ANALIZA PORÓWNAWCZA IZOFORM PEROKSYDAZY W KOLE- OPTYLACH OWSA METOD

Transkrypt

1 ANALIZA PORÓWNAWCZA IZOFORM PEROKSYDAZY W KOLE- OPTYLACH OWSA METODĄ ELEKTROFOREZY W śelu POLIAKRYLOAMIDOWYM. WYBARWIANIE ROZDZIELONYCH BIAŁEK COOMASSIE BRILLANT BLUE-G250 WSTĘP Powstawanie nadtlenku wodoru i aktywnych form tlenu w tkankach roślinnych Głównym źródłem H 2 O 2 w roślinach jest fotooddychanie, reakcja Mehlera i indukowana *- przez protony dekompozycja anionów nadtlenkowych O 2, β-utlenianie kwasów tłuszczowych w peroksysomach oraz reakcje związane z obroną przed patogenami. W fotooddychaniu do rybulozo-1,5-bisfosforanu zostaje przyłączony tlen w wyniku czego powstaje fosfoglikolan i 3-fosfoglicerynian. Specyficzna fosfataza odszczepia resztę fosforanową od fosfoglikolanu, a powstający glikolan po przedostaniu się do peroksysomów zostaje utleniony do glioksalanu przez oksydazę glikolanową zgodnie z równaniem: glikolan + O 2 glioksalan + H 2 O 2 W mitochondriach lub chloroplastach tylko jeden elektron redukuje O 2 powstaje anion nadtlenkowy O *- 2. W chloroplastach anion nadtlenkowy powstaje głównie w tzw. reakcji Mehlera, która polega na redukcji O 2 przez centrum Ŝelazowo-siarkowe Fx fotosystemu I. W wyniku uprotonowania anionu nadtlenkowego tworzy się rodnik wodoronadtlenkowy HO * 2, który działa destrukcyjnie na lipidy, kwasy nukleinowe i białka. Dwa rodniki wodoronadtlenkowe mogą reagować ze sobą, w wyniku czego powstaje H 2 O 2 : * HO 2 + HO * 2 H 2 O 2 + O 2 Anion nadtlenkowy moŝe być usuwany takŝe przez dysmutazę nadtlenkową, enzym, który katalizuje przekształcenie dwóch anionów nadtlenkowych w H 2 O 2 i O 2 : O *- 2 + O * H + H 2 O 2 + O 2 W peroksysomach, w przeciwieństwie do mitochondriów, reakcja β-utleniania długołańcuchowych kwasów tłuszczowych zachodzi z udziałem oksydazy Acylo-CoA zgodnie z równaniem: C16 Acylo-CoA + O 2 trans- 2 enolo-coa + H 2 O 2 Na ryc. 1 pokazano przybliŝone ilości H 2 O 2 produkowane w chloroplastach, mitochondriach i peroksysomach w warunkach dobrego nasłonecznienia i optymalnej temperatury. 1

2 Ryc. 1. Produkcja nadtlenku wodoru w komórce roślinnej (wg Foyer CH, Noctor G Physiologia Plantarum 2003; 119: ). RóŜne formy aktywnego tlenu, ale zwłaszcza anion nadtlenkowy O *- 2 i H 2 O 2, są potrzebne do lignifikacji, a ponadto funkcjonują one jako cząsteczki sygnałowe w reakcjach obronnych przeciw patogenom. Jednak większość nadtlenku wodoru i innych form aktywnego tlenu musi zostać usunięta enzymatycznie i nieenzymatycznie (antyoksydanty). W enzymatycznym usuwaniu H 2 O 2 uczestniczy katalaza, która rozkłada nadtlenek wodoru zgodnie z równaniem reakcji: 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 Katalaza jest zlokalizowana w cytoplazmie, peroksysomach i glioksysomach. Peroksydaza usuwa nadtlenek wodoru w reakcji utleniania substratów: RH 2 + H 2 O 2 R + 2H 2 O WaŜny układ usuwający H 2 O 2 tworzą enzymy związane z metabolizmem kwasu askorbinowego i glutationu, a zwłaszcza para enzymów: peroksydaza askorbinianowa/reduktaza dehydroaskorbinianowa. Utleniona przez peroksydazę forma kwasu askorbinowego jest redukowana w reakcji, w której dawcą wodorów jest zredukowany glutation (Ryc. 2). Peroksydaza askorbinianowa (APX) jest zlokalizowana w cytoplazmie, w błonach i stromie plastydów, reduktaza dehydroaskorbinianowa (DHAR) występuje w cytoplazmie i stromie plastydów, a reduktaza glutationowa (GR) w cytoplazmie, mitochondriach i w stromie plastydów. 2

3 Ryc. 2. Antyoksydacyjny system ochrony, poszczególne enzymy i antyoksydanty nieenzymatyczne (Buchanan, Gruissem, Jones, Plant Biochemistry). Elektroforeza Ŝelowa Elektroforeza jest techniką rozdziału białek opartą na zróŝnicowaniu ich ruchliwości w polu elektrycznym. Cząsteczki białek migrują w polu elektrycznym z szybkością zaleŝną od ich wypadkowego ładunku i masy cząsteczkowej. Od ładunku wypadkowego zaleŝy teŝ kierunek ruchu. Rozdział elektroforetyczny prowadzi się prawie zawsze na stałym podłoŝu (np. bibuła, folia z octanu celulozy, Ŝel agarozowy lub poliakryloamidowy). Najczęściej jako nośniki uŝywane są Ŝele, poniewaŝ działają one jak sita molekularne, przez co znacznie zwiększają rozdzielczość (ryc. 3). Cząsteczki o małych rozmiarach, w porównaniu z porami Ŝelu, łatwo w nim wędrują, natomiast cząsteczki znacznie większe niŝ pory Ŝelu pozostają prawie nieruchome. Cząsteczki o pośrednich rozmiarach poruszają się w Ŝelu z róŝną prędkością. 3

4 Ryc. 3. Elektroforeza na Ŝelu poliakryloamidowym. A. Aparat do elektroforezy Ŝelowej. B. Pory Ŝelu poliakryloamidowego działają jak sito i rozdzielają białka w zaleŝności od wielkości ich cząsteczek (J.M. Berg, J.L. Tymoczko, L.Stryer, Biochemia) Najczęściej stosowanym Ŝelem jest Ŝel poliakryloamidowy, który posiada szereg zalet decydujących o jego powszechnym uŝyciu jako nośnika. śel poliakryloamidowy jest chemicznie obojętny, bezbarwny i pozbawiony ładunków elektrostatycznych, odznacza się duŝą wytrzymałością mechaniczną i termiczną oraz jest łatwy i szybki w przygotowaniu. Dodatkowo, dzięki moŝliwości zróŝnicowanego sieciowania, moŝna uzyskać określone rozmiary oczek sita molekularnego (0,6-4 nm).wielkość oczek sieci Ŝelu zaleŝy od proporcji między akryloamidem (H 2 C=CH CO NH 2 ) a N,N -metyleno-bis-akryloamidem H 2 C=CH CO NH CH 2 NH CO CH=CH 2 (potocznie nazywanym bis-akryloamidem), które są substratami do polimeryzacji. Od ilości bisakryloamidu w mieszaninie zaleŝy liczba wiązań poprzecznych, decydująca o rozmiarach sita molekularnego. Do przeprowadzenia polimeryzacji konieczny jest dodatek nadsiarczanu amonu oraz katalizatora N,N,N,N -czterometyloetyleno-dwuaminy (TEMED). W wyniku katalizowanego przez TEMED rozpadu nadsiarczanu amonu, powstają wolne rodniki tlenowe, pod wpływem których tworzą się rodniki poliakryloamidowe dające polimer. Dla uzyskania optymalnej rozdzielczości stosuje się Ŝel o odpowiedniej wielkości porów, która zaleŝy od stęŝenia procentowego Ŝelu. Elektroforezę w Ŝelu poliakryloamidowym moŝna wykonywać wieloma metodami, spośród których bardzo wygodną jest metoda wg Ogita i Markert [1]. Elektroforezę wykonuje się w układzie dwóch Ŝeli (rozdzielający i zagęszczający) róŝniących się stęŝeniem procentowym i ph. Zostanie ona zastosowana w opisywanym ćwiczeniu do analizy porównawczej izoform peroksydazy z koleoptyli owsa. 4

5 Sprzęt: MATERIAŁY I METODY Aparat do elektroforezy (wersja mini), płytki szklane o wymiarach10 x 10 cm, zasilacz stabilizowany (do 150 V). Odczynniki: A) Odczynniki do Ŝelu rozdzielającego Roztwór IA (Akrylamid) rozpuścić 39 g akrylamidu i 1 g bis-akrylamidu w wodzie, dodać 20 ml glicerolu, całość uzupełnić wodą do 100 ml. UWAGA: akrylamid jest neurotoksyną wchłanianą przez skórę, dlatego naleŝy unikać kontaktu z roztworami tego związku i uŝywać rękawiczek lateksowych Roztwór IB (0.75 M Tris-HCl) rozpuścić 9,15 g Trisu w wodzie, dodać 3 ml HCl, całość uzupełnić wodą do 100 ml. Roztwór IC (0.2 % (w/v) nadsiarczan amonu) rozpuścić 0,2 g nadsiarczanu amonu w 100 ml wody. Roztwór ID (0.4 % (v/v) TEMED) 0,4 ml TEMEDu uzupełnić do 100 ml wodą. B) Odczynniki do Ŝelu zagęszczającego Roztwór IIA (Akrylamid) rozpuścić 38 g akrylamidu i 2 g bis-akrylamidu w wodzie, dodać 20 ml glicerolu i uzupełnić wodą do 100 ml. Roztwór IIB (0.75 M Tris HCl) rozpuścić 1,5 g Trisu w wodzie, dodać 1 ml HCl i uzupełnić wodą do 100 ml. Roztwór IIC (0.4 % (w/v) nadsiarczan amonu) rozpuścić 0.4 g nadsiarczanu amonu w 100 ml wody. Roztwór IID (2.0 % (v/v) TEMED) 2 ml TEMEDu uzupełnić wodą do 100 ml. C) Bufor do elektroforezy (ph 8.3) rozpuścić 1,5 g Trisu i 7,2 g glicyny w 1 L wody. D) Roztwór do wybarwiania białek 0,004% błękit brylantowy rozpuścić 20 mg Coomassie Brillant Blue G-250 w 500 ml 3,5 % kwasu nadchlorowego z 20 % metanolem. E) Roztwór odbarwiający 10% (v/v) kwas octowy F) Roztwór AEC (3-amino-9-etylokarbazol) do wykrywania aktywności peroksydazy syntetycznym substratem utlenianym przez peroksydazy w obecności H 2 O 2 moŝe być 3-amino-9- etylokarbazol o wzorze: 5

6 0,1 g AEC rozpuścić w 25 ml dwumetyloformamidu. 3,35 ml roztworu AEC uzupełnić do 50 ml 0.1 M buforem octanowym ph 5,2. Roztwór przesączyć. TuŜ przed reakcją zmieszać 10 ml roztworu AEC i 10 µl 30% nadtlenku wodoru (H 2 O 2 ). G) Bufor do homogenizacji tkanki 50 mm bufor fosforanowy ph 7,0 zawierający 5 mm β- merkaptoetanol (17,5 µl/50 ml buforu) Polimeryzacja Ŝelu WYKONANIE A) Przygotowanie płytek do polimeryzacji Ŝelu: płytki odtłuścić, dokładnie wymyć i wysuszyć. ZłoŜyć razem 2 płytki (jedna krótsza), uszczelnić i spiąć ściskaczami do papieru. Ustawić pionowo. Przygotować dwa komplety płytek jeden do wykrywania aktywności peroksydazy, drugi do wybarwienia białek. B) Polimeryzacja Ŝelu rozdzielającego 8% w małej zlewce (25 50 ml) naleŝy zmieszać: 2 ml roztworu IA, 2,5 ml roztworu IB, 1,25 ml roztworu IC, 1,25 ml roztworu ID i 3 ml wody. Wszystkie składniki dobrze wymieszać i wlać ostroŝnie między dwie płytki przy pomocy pipety, do wysokości 2,5 3 cm od górnej krawędzi krótszej płytki. Na powierzchnię Ŝelu ostroŝnie nawarstwić około 100 µl wody (dostęp tlenu utrudnia polimeryzację) i całość pozostawić do spolimeryzowania (30 40 minut). Usunąć wodę znad spolimeryzowanego Ŝelu przy pomocy bibuły, uwaŝając by nie uszkodzić powierzchni Ŝelu. C) Polimeryzacja Ŝelu zagęszczającego 4% w małej zlewce (25 50 ml) naleŝy zmieszać: 0,5 ml roztworu IIA, 1,25 ml roztworu IIB, 0,625 ml roztworu IIC, 0,625 ml roztworu IID i 2 ml wody. Dokładnie wymieszać składniki i wlać mieszaninę między dwie płytki. OstroŜnie wło- Ŝyć grzebień tak aby nie pozostały pod nim pęcherzyki powietrza, a roztwór wypełnił wycięcia miedzy zębami. Pozostawić Ŝel do polimeryzacji. Próby do elektroforezy A) Homogenizacja tkanki odwaŝyć po 1 g koleoptyli owsa (etiolowanych oraz naświetlanych), zamrozić w ciekłym azocie i homogenizować w buforze do homogenizacji w stosunku 1:2 (1g tkanki:2 ml buforu). Homogenaty odwirować w mikrowirówce przez 5 min. B) Przygotowanie prób do oznaczonych probówek Eppendorfa napipetować po 200 µl odpowiedniego supernatantu po wirowaniu, dodać po 25 µl roztworu błękitu bromofenolowego zawierającego glicerol. 6

7 Elektroforeza A) Umieszczenie płytek z Ŝelem w aparacie do elektroforezy po spolimeryzowaniu Ŝelu zagęszczającego ostroŝnie wyjąć grzebień uwaŝając aby powstałe studzienki nie uległy uszkodzeniu. Płytki z Ŝelem umocować w aparacie tak aby krótsza płytka była skierowana do wewnątrz aparatu. Oba naczynia elektrodowe wypełnić buforem do elektroforezy. Sprawdzić szczelność aparatu. B) Nanoszenie prób oznaczone próby nanosić do kolejnych studzienek, podwarstwiąjąc je przy uŝyciu pipety automatycznej z kapilarną końcówką śel do wykrywania aktywności peroksydazy Studzienka 1 5 µl supernatantu z koleoptyli etiolowanych Studzienka 2 10 µl supernatantu z koleoptyli etiolowanych Studzienka 3 5 µl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę Studzienka 4 10 µl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę śel do wybarwienia białek Studzienka 1 15µl supernatantu z koleoptyli etiolowanych Studzienka 2 30 µl supernatantu z koleoptyli etiolowanych Studzienka 3 15 µl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę Studzienka 4 30 µl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę C) Warunki elektroforezy po naniesieniu prób podłączyć aparat do elektroforezy do zasilacza, włączyć zasilacz i ustawić takie napięcie aby natęŝenie prądu na jedną płytkę wynosiło około 10 ma. Po wniknięciu prób w Ŝel zwiększyć napięcie utrzymując natęŝenie nie przekraczające 20 ma. Elektroforezę naleŝy zakończyć kiedy błękit bromofenolowy znajdzie się około 0,5 cm od dolnej krawędzi Ŝelu. WYŁĄCZYĆ ZASILACZ. Wybarwianie białek w Ŝelu Płytki delikatnie podwaŝyć łopatką i rozdzielić. śel umieścić w kuwecie z roztworem barwiącym. Po 10 min barwnik zlać do butelki, nadmiar z Ŝelu wypłukać wodą, a następnie zalać 10% kwasem octowym w celu odbarwienia tła. Zmienić kilka razy roztwór odbarwiający, na koniec przepłukać wodą. Lokalizowanie izoform peroksydazy w Ŝelu Drugi Ŝel umieścić w kuwecie i zalać 50 ml roztworu AEC z nadtlenkiem wodoru. Obserwować pojawianie się prąŝków zredukowanego substratu. W odpowiednim czasie przerwać reakcję zlewając roztwór AEC i przemywając Ŝel wodą destylowaną. 7

8 OPRACOWANIE WYNIKÓW Porównać liczbę i intensywność prąŝków odpowiadających izoformom peroksydazy w ekstrakcie z koleoptyli etiolowanych i poddanych naświetleniu (analiza zymogramu). Podobnie zanalizować Ŝel barwiony na białka (proteinogram). Literatura [1] Ogita ZI, Markert CL (1979) A miniaturized system for electrophoresis on polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry 99: