Elektroforetyczna identyfikacja enzymów amylolitycznych i fosforolitycznych w tkankach roślinnych. Cel ćwiczenia Ćwiczenie poświęcone jest poznaniu metody rozdzielania enzymów amylolitycznych i fosforolitycznych w żelu poliakrylamidowym oraz badania aktywności tych enzymów w warunkach natywnych na zymogramach. Wprowadzenie W celu zbadania aktywności enzymów amylolitycznych i fosforolitycznych należy po elektroforezie w warunkach natywnych przeprowadzić reakcję enzymatyczną w żelu, po której można wybarwić żele pod kątem aktywności interesującego nas enzymu czyli otrzymać zymogram. Żel stosowany do badania aktywności amylolitycznej zawiera skrobię, a stosowany do badania aktywności fosforolitycznej - glikogen. W miejscu zatrzymania się enzymu amylolitycznego powstanie jasny prążek, a tło pozostanie ciemne (barwienie negatywowe), natomiast w miejscu zatrzymania się fosforylazy pojawi się ciemny prążek na jasnym tle (barwienie pozytywowe). Wykorzystywane na ćwiczeniach substraty - skrobia oraz glikogen są polisacharydami zbudowanymi z reszt sześciowęglowego, redukującego cukru α-d-glukozy. Cząsteczki glukozy połączone są wiązaniami α-1,4- i α-1,6-glikozydowymi. Wskutek reakcji polimeryzacji glukozy, w cząsteczce skrobi dochodzi do wytworzenia jej dwóch frakcji amylozy i amylopektyny (Rys 1). Amyloza zbudowana jest z nierozgałęzionych łańcuchów połączonych wiązaniami α-1,4-glikozydowymi, podczas gdy cząsteczki amylopektyny są rozgałęzione, a rozgałęzienia w łańcuchach utworzone przez wiązania α-1,6-glikozydowe występują dość regularnie co 25-30 reszt glukozy. Skrobia jest typowym materiałem zapasowym roślin. Natomiast w glikogenie magazynowanym w mięśniach i w wątrobie zwierząt nie obserwuje się 2 frakcji różniących się stopniem polimeryzacji (Rys 1). Rozgałęzienia w łańcuchach glikogenu utworzone są również przez wiązania α-1,6- glikozydowe, ale występują one częściej niż w amylopektynie, bo co 10-12 reszt glukozy. Częstość występowania wiązań α-1,6-glikozydowych stanowi np. o rozpuszczalności skrobi i glikogenu skrobia po wyizolowaniu z roślin jest praktycznie nierozpuszczalna w wodzie w niskich temperaturach, glikogen zaś dość dobrze rozpuszcza się w wodzie. Rys. 1. wzory amylopektyny, amylozy i glikogenu. 1
Cząsteczki skrobi zależnie od ilości zawartej w nich amylozy i amylopektyny adsorbują jod na swojej powierzchni, co daje zabarwienie niebieskie lub niebieskofioletowe. Sama amyloza lub produkty częściowej degradacji skrobi, zależnie od wielkości ich cząsteczek, dają zabarwienie fioletowe (dekstryny wysokocząsteczkowe), czerwone i czerwonobrunatne (dekstryny o średniej masie cząsteczkowej). Dekstryny niskocząsteczkowe nie tworzą kompleksu z jodem. Natomiast glikogen w niskich stężeniach barwi się z jodem na kolor żółto-pomarańczowy. Skrobia i glikogen są rozkładane przez enzymy amylolityczne. Są to jedne z najwcześniej poznanych enzymów zaliczanych do klasy hydrolaz. Enzymy amylolityczne występują z racji pełnionych funkcji we wszystkich organizmach żywych. Oprócz skrobi i glikogenu hydrolizują pokrewne im oligo- i polisacharydy. Najważniejsze enzymy amylolityczne to: α-amylaza (EC 3.2.1.1), β-amylaza (EC 3.2.1.2) oraz glukoamylaza (EC 3.2.1.3). Szczególnie wysoką aktywność enzymów amylolitycznych stwierdzono w kiełkujących ziarniakach zbóż (słód pszenny lub jęczmienny) oraz w bulwie ziemniaka w fazie kiełkowania. Amylazy różnego pochodzenia wykazują optimum aktywności w zakresie ph 4,5-7,0, chociaż znane są enzymy, dla których wartość ta wynosi około 10,0. Optymalna temperatura działania amylaz mieści się w granicach 30-50 C, a tylko dla niektórych enzymów bakteryjnych (Bacillus licheniformis) jest bardzo wysoka (około 100 C). Amylazy katalizują hydrolizę głównie wiązań α-1,4-glikozydowych w cząsteczkach substratu (Rys 2), w wyniku czego zanika kompleks, jaki tworzy z jodem substrat przed hydrolizą. Zjawisko to zostanie wykorzystane do lokalizacji pasm aktywności amylaz na zymogramie. Rys. 2. Działanie amylaz na amylopektynę: α-amylaza hydrolizuje wiązania glikozydowe wewnątrz cząsteczki polisacharydu, β-amylaza uwalnia β-maltozę, a glukoamylaza β-dglukozę od nieredukującego końca cząsteczki. Zymografia służy nie tylko badaniu aktywności enzymów hydrolitycznych. Metodę tę stosuje się do identyfikacji innych enzymów pod warunkiem, że ubytek substratu lub przyrost produktu można uwidocznić w postaci wyróżniających się z tła prążków. Tak jest na przykład przy badaniu aktywności fosforylaz polisacharydów. Fosforylaza skrobiowa należy do klasy transferaz (EC 2.4.1.1), katalizuje odwracalną reakcję przeniesienia reszty glukozy z 2
nieredukującego końca oligo- lub polisacharydu na fosforan (Rys. 3). W wyniku tej reakcji powstaje o jedną resztę glukozy krótszy polisacharyd oraz glukozo-1-fosforan. Fosforylaza skrobiowa podobnie jak zwierzęca fosforylaza glikogenowa współdziała z fosforanem pirydoksalu (PLP) jako koenzymem. Fosforylazy różnego pochodzenia wykazują optimum aktywności w zakresie ph 6,5-8,0. Optymalna temperatura działania fosforylaz mieści się w granicach 30-50 C. Fosforylazy roślinne mogą wykorzystywać także glikogen jako substrat i katalizować reakcje zarówno fosforolizy jak i dodawania reszt glukozy do cząsteczki glikogenu. U roślin fosforylazy znajdują się w plastydach oraz w cytoplazmie. Te izoenzymy różnią się nie tylko lokalizacją w komórce, ale również powinowactwem do substratów. Izoenzym cytoplazmatyczny ma silne powinowactwo do skrobi i glikogenu, a izoenzym plastydowy chętniej wykorzystuje oligosacharydy niż skrobię. Rys 3. Reakcja katalizowana przez fosforylazę skrobiową z glikogenem jako substratem. W wyniku dodawania przez fosforylazę reszt glukozo-1-fosforanu do cząsteczek skrobi lub glikogenu powstają dłuższe polimery jednak nie rozgałęzione, ponieważ fosforylazy nie mają zdolności wytwarzania rozgałęzień w polisacharydzie. Takie wydłużone łańcuchy np. glikogenu wykazują ciemnoniebieską barwę z jodem, inną niż niezmodyfikowany substrat. Można to wykorzystać przy badaniu aktywność fosforylazy w żelu po elektroforezie. Jest to lepszy sposób wizualizacji aktywności fosforylazy na zymogramie, niż przy użyciu skrobi jako substratu, która z jodem tworzy niebieskofioletowy kompleks. Hydroliza skrobi i jej rozkład fosforolityczny nie przebiegają równocześnie w komórkach. Rozkład hydrolityczny ma największe znaczenie dla degradacji skrobi asymilacyjnej w chloroplastach, jak również podczas rozkładu skrobi zapasowej w trakcie kiełkowania nasion czy też bulw ziemniaka. Fosforoliza natomiast, przeważa w warunkach niekorzystnych dla wzrostu roślin, jakimi są zasolenie, chłód, susza. Odczynniki 1. Bufor ekstrakcyjny: 50 mm jabłczan ph 5,4, zawierający 2,5 mm CaCl 2 50 mm NaCl, i 0,005% azydek sodu. 2. Gotowy do użycia 40% w/o roztwór mieszaniny akryloamidu N,N-metyleno-bisakryloamidu w proporcji odpowiednio 37,5: 1 3. 0,5% roztwór skrobi (w/o) 4. 1% roztwór glikogenu (w/o) 5. 0,2 M bufor Tris-Gly ph 9,1 6. TEMED N,N,N,N -tertrametyloetylenodiamina 7. APS (nadsiarczan amonowy) - 10% roztwór w/o 8. Woda dejonizowana 9. Bufor rozwijający - 0,05 M bufor Tris-Gly ph 9,1 10. 0,05% błękit bromofenolowy w 0,05 M buforze Tris-Gly ph 9,1 11. Glicerol 3
12. 0,006% roztwór jodu w jodku potasu roztwór podstawowy do barwienia żeli na aktywność fosforylaz oraz 10-krotnie rozcieńczony jego roztwór do barwienia żeli na aktywność amylaz 13. 0,2 M bufor cytrynianowy o ph 6,5, zawierający 10 mm glukozo-1-fosforan. Wykonanie Przygotowanie aparatu i żelu Do wszystkich prac zaleca się stosowanie rękawiczek jednorazowych. Aparat do elektroforezy (np. wyprodukowany przez Firmę Bio-Rad) przygotować zgodnie z zaleceniami prowadzącego ćwiczenia, zwykle należy upewnić się czy mamy do dyspozycji wszystkie ruchome elementy aparatu oraz odtłuścić szybki przy pomocy stężonego etanolu lub acetonu. Kolejnym etapem jest złożenie szybek w statywie, aby powstały komory do wylania płytek z żelem poliakryloamidowym (PA) zawierającym substrat (skrobię enzymy amylolityczne lub glikogen - fosforylazy). Przygotowanie żelu rozdzielającego z substratem Enzymy amylolityczne (7% PA z 0,05% skrobią): do czystej probówki typu Falcon lub zlewki o objętości 25-50 ml odmierzyć następujące odczynniki (objętość całkowita wynosić będzie 9,0 ml): 1,6 ml 40% roztworu mieszaniny akryloamidu i bisakryloamidu, 2,25 ml 0,2M buforu Tris-Gly (ph 9,1), 0,9 ml 0,5% roztworu skrobi rozpuszczalnej, 4,65 ml wody dejonizowanej. Składniki te dobrze razem wymieszać, przygotować pipetę do nakładania żelu wyskalowaną na 3,2 ml z czystą końcówką. Następnie dodać 10 µl TEMEDu oraz 80µl 10% nadsiarczanu amonu (APS), wszystkie składniki szybko wymieszać i przenieść do komór formujących żel 2x po 3,2 ml. Na koniec, na wylane między szybkami żele nawarstwić 0,5 ml dejonizowanej wody w celu odcięcia dopływu powietrza i pozostawić bez ruchu na 45 minut, możliwie nie narażając polimeryzujących żeli na szybkie zmiany temperatur (np. otwarte okno). Enzymy fosforolityczne (7% PA z 0,1% glikogenem): do czystej probówki typu Falcon lub zlewki o objętości 25-50 ml odmierzyć następujące odczynniki (objętość całkowita wynosić będzie 9,0 ml): 1,6 ml 40% roztworu mieszaniny akryloamidu i bisakryloamidu, 2,25 ml 0,2M buforu Tris-Gly (ph 9,1), 0,9 ml 1% roztworu glikogenu, 4,65 ml wody dejonizowanej. Składniki te dobrze razem wymieszać, przygotować pipetę do nakładania żelu wyskalowaną na 3,2 ml z czysta końcówką. Następnie dodać 10 µl TEMED`u oraz 80µl 10% nadsiarczanu amonu (APS), wszystkie składniki szybko wymieszać i przenieść do komór formujących żel 2x po 3,2 ml. Na koniec, na wylane między szybkami żele nawarstwić 0,5 ml dejonizowanej wody w celu odcięcia dopływu powietrza i pozostawić bez ruchu, możliwie nie narażając polimeryzujących żeli na szybkie zmiany temperatur (np. otwarte okno), na 45 minut. Przygotowanie 4% żelu zagęszczającego (na dwie płytki) Po spolimeryzowaniu żelu rozdzielającego, zlać ostrożnie nawarstwioną wcześniej wodę do zlewu przechylając ostrożnie zablokowane w statywie komory do formowania żelu (wcześniej przechylić delikatnie żeby przekonać się, czy zaszła polimeryzacja). Do komór włożyć pod kątem ok. 30-45 stopni grzebienie, tak aby po wlaniu żelu można było łatwo wcisnąć je do komory czynność tą przećwiczyć na sucho. Następnie do czystej probówki typu Falcon lub zlewki o objętości 25-50 ml odmierzyć następujące odczynniki (objętość całkowita wynosić będzie 10,0 ml): 1,0 ml 40% roztworu mieszaniny akryloamidu i bisakryloamidu, 2,5 ml 0,2 M buforu Tris-Gly (ph 9,1), 6,39 ml wody dejonizowanej. 4
Składniki te dobrze razem wymieszać, przygotować pipetę wyskalowaną np. na 4,0 ml z czysta końcówką. Następnie dodać 10 µl TEMED`u oraz 100 µl 10% nadsiarczanu amonu. Wszystkie składniki szybko wymieszać i nanieść na żel rozdzielający poniżej 1-2 mm górnej krawędzi niższej płytki. Płynnie wcisnąć grzebień, począwszy od końca niżej zanurzonego w żelu, tak aby pod krawędziami grzebienia nie zebrały się pęcherzyki powietrza, nadmiar żelu powinien wypłynąć z komory. Tak przygotowane płytki pozostawić do polimeryzacji. Otrzymywanie ekstraktu z preparatów roślinnych lub mąki a. Rozetrzeć w moździerzu 0,75 g drobno pociętej bulwy ziemniaka, a następnie zawiesić w 3 ml buforu ekstrakcyjnego. Uzyskany homogenat przenieść do 2 probówek Eppendorfa (po 1,5 ml homogenatu), wirować przez 5 min przy 10 tys. obrotów/min w 4 C. Uzyskany po wirowaniu supernatant przenieść pipetą do czystej probówki Eppendorfa, opisać i pozostawić w łaźni z lodem lub w lodówce do czasu naniesienia na przygotowany żel. b. Ekstrakty z liści groszku zielonego lub kukurydzy przygotować analogicznie jak z bulwy ziemniaka. c. Odważyć 0,05 g wzorcowej mąki, naważkę przenieść do probówki typu Falcon dodać 10 ml buforu ekstrakcyjnego, wytrząsać przez 10 sekund, następnie pozostawić do sedymentacji. Czynność tą powtórzyć w ciągu 15 minut 5-krotnie. Część zawiesiny odwirować w 2 probówkach na 1,5 ml i postąpić dalej jak w pkt a. Rozdział elektroforetyczny ekstraktów Upewniwszy się że nastąpiła polimeryzacja żelu wyciągnąć grzebienie, na podstawie wskazówek prowadzącego ćwiczenia umieścić płytki z żelem w aparacie do elektroforezy (zaznaczyć która płytka zawiera skrobię, a która glikogen). Następnie przepłukać studzienki buforem rozwijającym i wlać bufor do odpowiedniego poziomu w komorze aparatu do elektroforezy. Przed naniesieniem na żel zmieszać uzyskany ekstrakt z glicerolem w proporcji 9:1 np. 450 µl ekstraktu i 50 µl glicerolu (otrzymując 10% o/o stężenie glicerolu), co ułatwi nanoszenie prób do studzienek, do jednej studzienki bez ekstraktu, dodać roztwór błękitu bromofenolowego o stężeniu 0,05%. Nanieść do studzienek różne ilości uzyskanych ekstraktów (wg wskazówek prowadzącego np. 5 i 40 µl). Aparat do elektroforezy wstawić do pojemnika z buforem rozwijającym i umieścić ostrożnie w pudełku styropianowym wypełnionym lodem lub wstawić do lodówki. Elektroforezę prowadzić przy stałym napięciu 150V do momentu całkowitego wyjścia barwnika z żelu. Wykrywanie aktywności enzymów amylolitycznych i fosforolitycznych Na podstawie wskazówek prowadzącego ćwiczenia wyjąć płytki z żelem, rozdzielić szybki, przy pomocy szerokiej łopatki odkleić żel od szybki i przenieść na szalkę Petriego. Nie oddzielać żelu zagęszczającego od żelu rozdzielającego. Żel zawierający glikogen (wykrywanie aktywności fosforylaz w kierunku syntezy polisacharydu) po przepłukaniu dwukrotnym wodą destylowaną umieścić w 50 ml 0,2 M buforu cytrynianowego o ph 6,5, zawierającego 10 mm glukozo-1-fosforan na 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie bufor zlać, żel przepłukać wodą destylowaną i przenieść do wcześniej przygotowanego roztworu jodu w jodku potasu. Żel barwić do momentu uzyskania kontrastu (ok. 10 sekund). Po tym czasie roztwór barwiący jodu w jodku potasu zlać. Tło powinno być lekko żółte, miejsca gdzie znajdują się fosforylazy 5
ciemnoniebieskie. Żel przepłukać wodą destylowaną i obejrzeć na transiluminatorze, sfotografować. Żel zawierający skrobię (wykrywanie aktywności amylolitycznej) po przepłukaniu dwukrotnym wodą destylowaną umieścić w 50 ml 0,2 M buforu octanowego o ph 4,5 na 30-45 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie bufor zlać, żel przepłukać wodą destylowaną i przenieść do wcześniej przygotowanego roztworu jodu w jodku potasu. Żel barwić do momentu uzyskania kontrastu (ok. 10 sekund). Tło powinno być ciemne, miejsca aktywności amylaz- bezbarwne. Po tym czasie roztwór barwiący jodu w jodku potasu zlać, żel przepłukać wodą destylowaną i obejrzeć na transiluminatorze, ewentualnie sfotografować. Opracowanie wyników Na podstawie analizy zymogramu porównać aktywności enzymatyczne badanych ekstraktów, wskazać liczbę izoform amylaz lub fosforylaz zidentyfikowanych na podstawie różnej mobilności w polu elektrycznym. Sprawdzić czy intensywność prążków obrazujących aktywność enzymów jest proporcjonalna do ilości naniesionych ekstraktów. Literatura. 1. Albrecht T., Greve B., Pusch K., Kossmann J., Buchner P., Wobus U., Steup M. (1998) Homodimers and heterodimers of Pho1-type phosphorylase isoforms in Solanum tuberosum L. as revealed by sequence-specific antibodies. Eur J Biochem. 251: 343-352. 2. Alpha-amylase assay procedure (Ceraplha Method) for measurement of plant and microbial alpha-amylases Megazyme International Ireland 2011 3. Brust H, Orzechowski S, Fettke J., Steup M. (2013) Starch synthesizing reactions and paths: in vitro and in vivo studies. J. Appl. Glycosci. 60: 3-20 4. Orzechowski S. (2008) Starch metabolism in leaves. Acta Biochm. Pol, 55: 435 445. 5. Weise S.E., Schrader S.M., Kleinbeck K.R., Sharkey T.D. (2006) Carbon balance and circadian regulation of hydrolytic and phosphorolytic breakdown of transitory starch. Plant Physiol 141: 879-886. 6