RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (21) Numer zgłoszenia: 319843 (22) Data zgłoszenia: 07.05.1997 (19) PL (11) 183469 (13) B1 (51) IntCl7 C07H 3/06 C07H 5/10 A61K 31/702 (54) Pochodne węglowodanów i kompozycja farmaceutyczna zawierająca takie pochodne (30) Pierwszeństwo: 08.05.1996,EP.96201267.0 (73) Uprawniony z patentu: AKZO NOBEL N.V Arnhem, NL SANOFI-SYNTHELABO, Paryż, FR (43) Zgłoszenie ogłoszono: 10.11.1997 BUP 23/97 (72) Twórcy wynalazku: Constant A.A van Boeckel, Oss, NL Pieter Westerduin, Oss, NL (4 5 0 O udzieleniu patentu ogłoszono: 28.06.2002 WUP 06/02 (74) Pełnomocnik: Kossowska Janina, PATPOL Spółka z 0.0. PL 183469 B1 (57) 1. Pochodna węglowodanu przedstawiona wzorem I, w którym R 1oznacza H lub CH2OSO3-; R2 i R3 niezależnie oznaczają H, ( 1-6C)alkil lub SO3-; R4 oznacza OSO3-' lub NHSO3-; n oznacza 0 lub 1; p oznacza 1 lub 2; lub jej farmaceutycznie dopuszczalne sole. WZÓR I
Pochodne węglowodanów i kompozycja farmaceutyczna zawierająca takie pochodne Zastrzeżenia patentowe 1. Pochodna węglowodanu przedstawiona wzorem I, w którym R1oznacza H lub CH2OSO3-; R2 i R3 niezależnie oznaczają H, ( 1-6C)alkil lub SO3-; R4 oznacza OSO3- lub NHSO3-; n oznacza 0 lub 1; p oznacza 1 lub 2; lub jej farmaceutycznie dopuszczalne sole. 2. Pochodna węglowodanu według zastrz. 1, w której R2 oznacza ( 1-6C)alkil, R3 oznacza SO3-, R4 oznacza OSO3-, a R1, n i p mają uprzednio określone znaczenia. 3. Pochodna węglowodanu według zastrz. 2, w której R2 oznacza metyl. 4. Pochodna węglowodanu według zastrz. 2 albo 3, w której n oznacza 1 i p oznacza 1. 5. Pochodna węglowodanu według zastrz. 2 albo 3, w której R 1oznacza CH2OSO3-. 6. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera pochodną węglowodanu według zastrz. 1 oraz farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze. 7. Pochodna węglowodanu według zastrz. 1 do zastosowania w leczeniu. 8. Zastosowanie pochodnej węglowodanu według zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania zakrzepicy lub do zahamowania proliferacji komórek mięśnia gładkiego. * * * Przedmiotem wynalazku jest pochodna węglowodanu wykazująca aktywność przeciwzakrzepową, kompozycja farmaceutyczna zawierająca taką pochodną, a także zastosowanie tej pochodnej węglowodanu do wytwarzania leku. Znane są pochodne węglowodanów o aktywności przeciwzakrzepowej, na przykład w EP 84,999 ujawniono siarczanowe pochodne glikozaminoglikanów. W EP 529,715 ujawniono inne siarczanowe pochodne węglowodanów pokrewnych glikozaminoglikanów o ulepszonych własnościach farmakologicznych. Pochodne te są pozbawione charakterystycznych grup funkcyjnych glikozaminoglikanów, które stanowią wolne grupy hydroksylowe, N- siarczanowe i N-acetylowe. Stwierdzono obecnie, że pochodne węglowodanów według wynalazku, o wzorze I, w którym R 1oznacza H lub CH2OSO3-; R2 i R3 niezależnie oznaczają H, ( 1-6C)alkil lub SO3-; R4 oznacza OSO3- lub NHSO3-; n oznacza 0 lub 1; p oznacza 1 lub 2; lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, wykazują aktywność przeciw Xa, która jest zasadniczo większa niż aktywność sacharydów nie zawierających grup typu gliceryny lub glikolu w położeniu 4 nieredukującego końca. Czynnik Xa odgrywa ważną rolę w kaskadzie krzepnięcia krwi. Katalizuje on wytwarzanie się trombiny, która reguluje ostatni etap w kaskadzie krzepnięcia. Główną funkcją trombiny jest rozszczepianie fibrynogenu z wytworzeniem monomerów fibryny, które poprzez sieciowanie tworzą nierozpuszczalny żel, skrzepy fibryny. Związki według wynalazku są użyteczne w leczeniu i zapobieganiu chorobom wywołanym przez trombinę i związanym z trombiną. Choroby te obejmują różne stany zakrzepowe i prozakrzepowe, w których aktywuje się proces krzepnięcia, i do których należą, ale nie wyłącznie, zakrzepica żyły głębokiej, zatorowość płucna, zakrzepowe zapalenie żył, zator tętnicy
183 469 3 w wyniku zakrzepicy lub zatorowości, reokluzja tętnicy podczas lub po angioplatyce lub trombolizie, restenoza w następstwie uszkodzenia tętnic lub inwazyjnych zabiegów kardiologicznych, pooperacyjna zakrzepica lub zatorowość żył, ostra i przewlekła miażdżyca naczyń, udar, zawał mięśnia sercowego, rak i przerzuty oraz choroby neurodegeneracyjne. Pochodne węglowodanów według wynalazku mogą również być stosowane jako inhibitory proliferacji komórek mięśni gładkich oraz w leczeniu angiogenezy, raka i zakażeń retrowirusami, takimi jak HIV. Ponadto związki według wynalazku można stosować jako antykoagulanty i powłoki antykoagulacyjne w krwiobiegach pozaustrojowych, co konieczne jest w dializie i w chirurgii. Związki według wynalazku mogą być również stosowane jako antykoagulanty in vitro lub ex vivo. Korzystne pochodne węglowodanów według wynalazku przedstawione są wzorem I, w którym R2 oznacza ( 1-6C)alkil, R3 oznacza SO3-, R4 oznacza OSO3-, a R1, n i p mają uprzednio określone znaczenia; lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. Bardziej korzystne są pochodne węglowodanów o wzorze I, w którym R1 oznacza metyl. Szczególnie korzystnymi pochodnymi węglowodanów są pochodne o wzorze I, w którym n oznacza 1 i p oznacza 1. Najbardziej korzystne są pochodne węglowodanów o wzorze I, w którym R1oznacza CH2OSO3-. Określenie "(1-6C)alkil" oznacza rozgałęzioną lub nierozgałęzioną grupę alkilową zawierającą 1 do 6 atomów węgla, taką jak metyl, etyl, izopropyl, t-butyl, izopentyl, heksyl itp. Korzystnymi grupami alkilowymi są grupy (1-4C)alkilowe, takie jak metyl, etyl, izopropyl, n-butyl i t-butyl. Najbardziej korzystną grupą alkilową jest metyl. Przeciwjonami, które równoważą naładowane reszty są dopuszczalne farmaceutycznie przeciwjony, takie jak wodór, lub bardziej korzystnie jony metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, takich jak sód, wapń lub magnez. Pochodne węglowodanów według wynalazku wytwarza się przez sprzęganie ochronionej reszty gliceryny lub glikolu z grupą 4-hydroksylową nieredukującego końca następnego chronionego tetrasacharydu, co przeprowadzić można sposobem opisanym przez P. Westerduin, Bioorg. and Med. Chem., 2, 1267-1280, 1994. Następnie grupy ochronne usuwa się, po czym związek poddaje się siarczanowaniu, z wytworzeniem pochodnej węglowodanowej o wzorze I. W leczeniu zakrzepicy żył lub zahamowaniu proliferacji komórek mięśni gładkich związki według wynalazku podaje się dojelitowo lub pozajelitowo, a korzystna dawka dzienna dla ludzi wynosi 0,001-10 mg na kg wagi ciała. Związki podawane doustnie, dopoliczkowo lub podjęzykowo miesza się z odpowiednimi farmaceutycznymi substancjami pomocniczymi, np. jak opisane w standardowej literaturze, Gennaro i in., Remmington's Pharmaceutical Sciences (wyd. 18, Mack Publishing Company, 1990, patrz zwłaszcza Część 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufactures), i można je sprasować na stałe formy użytkowe, takie jak pigułki, tabletki, lub przeprowadzić w postać kapsułek albo czopków. Stosując dopuszczalne farmaceutycznie ciecze, związki można również aplikować jako preparaty do wstrzyknięć w postaci roztworów, zawiesin, emulsji, lub w postaci sprayu, np. do nosa. Przy wytwarzaniu postaci użytkowych, np. tabletek, stosuje się konwencjonalne dodatki, takie jak wypełniacze, barwniki, polimerowe środki wiążące, itp. Ogólnie rzecz biorąc, stosować można dowolne farmaceutycznie dopuszczalne dodatki, które nie zakłócają działania związków aktywnych. Odpowiednie nośniki, które można podawać w odpowiednich ilościach w kompozycjach według wynalazku, obejmują laktozę, skrobię, pochodne celulozy itp., lub mieszaniny powyższych substancji. Wynalazek zilustrowano następującymi przykładami. W przykładach znajdują się odniesienia do załączonego schematu. Związki pośrednie oraz produkty końcowe określono za pomocą odpowiednich numerów na załączonych arkuszach rysunków.
4 183 469 Przykład I Wytwarzanie związku 7 i 8 Wytwarzanie związku 2 Do oziębionego (0 C) roztworu 2-benzyloksyetanolu 1 (2,84 ml) i sulfidu chlorometylowo-metylowego (1,59 ml) w eterze dimetylowym glikolu etylenowego (25 ml) w atmosferze azotu dodano 60% dyspersji wodorku sodu (1,2 g) w oleju mineralnym i mieszaninę mieszano przez 20 godzin w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny reakcyjnej dodano metanolu i mieszano jeszcze przez 15 minut. Mieszaninę rozcieńczono octanem etylu (100 ml), przemyto kolejno wodnym roztworem wodorowęglanu sodu i wodą. Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem magnezu i zatężono pod próżnią. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym i otrzymano 2,5 g związku 2. Wytwarzanie związku 3 Syntezę związku 3 opisano w Bioorganic and Medicinal Chemistry, vol. 2, nr 11, strony 1267-1280,1994 (P. Westerduin i in.). Wytwarzanie związku 4 Mieszaninę związków 3 (125 mg), 2 (64 mg) i sproszkowanych sit molekularnych (4 A) w dichlorometanie (1,5 ml) mieszano w atmosferze azotu przez 15 minut. Roztwór oziębiono (5 C) i wprowadzono świeżo wytworzony roztwór zawierający N-jodosukcynimid (68 mg) i kwas trifiuorometanosulfonowy (2,7 μl) w 1,5 ml mieszaniny 1,2-dichlorometanu i dioksanu (1/1, obj./obj.). Po 10 minut zabarwioną na czerwono mieszaninę reakcyjną przesączono, rozcieńczono dichlorometanem, przemyto kolejno wodnym roztworem tiosiarczanu sodu i wodnym roztworem wodorowęglanu sodu. Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem magnezu i zatężono pod próżnią. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii ekskluzyjnej na kolumnie z Sephadexem LH-20 zawieszonym w mieszaninie dichlorometan-metanol (2/1, obj./obj.) i otrzymano 108 mg związku 4. Wytwarzanie związku 5 Do oziębionego (-5 C) roztworu związku 4 (105 mg) w tetrahydrofuranie (7,3 ml) dodano 30% wodnego roztworu nadtlenku wodoru (3,8 ml) i po 10 minutach mieszania dodano roztworu wodorotlenku litu (1,25 M, 1,7 ml). Mieszaninę mieszano przez 2 godziny w temperaturze - 5 C, a następnie temperaturę podniesiono do 0 C. Po 20 godzinach mieszania temperaturę podniesiono do 20 C i mieszano dalej przez 24 godziny. Mieszaninę reakcyjną oziębiono (0 C), i kolejno dodano metanolu (7,0 ml) i wodnego roztworu wodorotlenku sodu (4M, 2,0 ml). Po mieszaniu przez 1 godzinę, temperaturę ponownie podniesiono do 20 C i mieszano jeszcze przez 20 godzin. Mieszaninę oziębiono (0 C), zakwaszono do ph = 3 kwasem solnym (2N) i ekstrahowano dichlorometanem. Warstwę organiczną przemyto wodnym roztworem siarczynu sodu (5%), wysuszono nad siarczanem magnezu i zatężono pod próżnią. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym i otrzymano 80 mg związku 5. Wytwarzanie związku 6 Do roztworu związku 5 (80 mg) w mieszaninie wody (7 ml) i 2-metylo-2-propanolu (7 ml) dodano 80 mg palladu na węglu drzewnym (10%). Mieszaninę reakcyjną pozostawiono w atmosferze wodoru na 16 godzin. Katalizator usunięto przez odsączenie i przepłukano mieszaniną 2-metylo-2-propanolu i wody. Przesącz i przemywki zatężono pod próżnią i liofilizowano, uzyskując 38 mg związku 6. Wytwarzanie związków 7 i 8 Roztwór związku 6 (38 mg) w wodzie (0,8 ml) eluowano wodą z kolumny Dowex 50WX8H+ i zebrane frakcje odparowano do suchości. Po odparowaniu z N,Ndimetyloformamidem pozostałość rozpuszczono w N,N-dimetyloformamidzie (2,5 ml), umieszczono w atmosferze azotu i dodano kompleksu tritlenek siarki - trietyloamina (287 mg). Mieszaninę mieszano przez noc w temperaturze 50 C, oziębiono do 0 C i dodano wodnego roztworu wodorowęglanu sodu (533 mg). Mieszaninę mieszano przez 1godzinę w temperaturze 20 C, zatężono do niewielkiej objętości i odsolono na kolumnie z Sephadexem G-25 zawieszonym w wodzie i acetonitrylu, 9:1 (obj./obj.). Surowy produkt eluowano na kolumnie Dowex 50WX8H+ i oczyszczono metodą anionowymiennej chromatografii kolumnowej (HPLC, Mono-Q, gradient chlorku
183 469 5 sodu). Otrzymano 12 mg związku 7. {[α]20d= +31,1 (c - 1; wodą)} i 18 mg związku 8 {[α]2d= 34,8 (c = 0,93; woda). Przykład II Wytwarzanie związku 16 Wytwarzanie związku 10 Do oziębionej (-20 C) mieszaniny gliceryny (10 g) i pirydyny (109 ml) w ciągu 1 godziny wkroplono roztwór chlorku benzoilu (26,3 ml) w suchym dioksanie. Wytworzoną mieszaninę mieszano przez 16 godzin w temperaturze 0 C, a następnie dodano wody. Po 15 minutach mieszania mieszaninę zatężono do 1/5 objętości, rozcieńczono dichlorometanem i przemyto wodą, wodnym roztworem wodorowęglanu sodu i wodą. Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem magnezu i zatężono pod próżnią. Uzyskany olej oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym i otrzymano 21 g związku 10. Wytwarzanie związku 11 Do roztworu związku 10 (600 mg) w mieszaninie acetonitrylidichlorometan (1:1, obj./obj., 8 ml) dodano sulfidu metylowego (1/45 ml). Mieszaninę reakcyjną oziębiono do 0 C i wkroplono mieszaninę suchego nadtlenku benzoilu (3,63 g) w acetonitrylu i dichlorometanie (1:1, obj./obj., 10 ml). Mieszaninę mieszano przez 16 godzin w temperaturze 20 C, po czym rozcieńczono dichlorometanem i przemyto wodnym roztworem wodorowęglanu sodu i wodą. Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem magnezu i zatężono pod próżnią. Po oczyszczeniu metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym wyodrębniono 400 mg związku 11. Wytwarzanie związku 12 Związek 12 wytworzono sposobem analogicznym do opisanego przez P. Westerduin'a i in., Bioorganic and Medicinal Chemistry 1994, vol. 2, nr 11, strony 1267-1280. W reakcji wytwarzania związku 12 kwasy uronowe chroniono grupami benzylowymi zamiast grupami metylowymi. Wytwarzanie związku 13 Związek 13 wytworzono w sposób podobny do opisanego dla związku 4 przez sprzęganie związku 11 i 12. Wytwarzanie związku 14 Do roztworu związku 13 (480 mg) w 2-metylo-2-propanolu (60 ml) dodano zawiesinę wodorowęglanu sodu (142 mg) w wodzie (2 ml) i Pd/C (400 mg). Mieszaninę pozostawiono w atmosferze azotu na 16 godzin. Katalizator usunięto przez odsączenie i przemyto mieszaniną 2- metylo-2-propanolu i wody. Połączony przesącz i przemywki zatężono pod próżnią i otrzymano 315 mg związku 14, który stosowano bez dalszego oczyszczania. Wytwarzanie związku 15 Związek 14 (315 mg) rozpuszczono w 0,35N wodnego roztworu wodorotlenku sodu (10 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc, po czym ph doprowadzono do wartości 8,5 dodatkiem IN kwasu solnego. Mieszaninę odsolono na kolumnie z Sephadexem G-25 zawieszonym w mieszaninie woda:acetonitryl:trietyloamina, 90:10:0,1 (obj./obj./obj.). Zebrano odpowiednie frakcje i zatężono pod próżnią. Produkt ponownie poddano hydrogenolizie, w sposób podobny do opisanego dla związku 14. Po obróbce i zatężeniu przesączu i przemywek, mieszaninę odsolono na kolumnie z Sephadexem G-25 zawieszonym w mieszaninie woda:acetonitryl:trietyloamina, 90:10:0,1 (obj./obj./obj.). Odpowiednie frakcje zebrano, zatężono pod próżnią i eluowano wodą na kolumnie Dowex 50WX8H+, a na koniec liofilizowano, uzyskując 165 mg związku 15. Wytwarzanie związku 16 Roztwór związku 15 (165 mg) odparowano z N,N-dimetyloformamidem i rozpuszczono w N,N-dimetyloformamidzie (11,0 ml). Do mieszaniny reakcyjnej dodano kompleksu trietyloamina - tritlenek siarki (1,31 g). Mieszaninę mieszano przez 16 godzin w temperaturze 50 C, po czym oziębiono (0 C), dodano wodnego roztworu wodorowęglanu sodu (2,43 g) i mieszano przez 1 godzinę w 20 C, po czym roztwór zatężono pod próżnią. Pozostałość odsolono na kolumnie z Sephadexem G-25 zawieszonym w mieszaninie woda:acetonitryl, 9:1 (obj./obj.). Zebrano odpowiednie frakcje i zatężono pod próżnią. Po eluowaniu na kolumnie Dowex 50WX8H+ produkt oczyszczono na kolumnie Q-Sepharose High Load, stosując gradient chlorku sodu, i otrzymano 160 mg związku 16. {[α]20d= +24,0 (c = 0,77, H20)}.
183 469 WZÓR I
183 469
183 469 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.