylaza). Produktami jej aktywności są dekstryny, maltotrioza, izomaltoza, maltoza i glukoza. Uwalniane reszty glukozylowe mają konfigurację α i stąd pochodzi symbol α przy nazwie enzymu. W wyniku działania α-amylazy następuje początkowo szybki spadek lepkości substratu, zmiana zabarwienia kompleksu z jodem i stosunkowo powolny przyrost redukcyjności w mieszaninie reakcyjnej. α-amylazy różnego pochodzenia wykazują optimum aktywności w zakresie ph 4,5-7,0, chociaż znane są enzymy pochodzenia bakteryjnego, dla których wartość ta wynosi 10,0-10,5. Dla α-amylazy trzustkowej optimum ph wynosi 6,7-7,0. Optymalna temperatura działania α-amylaz mieści się w granicach C, a tylko dla niektórych enzymów bakteryjnych (np. wyizolowanych z Bacillus licheniformis) jest wyższa i wynosi C. β-amylaza działa na substrat od strony nieredukującego końca łańcucha i dlatego nazywana jest egzoamylazą. Hydrolizuje co drugie wiązanie α-1,4-glikozydowe, odrywając jednostki β-maltozy. Podczas hydrolizy występuje przegrupowanie Waldena i dlatego uwalniana maltoza jest w formie β. Enzym ten nie działa na wiązanie α-1,6-glikozydowe i nie jest w stanie go ominąć jak α-amylaza. Działanie jej zatrzymuje się więc po dojściu do tego wiązania w cząsteczce substratu. W wyniku aktywności β-amylazy z substratami rozgałęzionymi (zawierającymi wiązania α-1,6-glikozydowe np. skrobia) produktami będą β- maltoza i wysokocząsteczkowa dekstryna graniczna. W mieszaninie reakcyjnej β-amylazy ze skrobią obserwuje się szybki przyrost redukcyjności, natomiast nie występuje szybki spadek lepkości. Wolno zmienia się pod wpływem β-amylazy zabarwienie skrobi z jodem, gdyż 1

2 jednym z produktów jest wyżej wspomniana wysokocząsteczkowa dekstryna graniczna. Tej hydrolazie przypisuje się kluczową rolę w degradacji skrobi zarówno asymilacyjnej w chloroplastach jak i zapasowej w bulwach ziemniaka czy też w ziarniakach zbóż. Zakres temperatur optymalnych dla działania β-amylaz bakteryjnych obejmuje C, a optymalne ph dla ich działania wynosi 6,0-7,0. β-amylazy pochodzenia roślinnego wykazują najwyższą aktywność w zakresie ph 4,0-5,5. Glukoamylaza nazywana także amyloglukozydazą lub γ-amylazą jest wytwarzana głównie przez drobnoustroje oraz grzyby, występuje także we krwi, mięśniach, trzustce i wątrobie u zwierząt. Końcowym produktem działania glukoamylazy na substrat (skrobia, dekstryny, oligosacharydy) jest glukoza, a preparaty techniczne tego enzymu wykorzystywane są do produkcji glukozy w przemyśle spożywczym. Enzym ten katalizuje głównie hydrolizę wiązań α-1,4-glikozydowych w skrobi, odrywając kolejno jednostki glukozy od nieredukującego końca cząsteczek polisacharydu. Znacznie wolniej niż wiązania α-1,4-glikozydowe hydrolizuje wiązania α-1,6-glikozydowe, obecne w amylopektynie. Ze względu na sposób działania glukoamylaza należy do egzoamylaz. W początkowej fazie działania glukoamylazy na skrobię obserwuje się szybki przyrost redukcyjności oraz powolną zmianę barwy z jodem, a także powolny spadek lepkości w mieszaninie reakcyjnej. Optymalne ph dla działania tego enzymu mieści się w zakresie od 4,0 do 4,5. Mechanizm i sposób działania amylaz. Amylazy działając na substrat rozrywają wiązanie glikozydowe pomiędzy węglem glikozydowym, a tlenem z wiązania glikozydowego (Rys. 1.). Rys. 1. Schemat działania amylaz na amylopektynę. Sposób działania amylaz uwarunkowany jest budową ich centrum aktywnego i substratu, a także zależy od ph, temperatury, obecności inhibitorów oraz aktywatorów. W budowie centrum aktywnego amylaz wyróżnia się region katalityczny i region wiążący substrat. Pierwszy z nich bierze bezpośredni udział w rozrywaniu wiązania glikozydowego. Natomiast region wiążący jest to odcinek łańcucha polipetydowego białka, który musi połączyć się z określoną liczbą reszt glukozy w łańcuchu substratu, aby centrum katalityczne mogło spełnić swoją funkcję, tzn. aby nastąpiło rozerwanie wiązania. Metody oznaczania aktywności enzymów amylolitycznych. Oznaczanie aktywności enzymów amylolitycznych można przeprowadzić na podstawie pomiaru: 2

3 1) przyrostu redukcyjności w mieszaninie reakcyjnej, 2) zmian zabarwienia skrobi z jodem, 3) szybkości rozkładu substratów syntetycznych p-nitrofenylomaltotriozy PNPβ- G3 - substrat specyficzny dla β-amylazy, zbyt mała ilość reszt glukozy dla α-amylazy oraz zablokowanej nitrofenylomaltoheptaozy - BPNPG7 - substrat specyficzny dla α-amylazy, blokada uniemożliwia działanie β-amylazie (Megazyme), 4) zmian natężenia barwy mierzonej przy długości fali 595 nm, po reakcji ze zmodyfikowaną skrobią (Starch Azure, Sigma). Ze względu na niską specyficzność substratową enzymów amylolitycznych w stosunku do skrobi, w nieoczyszczonych homogenatach (np. wyciągu słodowym) występuje współdziałanie różnych amylaz i efekt końcowy tj. powstawanie dekstryn, oligosacharydów oraz glukozy jest wypadkową działania poszczególnych enzymów. A. Metody wykorzystujące przyrost redukcyjności w mieszaninie reakcyjnej. A-1. Metoda z heksascyjanożelazianem (III) potasu. W tej metodzie wykorzystuje się właściwości redukujące cukrów powstałych w trakcie enzymatycznej hydrolizy polisacharydów. Te uwolnione mono-, di- i oligosacharydy reagują z alkalicznym roztworem heksascyjanożelazianu (III) potasu- K 3 Fe(CN) 6 (Robyt i wsp. 1972, Kidder i wsp. 1972). Roztwór heksascyjanożelazianu (III) potasu posiada żółty kolor, który po zredukowaniu przez uwalniane w trakcie hydrolizy skrobi cukry redukujące przekształca się w bezbarwny heksascyjanożelazian (II) potasu K 4 Fe(CN) 6. Stopień osłabienia intensywności zabarwienia alkalicznego roztworu heksascyjanożelazianu (III) potasu jest zależny od ilości uwalnianych cukrów redukujących i może być miarą aktywności enzymów amylolitycznych. Odczynniki. 1. Wyciąg enzymu z trzustki wieprzowej. 2. 0,9% NaCl. 3. 1% skrobia w 0,05 M buforze Tris-HCl o ph 7, ,35% heksascyjanożelazian (III) potasu w 0,2% NaCO 3. Wykonanie. Otrzymany w kolbie miarowej na 10 ml wyciąg z trzustki wieprzowej (1) uzupełnić 0,9% NaCl (2) do kreski i wymieszać. Zawartość kolby przelać do czystej próbówki, w celu pobrania wyciągu enzymu pipetą automatyczną do oznaczeń. Do 3 enzymatycznie czystych probówek pobrać po 0,3 ml 1% zbuforowanego skrobi (3) i wstawić na 5 minut do łaźni wodnej o temperaturze 37 C (preinkubacja). Po 5 minutach do 2 probówek dodać po 0,2 ml wyciągu enzymu (próby pełne - P) i przeprowadzić reakcję hydrolizy skrobi w ciągu 15 minut w temperaturze 37 C. Następnie do wszystkich 3 probówek dodać po 1,5 ml heksascyjanożelazianu (III) potasu (4), a do trzeciej probówki zawierającej substrat i 1,5 ml heksascyjanożelazianu (III) potasu dodać dodatkowo 0,2 ml enzymu (próba materiałowa - M). Po dokładnym wymieszaniu wszystkie 3 probówki wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. Po ogrzaniu probówki schłodzić do temperatury pokojowej. Następnie do każdej probówki dodać po 10 ml wody destylowanej, dobrze wymieszać. Odczytu wartości absorbancji dokonać w fotometrze przy długości fali 420 nm, zerując fotometr względem wody destylowanej. 3

4 Opracowanie wyników. 1. Obliczyć różnicę pomiędzy wartością absorbacji dla próby materiałowej, a średnią wartością absorbacji z równoległych prób pełnych i podać ją prowadzącemu ćwiczenia. 2. Posługując się obliczoną różnicą absorbancji odczytać z krzywej wzorcowej odpowiednią wartość maltozy w μg. Krzywą wzorcową dla maltozy z alkalicznym roztworem heksascyjanożelazianu (III) potasu przygotowano stosując roztwór maltozy o stężeniach od 0 do 1600 µg na 1 ml. 3. Obliczyć aktywność amylaz z trzustki i wyrazić ją w mmolach uwolnionej maltozy w przeliczeniu na 1 gram trzustki i na 1 minutę [mmole uwolnionej maltozy x g -1 x min. -1 ] uwzględniając: a. schemat rozcieńczeń podany przez prowadzącego zajęcia, b. czas trwania enzymatycznej hydrolizy substratu. Przykładowe obliczenia. 1 2 Średnia absorbancja prób pełnych - P próby materiałowej - M Różnica absorbancji próby materiałowej i średniej absorbancji prób pełnych 1,078 1,122 1,100 1,374 0,274 Od absorbancji dla próby materiałowej (M) odejmujemy średnią absorbancję dla prób pełnych (P): 1,374 1,100 = 0,274 Z różnicy tak obliczonych absorbancji: M P = 0,274 możemy wnioskować o aktywności amylolitycznej użytego do doświadczenia ekstraktu z trzustki. Dla obliczonej różnicy odczytujemy z krzywej wzorcowej, w której użyto wzorcowych roztworów maltozy, stężenie maltozy - dla różnicy absorbancji 0,274 odpowiadało to 350 µg maltozy/1 ml. Co oznacza, że w 0,5 ml mieszaniny reakcyjnej znajdowało się 175 µg maltozy. 0,2 ml enzymu uwalnia zatem 175 μg maltozy Enzym w 10 ml, (w kolbce) uwolniłby 8750 µg maltozy, czyli 8,75 mg maltozy Do kolbki, przed dopełnieniem jej roztworem NaCl do objętości 10 ml wlano np. 1 ml wyciągu z trzustki (wartość tą poda prowadzący ćwiczenie, po zanotowaniu różnicy absorbancji próby materiałowej i średniej absorbancji dla prób pełnych). 1 ml wyciągu z trzustki umożliwiłoby uwolnienie 8,75 mg maltozy, zatem 1000 ml enzymu: 17,5 mg maltozy x 1000= 8750 mg maltozy, czyli 8,75 g maltozy, masa cząsteczkowa maltozy wynosi 342, stąd aktywność enzymów amylolitycznych wyrażona w μmolach uwolnionej maltozy na 1 gram trzustki i na 1 minutę w tym wypadku wynosi: 8,75 g maltozy/ 342 g/mol= 0,0256 mola maltozy = 25,6 mmola 25,6/ 15 min = 1,71 mmola maltozy x 1 min -1 1,71/ 1 gram = 1,71 mmola maltozy x 1 min -1 x g -1 Aktywność końcowa preparatu: 1,71 mmola uwolnionej maltozy x 1 min -1 x 1 g -1 trzustki. Inne metody wykorzystujące przyrost redukcyjności w mieszaninie reakcyjnej. A-2. Metoda Bernfelda. W metodzie Bernfelda (1958), zmodyfikowanej przez Jamiesona i współpracowników (1968) wykorzystuje się właściwości redukujące maltozy i innych cukrów, które w środowisku zasadowym redukują grupę nitrową soli sodowej kwasu 4

5 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) w pozycji 3 do grupy aminowej (Rys. 2.). Powstałe pochodne aminowe mają barwę pomarańczową, silnie absorbują świtało przy długości fali w zakresie od nm. Intensywność powstałej barwy zależy od ilości w próbie cukrów redukujących uwalnianych podczas działania enzymów, dlatego reakcja ta może stanowić podstawę do ich oznaczenia fotometrycznego. Rys. 2. Wzory kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) oraz kwasu 3-amino-5- nitrosalicylowego. A-3. Metoda Somogyi i Nelsona. W tej metodzie (Somogyi, 1952) podobnie jak w poprzednio opisanych metodach, wykorzystuje się właściwości redukujące sacharydów (głównie mono- i disacharydów), które w środowisku zasadowym redukują jony miedzi (II) do jonów miedzi (I) w obecności winianu sodowopotasowego (odczynnik Somogyi) z wytworzeniem tlenku miedzi CuO w postaci ceglastego osadu. Po dodaniu kwasu arsenomolibdenowego (odczynnik Nelsona) do utworzonego tlenku miedzi zachodzi redukcja tego kwasu do odpowiedniego barwnika o kolorze błękitnym, intensywność otrzymanej barwy można mierzyć w zakresie długości fali od nm i jest ona proporcjonalna do ilości utworzonych cukrów redukujących w czasie działania enzymów amylolitycznych. Metoda Somogyi i Nelsona stosowana jest najczęściej do oznaczania aktywności egzoamylaz. B. Metoda wykorzystująca zdolność skrobi do tworzenia kompleksu z jodem. Cząsteczki skrobi zależnie od ilości zawartej w nich amylozy i amylopektyny adsorbują jod na swojej powierzchni, dając zabarwienie niebieskie lub niebieskofioletowe (Rys. 3). Natomiast produkty częściowej degradacji skrobi zależnie od wielkości ich cząsteczek dają zabarwienie fioletowe (dekstryny wysokocząsteczkowe), czerwone i czerwonobrunatne (dekstryny o średniej masie cząsteczkowej). Z kolei dekstryny niskocząsteczkowe nie dają zabarwienia z jodem. Rys. 3. Tworzenie się kompleksu amylozy z jodem. 5

6 Metoda Sandstedta, Kneena i Blisha (SKB, 1939) oznaczania aktywności amylaz polega na pomiarze ilości rozłożonej skrobi, na podstawie zmiany intensywności zabarwienia w mieszaninie reakcyjnej z jodem po określonym czasie działania enzymu w optymalnym ph i temperaturze. Stosowana w ćwiczeniu jako substrat skrobia ziemniaczana barwi się z jodem na niebiesko (ze względu na znaczną ok. 20% zawartość amylozy). Po przerwaniu reakcji enzymatycznej i wprowadzeniu jodu w próbie materiałowej (bez enzymu) oznacza się pochłanianie barwnego kompleksu powstałego z całą ilością skrobi wprowadzonej do reakcji, natomiast w próbie z udziałem enzymu oznacza się absorbancję kompleksu skrobi nie rozłożonej i dekstryn. Ilość rozłożonej skrobi znajduje się z różnicy pomiarów tych dwóch prób. Odczynniki. 1. Wyciąg enzymu z trzustki wieprzowej. 2. 0,9% (w/o) NaCl. 3. 1% (w/o) skrobia w 0,05 M buforze Tris-HCl o ph 7, ,5M HCl. 6. 0,006% roztwór jodu w jodku potasu. Wykonanie. Otrzymany w kolbie miarowej na 10 ml wyciąg enzymów (1) amylolitycznych trzustki uzupełnić do kreski 0,9% NaCl (2) i wymieszać. Do 3 enzymatycznie czystych probówek pobrać po 1 ml 1% zbuforowanej skrobi (3), wstawić na 5 minut do łaźni wodnej o temperaturze 37 C, następnie do dwu z nich dodać po 1 ml roztworu enzymu z kolby na 10 ml (próby pełne - P), a do trzeciej 1 ml wody destylowanej (próba odczynnikowa - O). Po dokładnym wymieszaniu próby inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 C. Reakcję enzymatyczną przerwać w łaźni dodając 5 ml 0,5M HCl (5). Następnie przygotować 3 czyste probówki z 5ml roztworu jodu w jodku potasu (6) i dodać do nich po 0,25 ml z poszczególnych mieszanin reakcyjnych (z 2 prób P oraz 1 O). Po dokładnym wymieszaniu dokonać odczytu dla prób pełnych i próby odczynnikowej przy długości fali 670 nm w fotometrze nastawionym na zero wobec wody destylowanej. Opracowanie wyników. 1. Obliczyć różnicę pomiędzy wartością absorbacji dla próby odczynnikowej, a średnią wartością absorbacji z równoległych prób pełnych i podać ją prowadzącemu ćwiczenia. próby odczynnikowej odpowiada tej ilości skrobi, która została wprowadzona do reakcji (1 ml 1% roztworu skrobi = 10 mg skrobi). próby pełnej jest miarą ilości skrobi pozostałej po hydrolizie enzymami amylolitycznymi. Z różnicy między absorbancją próby odczynnikowej i pełnej wnioskujemy o ilości rozłożonej skrobi przez amylazy. 2. Obliczyć aktywność enzymów amylolitycznych w g rozłożonej skrobi w czasie 1 minuty w przeliczeniu na enzym wyekstrahowany z 1 grama trzustki [g rozłożonej skrobi x g -1 trzustki x min -1 ] uwzględniając: a. schemat rozcieńczeń podany przez prowadzącego zajęcia, b. czas trwania enzymatycznej hydrolizy substratu. 6

7 Przykładowe obliczenia. 1 2 Średnia absorbancja próby odczynnikowej Różnica absorbancji próby odczynnikowej i średniej absorbancji prób pełnych 0,416 0,424 0,420 0,746 0,326 Różnica absorbancji 0,326 Abs 670 dla próby odczynnikowej wynosiła 0,746 co odpowiadało 10 mg skrobi wprowadzonym do środowiska reakcji, Spadek Abs 670 średnio o 0,326 w próbach pełnych oznacza rozłożenie 4,37 mg skrobi przez 1 ml roztworu enzymu. Przeliczając ilość rozłożonej skrobi przez objętość enzymu w kolbce otrzymujemy odpowiednio 43,70 mg, Do kolbki, przed dopełnieniem jej 0,9% NaCl do objętości 10 ml wlano np. 1 ml wyciągu z trzustki (wartość tą poda prowadzący ćwiczenie, po zanotowaniu różnicy absorbancji dla próby odczynnikowej i średniej absorbancji prób pełnych). 1 ml wyciągu z trzustki umożliwiłaby rozłożenie 43,70 mg skrobi, zatem 1000 ml: 43,70 x 1000 = mg skrobi, czyli 43,7 g skrobi, zatem aktywność enzymów amylolitycznych wyrażona w gramach rozłożonej skrobi na 1 gram trzustki i na 1 minutę w tym wypadku wynosi: 43,7 g skrobi/ 15 min = 2,91 g skrobi x 1 min -1 2,91 g skrobi/ 1 gram trzustki = 2,91 g skrobi x 1 min -1 g -1 trzustki Aktywność końcowa preparatu: 2,91 g rozłożonej skrobi x 1 min -1 x 1 g -1 trzustki. Pytania. 1. Do jakiej klasy enzymatycznej należą amylazy? Jakie reakcje katalizują? 2. Narysować schemat łańcucha amylopektyny i wskazać na nim miejsca działania poszczególnych amylaz. 3. Na czym polega różnica w sposobie działania na skrobię pomiędzy α-, β-amylazą i glukoamylazą? Które enzymy określa się jako endoamylazy, a które jako egzoamylazy? 4. Na czym polegają metody oznaczania aktywności amylaz? 5. Wymienić typy organizmów, w których występują α-, β- i glukoamylazy. Jakie funkcje pełnią w nich te enzymy? 6. Uzasadnić celowość wykonywania prób materiałowych w metodzie wykorzystującej przyrost redukcyjności w mieszaninie reakcyjnej. Czy odczyty absorbancji będą w nich większe czy mniejsze niż w próbach pełnych (z działającymi enzymami amylolitycznymi), uzasadnij odpowiedź. 7. Podaj nazwę i napisz wzór produktu reakcji cukrów redukujących z DNS (kwasem 3,5-dinitrosalicylowym). W jakiej metodzie wykorzystywany jest DNS? Aktywności których amylaz (egzo-, czy endoamylaz) częściej oznaczane są z wykorzystaniem DNS, odpowiedź uzasadnij. 8. Wyjaśnić, na czym polega zasada metody SKB oznaczania aktywności enzymów amylolitycznych? 9. Wyjaśnić, na czym polega zasada metody z wykorzystaniem alkalicznego roztworu heksascyjanożelazianu (III) potasu do oznaczania aktywności enzymów amylolitycznych? 7

8 Literatura. 1. Bernfeld, P. (1955) Amylases, alpha and beta. Methods in enzymology I: , 2. Jamieson A. D., Pruitt K. M. Caldwell R. C. (1969) An Improved Amylase Assay J Dent Res; 48; Kidder, D. E., Hill F.W.G., Stevens J. A. (1972) Automatic measurement of some mucosal carbohydrases. Clin. Chim. Acta 37: Robyt, J. F., Ackerman R. J., Keng J. G. (1972) Reducing value methods for maltodextrins: II. Automated methods and chainlength independence of alkaline ferricyanide. Anal.Biochem. 45: Sanstedt, R. M., Kneen, E., Blish, M. J. (1939) A standardized Wohlgemuth procedure for alpha-amylase activity. Cereal Chem., 16, Somogyi, M., (1952) Determination of reducing sugars by Nelson-Somogyi method. J. Biol. Chem., 200: