Multipol Standard. Aparat do jednoczesnego wylewania do 6 żeli poliakrylamidowych. Instrukcja Obsługi. Numer katalogowy:

Transkrypt

1 Multipol Standard Aparat do jednoczesnego wylewania do 6 żeli poliakrylamidowych Instrukcja Obsługi Numer katalogowy: Aby uzys k ać pomoc techniczną : T

2 Spis treści 1. Informacje ogólne Wprowadzenie Skład zestawu Multipol Standard Specyfikacja techniczna Zasady bezpiecznego użytkowania 4 2. Użytkowanie zestawu Multipol Standard 5 3. Podstawy teoretyczne rozdziału elektroforetycznego Rozdział białek w żelu poliakrylamidowym w obecności dodecylosiarczanu sodu (SDS) 7 4. Odczynniki i przygotowanie roztworów 8 5. Konserwacja aparatu Akcesoria i wyposażenie dodatkowe Warunki gwarancji Formularz naprawy gwarancyjnej Wsparcie techniczne 12 2

3 1. Informacje ogólne 1.1 Wprowadzenie Serdecznie dziękujemy za zakup APARATU MULTIPOL STANDARD 2 do jednoczesnego wylewania do 6 żeli poliakrylamidowych. Aparat Multipol Standard jest kompatybilny z szybami elektroforetycznymi aparatu Standard 2. Konstrukcja aparatu pozwala na jednoczesne sporządzenie do 6 żeli, co gwarantuje powtarzalność przeprowadzanych rozdziałów elektroforetycznych a jednocześnie skraca czas przygotowania żeli oraz pozwala zaoszczędzić odczynniki. Aparat Multipol Standard może być także wykorzystany do przechowywania wylanych żeli, zabezpieczając je przed wyschnięciem i uszkodzeniem. Zalety Aparatu Multipol Standard: - wygodne i szybkie wylanie 6 żeli poliakrylamidowych zapewniających powtarzalność przeprowadzanych rozdziałów - wygodne przechowywanie gotowych żeli - solidna i bezpieczna konstrukcja aparatu - łatwość w czyszczeniu 1.2 Skład Zestawu Multipol Standard Aby optymalnie korzystać z Aparatu Multipol Standard, prosimy o zapoznanie się z elementami Aparatu Multipol Standard przed pierwszym zastosowaniem. 1. Komora aparatu 1 szt. 2. Pokrywa 1 szt. 3. Śruby dociskowe 8 szt. 4. Strzykawka 1 szt. 5. Wężyk łączący strzykawkę z aparatem 1 szt. 6. Folie przekładkowe 10 szt. 7. Instrukcja obsługi 1 szt. 1.3 Specyfikacja techniczna Korpus komory aparatu Pokrywa Śruby dociskowe Wężyk połączeniowy Folie przekładkowe Wymiary aparatu (d x sz x w) Waga PERSPEX PMMA PERSPEX PMMA poliamid silikon PCV 22 cm x 65 cm x 22 (cm) 2 kg 3

4 1.4 Zasady bezpiecznego użytkowania Prosimy o uważne zapoznanie się z instrukcją obsługi oraz zasadami bezpiecznego użytkowania aparatu. 1. Aparat Multipol Standard powinien być obsługiwany wyłącznie przez przeszkolony personel. 2. Aparat Multipol Standard należy używać wyłącznie zgodnie z jego przeznaczeniem. 3. Należy używać wyłącznie dedykowanych akcesoriów (szyb). Stosowanie elementów z innych, niekompatybilnych aparatów może spowodować jego uszkodzenie i utratę ochrony gwarancyjnej. 4. Aparat Multipol Standard jest wykonany z tworzywa PERSPLEX PMMA, który może ulec uszkodzeniu pod wpływem działania rozpuszczalników organicznych. Do mycia aparatu należy stosować wyłącznie łagodne detergenty i wodę dejonizowaną. 5. Akrylamid i TEMED wykorzystywane do sporządzania żeli są substancjami toksycznymi, dlatego należy bezwzględnie przestrzegać zasad bezpieczeństwa pracy i stosować środki ochrony osobistej (rękawiczki, fartuch). Pozostałości tych odczynników powinny być poddawane utylizacji. 4

5 2. Użytkowanie Aparatu Multipol Standard 2.1 Przygotowanie szyb i aparatu oraz wylanie żeli Szyby, przekładki i grzebienie należy umyć przed i po użyciu przy pomocy gąbki 1% wodnym roztworem SDS, a następnie dokładnie spłukać wodą destylowaną i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Przygotować także foliowe przekładki zapobiegające sklejaniu się szyb. Po wysuszeniu, przygotować do 6 kompletów szyb i przekładek zestawionych w sposób przedstawiony na Rysunku 1. Możliwa jest polimeryzacja mniejszej liczby żeli (2, 4 lub 6) przy wypełnieniu brakującej przestrzeni Aparatu Multipol Standard, odpowiednio: 3, 2 lub 1 płytkami wypełniającymi (nr kat ). Rysunek 1. Wyszczególnienie elementów potrzebnych do wylania żelu. 1 - szyba z wycięciem, 2 - szyba pełna, 3 grzebień, 4 - przekładki boczne 1. Ułożyć Multipol Standard poziomo na blacie stołu zdejmując jego boczną ściankę. 2. Na ściance Multipola ułożyć fragment folii do oddzielania szyb a następnie pierwszy przygotowany komplet szyb (szyba pełna, przekładki, grzebień, szyba z wycięciem). 3. Na komplecie szyb ułożyć fragment folii, co zapobiegnie sklejaniu szyb podczas wylewania żelu. 4. Na folii ułożyć drugi komplet szyb i dalej postępować analogicznie do momentu ułożenia wszystkich kompletów szyb i ew. płytek wypełniających w aparacie. 5. Nałożyć ściankę aparatu Multipol Standard i zamknąć aparat dokręcając ją śrubami dociskowymi. 6. Aparat Multipol Standard wypełniony szybami ustawić pionowo na blacie stołu. 7. Do zaworku znajdującego się na dole nieruchomej ścianki Multipola Standard dołączyć za pomocą wężyka silikonowego strzykawkę pozbawioną tłoka i jeśli to możliwe, umocować ją w statywie powyżej aparatu tak aby naprężyć wężyk. 8. Przygotować żel poliakrylamidowy zgodnie z instrukcją zawartą w dziale Odczynniki i przygotowanie roztworów (str. 8). 9. Przygotowany roztwór akrylamidu wlewać jednostajnym ruchem w strzykawkę, niedopuszczając do pojawienia się bąbelków powietrza w wężyku i żelach. 5

6 10. W naczyniu z przygotowanym roztworem akrylamidu pozostawić małą porcję, aby mieć kontrolę czasu polimeryzacji żelu. 11. Pozostawić żele przez około 30 min a następnie zalać je buforem, w którym będzie przeprowadzana elektroforeza. 12. Multipol Standard przykryć pokrywą i dokręcić ją śrubami dociskowymi. 13. Multipol Standard z żelami pozostawić do następnego dnia w 4 C. 14. Przygotowane żele przechowywać do 2 tygodni w temp 4 C, niedopuszczając do ich wyschnięcia. 6

7 3. Podstawy teoretyczne rozdziału elektroforetycznego 3.1 Rozdział białek w żelu poliakrylamidowym w obecności dodecylosiarczanu sodu (SDS) Techniki elektroforetyczne jako podstawową zasadę wykorzystują fakt, iż naładowana cząsteczka umieszczona w polu elektrycznym przemieszcza się pod jego wpływem. Prędkość jej migracji (v) jest wypadkową natężenia pola elektrycznego, w którym się znajduje (E), jej ładunku elektrycznego (q), wypadkowej siły tarcia (Ft) oraz siły jonowej, lepkości i temperatury otoczenia (buforu). Zależność tą opisuje równanie: Ponieważ wypadkowe opory ruchu - siła tarcia - są wprost proporcjonalne do masy (m) cząsteczki możemy napisać: Pierwszy człon tego równania nazwano ruchliwością elektroforetyczną cząsteczki ( = q / m). W przypadku elektroforezy białek w żelu w obecności SDS będącego detergentem anionowym (obdarzonym ładunkiem ujemnym), ruchliwość elektroforetyczna białka jest zależna tylko od jego masy cząsteczkowej. Dodecylosiarczan sodu denaturuje białka oblepiając rozwinięty łańcuch polipeptydowy. W obecności dodatkowego czynnika redukującego - - merkaptoetanolu, wszystkie peptydy uzyskują identyczną gęstość ładunku elektrycznego na jednostkę długości niezależnie od długości białka, w rezultacie czego nadany przez SDS ładunek jest wprost proporcjonalny do długości polipeptydu. Poza tym uzyskany ładunek ujemny jest tak duży, iż w praktyce pozwala na zaniedbanie ładunku własnego białka. Określając Rf wzorców masowych białek, możemy określić masę cząsteczkową nieznanego białka rozdzielając je na tym samym żelu i wykorzystując liniową zależność pomiędzy Rf a log10 masy cząsteczki. W czasie elektroforezy jeden z parametrów elektrycznych jest stabilizowany. Dodatkowym zjawiskiem, które należy brać pod uwagę jest wzrost oporu elektrycznego żelu, czego konsekwencje przedstawiono w Tabeli 1. Stabilizowany parametr I U P Efekt v = constant, Q wzrasta ( I2 R) temperatura żelu wzrasta v maleje, Q maleje temperatura żelu pozostaje stała v maleje, Q = constant temperatura żelu wzrasta, mniej jednakże niż w przypadku stabilizowania I. gdzie: v - prędkość migracji, I - natężenie prądu, U - napięcie, P - moc, Q - ciepło Obecnie najbardziej rozpowszechnionym systemem elektroforezy z użyciem SDS jest układ nieciągły (wg. Laemmli-ego). W układzie tym rozdzielane białka ulegają zagęszczeniu w żelu górnym przed wejściem w żel rozdzielający - dolny. W rezultacie uzyskuje się bardzo ostre prążki białka, co korzystnie wpływa na rozdzielczość tego układu. 7

8 4. Odczynniki i przygotowanie roztworów do elektroforezy białek w warunkach denaturujących UWAGA!!! Wszystkie roztwory powinny być przygotowane z użyciem wysokiej czystości wody - destylowanej lub dejonizowanej a następnie przefiltrowane. 1. Akrylamid/Bis-akrylamid (30% T, 2.67% C) 87,6 g akrylamid (29,2 g/100 ml) 2,4 g N'N'-bis-methylene-acrylamide (0,8 g/100 ml) Dopełnić do 300 ml wodą dejonizowaną. Roztwór przefiltrować w temp pokojowej lub 4 C UWAGA!!! Akrylamidy są substancjami neurotoksycznymi! Pracując z nimi należy używać rękawiczek, pipetując używać gruszki lub nasadki, unikać wdychania oparów, przechowywać w szczelnie zamkniętym naczyniu % (w/v) SDS Rozpuścić delikatnie mieszając 10 g SDS w 90 ml wody dejonizowanej. Dopełnić do 100 ml wodą dejonizowaną. 3. 1,5 M Tris-HCl, ph 8,8 27,23 g Tris base (18,15 g/100 ml) 80 ml woda dejonizowana Ustalić ph 8.8 z użyciem 6 N HCl. Dopełnić wodą dejonizowaną do 150 ml. Przechowywać w 4 C. 4. 0,5 M Tris-HCl, ph 6,8 6 g Tris base 60 ml woda dejonizowana Ustalić ph 6,8 z użyciem 6 N HCl. Dopełnić wodą dejonizowaną do 100 ml. Przechowywać w 4 C. 5. Bufor obciążający (SDS bufor redukujący) 3,55 ml woda dejonizowana 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl, ph 6,8 2,5 ml glicerol 2,0 ml 10% (w/v) SDS 0,2 ml 0,5% (w/v) Bromophenol Blue 9,5 ml Objętość całkowita Przechowywać w temperaturze pokojowej. Użycie: Bezpośrednio przed użyciem dodać 50 µl β-mercaptoetanolu do 950 µl buforu obciążającego. Próbki należy rozcieńczyć buforem obciążającym w stosunku 1:2 i zdenaturować w temperaturze 95 C prze 4 minut. 6. Bufor elektrodowy 10x stężony, ph 8.3 (1 L) 30,3 g Tris base 144,0 g glicyna 10,0 g SDS 8

9 Naważki rozpuścić dopełniając wodą dejonizowaną do objętości 1 L. Przechowywać w 4 C. Jeżeli nastąpi precypitacja składników bufor, przed użyciem bufor ogrzać do temperatury pokojowej. Użycie: Rozcieńczyć 50 ml 10x stężonego buforu elektrodowego w 450 ml wody dejonizowanej. Dokładnie wymieszać przed użyciem % (w/v) Nadsiarczan Amonu (APS ) 100 mg nadsiarczan amonu Rozpuścić w 1 ml wody dejonizowanej. Przechowywać w +4C (do 5 dni) lub sporządzić bezpośrednio przed użyciem 8. N-butanol nasycony wodą 25,0 ml n-butanol 2,5 ml woda dejonizowana Po wymieszaniu odczekać do momentu rozdzielenia faz. Używać fazy górnej. 9. Przygotowanie żelu Przygotować 20 ml (na jeden żel) roztworu żelu rozdzielającego według Tabeli 2. Nie dodawać katalizatorów. Składnik Żel rozdzielający 10%, (20 ml) Żel rozdzielający 12,5%, (20 ml) Żel zagęszczający 4%, (10,0 ml) Akrylamidy 6,65 ml 8,3 ml 1,33 ml Bufor ph 8,8 5,0 ml 5, Bufor ph 6, ,5 ml woda dejonizowana 8,35 ml 6,7 ml 6,2 ml 10% APS 75 l 75 l 50 l TEMED 20 l 20 l 10 l Zestawić suche płytki szklane i przekładki w sposób pokazany Rysunkach 2 i 3. Odlać ok. 2 ml roztworu żelu rozdzielającego do małej, czystej zlewki. Do odlanej porcji dodać 5 l katalizatorów, szybko wymieszać i nanieść pipetą po 1 ml na każdą z przekładek tak, aby żel spłynął po przekładkach na sam dół uszczelniając przy tym przekładki boczne a także przekładkę dolną. Po 5-10 minutach na dnie i po bokach powinna się utworzyć cienka warstwa spolimeryzowanych akrylamidów. Do reszty roztworu żelu rozdzielającego dodać ilości katalizatorów określone w Tabeli 2, dokładnie wymieszać i wlać żel pomiędzy szyby (wprost ze zlewki lub pipetą), pozostawiając u góry ok. 2,5 cm wolnego miejsca. Na wylany żel nawarstwić 0,5 ml n-butanolu wysyconego wodą. Pozostawić na okres polimeryzacji w pozycji pionowej (po 1 godzinie polimeryzacji ulega zaledwie 40 % cząsteczek akrylamidu, dlatego też dla otrzymania odpowiedniego usieciowania i żelu o wysokiej należy pozostawić żel na 2-3 godziny, w 4 C). Przygotować 7,5 ml roztworu żelu zagęszczającego (na 1 żel; wg Tabeli 2). 9

10 Po spolimeryzowaniu żelu dolnego należy wylać n-butanol, przestrzeń między szybami przepłukać dwu-trzykrotnie wodą dejonizowaną a następnie delikatnie osuszyć bibułą. Do roztworu żelu zagęszczającego dodać odpowiednią ilość katalizatorów; żel wlać między szyby. Wsunąć grzebień w górny żel unikając powstawania pęcherzyków powietrza pod ząbkami grzebienia. Pozostawić do polimeryzacji na ok. 2-3 godziny. Przygotować próbki rozcieńczając je buforem obciążającym w stosunku 1:2 i zdenaturować je w temperaturze 95 C prze 4 minut. Zwirować próbki w mikrowirówce. Na żel należy nanosić tylko klarowny supernatant. Wyjąć dolną przekładkę, umieścić szyby wraz z żelem w aparacie, przypiąć klamrami, napełnić oba zbiorniki buforem elektrodowym, ostrożnie wyjąć grzebień. Ostrożnie wprowadzić próby (po denaturacji termicznej i wirowaniu) do studzienek za pomocą strzykawki Hamiltona lub pipety automatycznej z cienką końcówką (tipsem). Podłączyć aparat do zasilacza. Ustawić napięcie ok V (dla żelu o grubości 1,5 mm). Po wejściu barwnika w żel dolny (rozdzielający) można zwiększyć napięcie do 250 V, lecz dla zapewnienia dobrej jakości rozdziału napięcie optymalne wynosi ok. 150 V. Po dojściu barwnika na ok. 0,5 cm od końca żelu (po 3-4 h) wyłączyć zasilacz, wylać bufor ze zbiornika głównego, wyjąć szyby. Żel po wyjęciu spomiędzy szyb umieścić w roztworze barwnika, np Coomassie na ok. 35 min. w temperaturze pokojowej z mieszaniem (można pozostawić bez mieszania przez noc). Polecamy gotowy barwnik Coomassie S (nr kat ), który zapewnia wysoką czułość i powtarzalność oraz skraca czas barwienia do min. Żel po sfotografowaniu (np. w świetle przechodzącym [polecamy podświetlacz na światło białe nr kat ] z żółtym filtrem) można przechowywać w wodzie lub wysuszyć (np. przy pomocy zestawu do suszenia żeli poliakrylamidowych DRYOUT (nr kat ). 10

11 5. Konserwacja aparatu Aparat Multipol Standard jest wykonany z materiału typu PERSPLEX PMMA. Materiał typu PERSPLEX PMMA jest podatny na uszkodzenia pod wpływem stężonych rozpuszczalników organicznych, w szczególności alkoholi. Do mycia aparatu należy używać łagodnych detergentów i wody dejonizowanej. Szyby elektroforetyczne należy myć 1 % roztworem SDS i wody dejonizowanej. Dokładnie umyte szyby nie wymagają odtłuszczania z użyciem alkoholi. Należy zwrócić uwagę, by wilgotnych szyby nie stykały się ze sobą, gdyż mogą pęknąć podczas ich rozdzielania. Grzebienie i przekładki należy przepłukać wodą dejonizowaną. 11

12 6. Akcesoria i wyposażenie dodatkowe Numer katalogowy Opis produktu Płytki wypełniające Multipol Standard (zastępuje dwa komplety szyb) Przekładki Standard grubość 0,5 mm Przekładki Standard grubość 1,0 mm Przekładki Standard grubość 1,5 mm Przekładki Standard grubość 2,0 mm Grzebień Standard, grubość: 0,5 mm/10 studzienek Grzebień Standard, grubość: 0,5 mm/20 studzienek Grzebień Standard, grubość: 1,0 mm/10 studzienek Grzebień Standard, grubość: 1,0 mm/20 studzienek Grzebień Standard, grubość: 1,5 mm/10 studzienek Grzebień Standard, grubość: 1,5 mm/20 studzienek Grzebień Standard, grubość: 2,0 mm/10 studzienek Grzebień Standard, grubość: 2,0 mm/20 studzienek Szyby elektroforetyczne Standard DRYOUT zestaw do suszenia żeli Folie do zestawu DRYOUT (35 żeli) Folie do zestawu DRYOUT (100 żeli) Odczynniki Roztwór akrylamidów 38,5% do biol. mol. (37,5:1) Roztwór akrylamidów 30% do biol. mol. (29:1) Bufor elektrodowy 10x stężony, ph 8,3 (1 L) 12

13 7. Warunki gwarancji Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o. gwarantuje, że dostarczony Państwu sprzęt został przetestowany i spełnia wszystkie warunki specyfikacji. Niniejsza gwarancja jest ważna przez 24 miesiące tylko wtedy, gdy produkt i jego funkcje zostały wykorzystane zgodnie z instrukcją obsługi i przeznaczeniem aparatu. Producent nie ponosi odpowiedzialności za straty lub szkody wynikające z nieprawidłowego użytkowania aparatu (używanie akcesoriów od innych modeli aparatów, używanie stężonych rozpuszczalników organicznych). Gwarancji nie podlega sprzęt, który nosi znamiona naprawy przez osoby inne niż wskazane przez firmę Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne. Odpowiedzialność producenta jest ograniczona do naprawy lub wymiany urządzenia, lub zwrotu kosztów zakupu. Firma Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne zastrzega sobie prawo do zmiany specyfikacji urządzenia bez wcześniejszego powiadomienia. Urządzenie powinno być obsługiwane wyłącznie przez osoby przeszkolone. 7.1 Formularz naprawy gwarancyjnej W przypadku wystąpienia awarii, uprzejmie prosimy o wypełnienie Formularza naprawy gwarancyjnej dostępnego na kolejnej stronie i skontaktowanie się z firmą Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne. Prosimy o zachowanie oryginalnych opakowań aparatu do czasu zakończenia okresu gwarancyjnego. 8. Wsparcie techniczne Jeżeli macie Państwo jakieś pytania dotyczące obsługi urządzenia lub dostępności akcesoriów i sprzętu uzupełniającego prosimy o kontakt z naszą Firmą. Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o. ul. Pawińskiego 5a/ blok D Warszawa Tel Fax info@kucharczyk.com.pl 13

14 ZGŁOSZENIE SERWISOWE Nazwa Instytucji Adres Instytucji Osoba zgłaszająca Dane kontaktowe (tel., ) DANE URZĄDZENIA Nazwa Model / nr katalogowy Numer seryjny Opis problemu/uszkodzenia Oświadczenie Niniejszym potwierdzam, że przesłane do serwisu urządzenie nie zawiera substancji chemicznych ani czynników infekcyjnych szkodliwych dla zdrowia człowieka. Data Osoba zgłaszająca Podpis 14

15