ĆWICZENIE 3: CHROMATOGRAFIA PLANARNA

Transkrypt

1 ĆWICZENIE 3: CHROMATOGRAFIA PLANARNA Chromatografia jest to metoda chemicznej analizy instrumentalnej, w której dokonuje się podziału substancji (w przeciwprądzie) między fazę nieruchomą i fazę ruchomą. Fazę nieruchomą może stanowić bibuła filtracyjna, cienka warstwa adsorbentu naniesiona na płytkę lub wypełnienie kolumny. Fazę ruchomą stanowi natomiast roztwór ciekły. W metodzie tej wykorzystywana jest: 1) różnica w zdolności adsorpcyjnej fazy stacjonarnej względem różnych składników znajdujących się w fazie ruchomej; 2) różnica wielkości współczynnika podziału składników rozdzielanych; 3) różnica wielkości cząsteczek separowanych składników; 4) zatrzymywanie jonów na podłożu jonitowym. Stopień rozdziału można zwiększyć dobierając zarówno odpowiedni rozpuszczalnik (eluent), jak i substancję tworzącą fazę stacjonarną. Obraz analizy chromatograficznej otrzymany bezpośrednio w fazie stacjonarnej (np. barwne plamy w chromatografii planarnej pochodzące od poszczególnych składników) lub wykres przedstawiający wyniki analizy w postaci pików odpowiadających rozdzielanym składnikom (uzyskany dzięki zastosowaniu odpowiedniego detektora) nosi nazwę chromatogramu. Chromatografia może być stosowana do badań jakościowych, ilościowych i dla celów preparatywnych. Zalety chromatografii cienkowarstwowej próbki przygotowywane tą techniką nie muszą być bardzo staranne, a niewielkie zanieczyszczenia nie stanowią istotnej przeszkody próbkę można nanosić na płytkę w dużej objętości, dlatego nie ma potrzeby zagęszczania roztworów na jednej płytce można analizować dużą liczbę próbek jednocześnie znacznie szybciej niż HPLC nie potrzeba dobierać rozpuszczalnika do detektora możliwe jest porównanie składników próbek ze wzorcami w wielu przypadkach można obserwować przebieg rozdziału i po osiągnięciu zadowalającego poziomu przerwać proces cena jednej analizy jest o około 80% niższa niż HPLC

2 Nanoszenie próbek Próbki nanosi się w postaci plamek (rozdział analityczny) lub pasm (rozdział preparatywny). tka 1 płytka chromatograficzna, 2 linia startu, 3 czoło fazy ruchomej, 4 eluent, 5 komora chromatograficzna, A odległość od linii startu do środka plamki, B odległość od linii startu do czoła fazy ruchomej Linia startu (10-20 mm od brzegu płytki) nie może być zanurzona w eluencie. Próbę można nanosić ręcznie (za pomocą mikrostrzykawki lub mikropipety) lub stosując automatyczne aplikatory (100nl - 100ml). Komory do chromatografii cienkowarstwowej Wykorzystuje się zwykle prostopadłościenne lub cylindryczne, szczelnie zamykane komory szklane. Wewnątrz umieszcza się kilka lub kilkanaście płytek, z zastrzeżeniem, ze nie mogą się stykać ze sobą. Na dno komory wlewa się rozpuszczalnik, aby płytki były zanurzone 5-10 mm. (nie może być zanurzona linia startu próbek). W dużych komorach ściany wykłada się bibułą wysycenie atmosfery parami rozpuszczalnika zapewnia krótszy czas chromatografowania i lepszy rozdział.

3 Wizualizacja chromatogramów Po rozwinięciu chromatogram suszy się. W przypadku, gdy składniki analizowanej mieszaniny są barwne otrzymuje się chromatogram w postaci barwnych plamek. Powinny być okrągłe, nierozmyte, rozłożone równomiernie między linią startu, a czołem fazy ruchomej, bez ogonów. Jeśli składniki analizowanej substancji są bezbarwne wówczas należy wywołać chromatogram. Do wywoływania używa się odczynników chemicznych reagujących z plamkami rozdzielonych związków bezpośrednio po zadziałaniu lub po ogrzaniu, np. 1200C. Płytki spryskuje się reagentem lub zanurza w roztworze. Prócz odczynników w postaci ciekłej wykorzystuje się czasem związki gazowe np. amoniak, pary jodu lub bromu. Substancję identyfikowaną można porównywać ze wzorcem na podstawie porównania ich współczynników RF. b R F a RF (retardation factor) stosunek drogi migracji substancji chromatografowanej (od punktu startu do środka plamki) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od startu do

4 czoła). Najdokładniejsze wartości osiąga się dla RF w zakresie od 0,1 do 0,7. W tym przedziale substancje nie muszą być chromatografowane na tej samej płytce, jednak rodzaj płytki i warunki analizy muszą być identyczne. Ta sama wartość RF nie stanowi 100% pewności identyczności. Należy przeprowadzić rozwijanie w innych warunkach i potwierdzić uzyskane wcześniej wyniki. Do identyfikacji można wykorzystać densytometr i porównać dane z wzorcami. Przy nieznanej substancji rozdziela się ją preparatywnie i identyfikuje poszczególne składniki innymi metodami, np. spektrofotometrycznie.

5 Cześć praktyczna ĆWICZENIE 3: CHROMATOGRAFIA PLANARNA Cel ćwiczenia 1. Ocena jakościowa karotenoidów pochodzenia roślinnego. Materiały 1. Płytki TLC 2. Mikropipeta 3. Szpinak 4. Marchew 5. Heksan, aceton, faza ruchoma: heksan : aceton 70 : 30 Przebieg ćwiczenia 1. Rozdrobnić liście szpinaku oraz korzeń marchwi na drobne kawałki. 2. Przenieść do moździerza około 2 g próbki i rozcierać z 2 ml acetonu. Następnie dodać jeszcze 3 ml acetonu, rozetrzeć i przesączyć przez sączek karbowany do suchej i czystej probówki. 3. Moździerz przepłukać jeszcze 2 ml acetonu i przelać zawartość na sączek. 4. Do probówek dodać po 2 ml heksanu, wytrząsnąć i po rozdzieleniu warstw, odebrać pipetą do probówek Eppendorf warstwę heksanu. 5. Na płytkach z żelem krzemionkowym narysować linię startową miękkim ołówkiem ok. 1 cm od krawędzi płytki. 6. Nanieść plamki startowe przygotowanych ekstraktów w heksanie za pomocą mikrostrzykawki, w ilości 20 l (dla ekstraktu ze szpinaku) i 100 l (dla ekstraktów z marchwi). Plamki nanosić, przy jednoczesnym odparowywaniu rozpuszczalnika za pomocą nawiewu powietrza. 7. Po wysuszeniu, płytki rozwijać za pomocą mieszaniny heksan : aceton w proporcjach: 70 : 30.

6 Cześć praktyczna 8. Zaznaczyć na płytce linię czoła i określić wartości Rf (Rf = a/b, gdzie a-droga przebyta przez środek plamy analizowanej substancji, droga czoła fazy ruchomej) dla poszczególnych plamek Opracowanie wyników Wszystkie wartości Rf zestawić w tabeli. Zidentyfikować związki wiedząc, że kolejność elucji przebiega następująco: o Karoten żółty o Feofityna a szary o Feofityna b oliwkowo-zielony o Chlorofil a niebiesko-zielony o Luteina żółty o Chlorofil b zielony o Ksantofile - żółty Porównać skład barwników roślinnych liści szpinaku i korzenia marchwi. Sprawozdania powinno zawierać 1. Krótki wstęp teoretyczny. 2. Cel przeprowadzonego ćwiczenia. 3. Tabelę z wynikami pomiarów i obserwacjami. 4. Dyskusję i wnioski.