Zestaw do wykrywania Chlamydia trachomatis w moczu lub w kulturach komórkowych

Transkrypt

1 Nr kat. PK15 Wersja zestawu: Zestaw do wykrywania w moczu lub w kulturach komórkowych na 50 reakcji PCR (50µl), włączając w to kontrole Detekcja oparta jest na amplifikacji fragmentu genu crp (cysteine rich protein) w układzie nested PCR. Nested PCR polega na przeprowadzeniu dwóch kolejnych reakcji PCR. W pierwszej reakcji wykorzystywana jest jedna para primerów. Powstały produkt PCR o wielkości 318 pz może, ale nie musi być wykryty w żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Ten produkt PCR stanowi jednak matrycę w następnej reakcji, gdzie stosowana jest druga para primerów, komplementarnych do miejsc wewnątrz produktu 318 pz. Tak powstaje produkt 199 pz, który dla próbki pozytywnej powinien być widoczny w żelu agarozowym. Gwarancja na ZESTAW wynosi 12 miesięcy od daty zakupu. Zalecane jest użycie dołączonej polimerazy termostabilnej TaqNova (DNA-Gdańsk). Produkt przeznaczony wyłącznie do użytku w celach badawczych. BLIRT S.A., ul. Trzy Lipy 3/1.38, Gdańsk, T: F: E: info@dnagdansk.com

2 1. SKŁAD ZESTAWU 5 probówek Master Mix PCR-OUT (na 10 reakcji PCR każda) 5 probówek Master Mix PCR-IN (na 10 reakcji PCR każda) 10 probówek mieszaniny dntps 8 mm (na 10 reakcji PCR każda) Termostabilna polimeraza DNA TaqNova (DNA-Gdańsk) Kontrola pozytywna: DNA (na 10 amplifikacji; pakowana oddzielnie) Marker DNA M (DNA-Gdańsk) o wielkościach fragmentów: 100, 200, 300, 400, 500 pz (na 20 ścieżek elektroforetycznych) 2. PRZECHOWYWANIE ZESTAWU PCR Master Mix należy przechowywać w temp. -20 C przez dłuższy okres czasu. Po rozmrożeniu mieszaninę można przechowywać w lodówce (+4 C). Należy unikać częstego zamrażania i rozmrażania próbek. Deoksynukleotydy (dntps) należy przechowywać w temp. -20 C i rozmrażać tylko bezpośrednio przed użyciem. Transport w suchym lodzie. Termostabilną polimerazę DNA należy przechowywać w temp. -20 C. Matrycowe DNA (kontrole pozytywne) należy przechowywać w temp C przez dłuższy okres czasu. Po rozmrożeniu preparat można przechowywać w lodówce (+4 C). Należy unikać częstego zamrażania i rozmrażania próbki. Marker DNA można przechowywać w temp. pokojowej lub w lodówce (+4 C). W wypadku przechowywania przez dłuższy okres zalecane jest przechowywanie w temp. -20 C, ale należy unikać częstego zamrażania i rozmrażania preparatu.

3 Nr kat. PK15 3. IZOLACJA DNA Izolacja DNA z moczu: Pobrać mocz wykorzystując pierwszy strumień moczu zawierający śluz i komórki nabłonka (około 10 ml). Zagęścić poprzez odwirowanie - 5 min, rpm w temp. pok. (oddzielenie stałych składników moczu). Zlać supernatant. Osad zawiesić w 200 µl H 2O i przenieść do probówki Eppendorfa. Odwirować. Osad zawiesić w 100 µl TE, a następnie postępować wg protokołu dołączonego do polecanego przez nas zestawu do izolacji DNA: ISOLATE Genomic DNA Mini Kit (BIO-52031, BIO-52032, BIO-52033). Izolacja DNA z kultur komórkowych Postępować dokładnie wg protokołu do izolacji DNA z linii komórkowych dołączonego do polecanego przez nas zestawu do izolacji DNA - ISOLATE Genomic DNA Mini Kit (BIO-52031, BIO-52032, BIO-52033). 4. PRZYGOTOWANIE WSTĘPNEJ REAKCJI PCR (PCR-OUT) Należy pamiętać o zwirowaniu probówek z odczynnikami po rozmrożeniu, tak aby całość mieszaniny znalazła się na dnie probówki!!! Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej dla 1 próbki badanej: 42,5 µl Master Mix PCR-OUT 2 µl DNA (otrzymanego wg protokołu pkt. 3) Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej kontroli pozytywnej: 42,5 µl Master Mix PCR-OUT 2 µl DNA kontroli pozytywnej Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej kontroli negatywnej: 42,5 µl Master Mix PCR-OUT 2 µl jałowej wody

4 Warunki amplifikacji 2 min 94 C (wstępna denaturacja) 30 s 94 C (denaturacja) 60 s 50 C (dołączanie primerów) 60 s 72 C (elongacja) 2 min 72 C (wydłużanie końcowe) x 35 cykli Uwagi: Układ jest bardzo czuły, ale przez to niezmiernie wrażliwy na kontaminacje (patrz strona 8). Aby ograniczyć liczbę błędów, należy w każdym badaniu uwzględnić zarówno kontrole negatywne, jak i pozytywne prawidłowości przebiegu reakcji amplifikacji DNA. Kontrola negatywna (ujemna) reakcji PCR jest to próbka poddana PCR, która nie zawiera w swoim składzie DNA matrycowego. Kontrola pozytywna (dodatnia) reakcji PCR jest to próbka zawierająca w swoim składzie DNA kontrolne właściwej matrycy, dająca po amplifikacji specyficzny produkt reakcji. W przypadku większej ilości oznaczeń należy pomnożyć ilości µl składników PCR Master Mix, deoksynukleotydów i polimerazy DNA przez liczbę wykonywanych prób plus jedna. Np.: dla 9 próbek (7 próbek klinicznych, 1x kontrola pozytywna oraz 1x kontrola negatywna) należy przygotować mieszaninę reakcyjną w następujący sposób: do probówki typu Eppendorf dodać: 42,5 µl 10 (9+1) = 425 µl Master Mix PCR-OUT 5 µl 10 (9+1) = 50 µl mieszaniny 8mM dntps 0,5 µl 10 (9+1) = 5 µl polimerazy DNA TaqNova Wymieszać tipsem, rozporcjować po 48 µl do 9 wcześniej przygotowanych probówek reakcyjnych. Można zastosować każdy rodzaj komercyjnie dostępnej termostabilnej polimerazy DNA, jednakże rekomendowana jest polimeraza DNA TaqNova produkowana przez firmę DNA-Gdańsk.

5 Nr kat. PK15 5. DETEKCJA PRODUKTÓW AMPLIFIKACJI PCR-OUT Próbki poddawane elektroforezie agarozowej (2% żel, standardowe warunki elektroforezy): 1. 2 µl barwnika (polecamy 6xGreen - AG18, 6xOrange - AG17, 6xBlue AG16, 6xViolet AG18) i 10 µl markera DNA M µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR badanej próbki 3. 2 µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli pozytywnej 4. 2 µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli negatywnej Interpretacja wyników: W wypadku obecności w żelu produktu PCR o wielkości 318 pz wynik testu jest pozytywny. Nie należy w tym wypadku przeprowadzać reamplifikacji PCR-IN (wskutek dużego stężenia produktu PCR reamplifikacja prawdopodobnie nie powiedzie się). Można ewentualnie przeprowadzić reamplifikację, ale w tym przypadku produkt PCR (stanowiący matrycę do następnej reakcji) należy rozcieńczyć, co najmniej 10 razy. Jeżeli sygnał po pierwszej reakcji jest bardzo słaby należy przeprowadzić reakcję reamplifikacji dla potwierdzenia wyniku.

6 6. PRZYGOTOWANIE REAKCJI REAMPLIFIKACJI (PCR-IN) Należy pamiętać o zwirowaniu probówek z odczynnikami po rozmrożeniu, tak aby całość mieszaniny znalazła się na dnie probówki!!! Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej dla 1 próbki badanej: 42,5 µl Master Mix PCR-IN 2 µl produktu PCR-OUT Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej kontroli pozytywnej: 42,5 µl Master Mix PCR-IN 2 µl produktu PCR-OUT kontroli pozytywnej Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej kontroli negatywnej: 42,5 µl Master Mix PCR-IN 2 µl jałowej wody Warunki amplifikacji 2 min 94 C (wstępna denaturacja) 30 s 94 C (denaturacja) 60 s 50 C (dołączanie primerów) 60 s 72 C (elongacja) 2 min 72 C (wydłużanie końcowe) x 35 cykli Uwagi: Układ jest bardzo czuły, ale przez to niezmiernie wrażliwy na kontaminacje (patrz strona 8). Aby ograniczyć liczbę błędów, należy w każdym badaniu uwzględnić zarówno kontrole negatywne, jak i pozytywne prawidłowości przebiegu reakcji amplifikacji DNA. Kontrola negatywna (ujemna) reakcji PCR jest to próbka poddana PCR, która nie zawiera w swoim składzie DNA matrycowego. Kontrola pozytywna (dodatnia) reakcji PCR jest to próbka zawierająca w swoim składzie DNA

7 Nr kat. PK15 kontrolne właściwej matrycy, dająca po amplifikacji specyficzny produkt reakcji. W przypadku większej ilości oznaczeń należy pomnożyć ilości µl składników PCR Master Mix, deoksynukleotydów i polimerazy DNA przez liczbę wykonywanych prób plus jedna. Np.: dla 9 próbek (7 próbek klinicznych, 1x kontrola pozytywna oraz 1x kontrola negatywna) należy przygotować mieszaninę reakcyjną w następujący sposób: do probówki typu Eppendorf dodać: 42,5 µl 10 (9+1) = 425 µl Master Mix PCR-IN 5 µl 10 (9+1) = 50 µl mieszaniny 8mM dntps 0,5 µl 10 (9+1) = 5 µl polimerazy DNA TaqNova Wymieszać tipsem, rozporcjować po 48 µl do 9 wcześniej przygotowanych probówek reakcyjnych. Można zastosować każdy rodzaj komercyjnie dostępnej termostabilnej polimerazy DNA, jednakże rekomendowana jest polimeraza DNA TaqNova produkowana przez firmę DNA-Gdańsk. 7. DETEKCJA PRODUKTÓW AMPLIFIKACJI PCR-IN Próbki poddawane elektroforezie agarozowej (2% żel, standardowe warunki elektroforezy): 5. 2 µl barwnika (polecamy 6xGreen - AG18, 6xOrange - AG17, 6xBlue AG16, 6xViolet AG18) i 10 µl markera DNA M µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR badanej próbki 7. 2 µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli pozytywnej 8. 2 µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli negatywnej Wynik pozytywny testu: obecność w żelu produktu reakcji PCR o wielkości par zasad. Wynik negatywny testu: brak w żelu produktu reakcji PCR o wielkości par zasad.

8 8. ZAPOBIEGANIE KONTAMINACJOM Niewątpliwym zabezpieczeniem przed kontaminacją jest specjalna organizacja pracy. Zaleca się każdy z trzech etapów oznaczenia: izolację matryc (pre-pcr), przygotowanie reakcji PCR oraz amplifikację wraz z elektroforezą produktów PCR (post-pcr) prowadzić w oddzielnych pomieszczeniach (ewentualnie w różnych oddzielonych częściach pomieszczenia). Szczególnie należy zwrócić uwagę na produkty PCR z poprzednich oznaczeń - one stanowią najbardziej niebezpieczne źródło kontaminacji. Nigdy nie należy przechowywać lub pracować z próbkami pozytywnymi kontrolnego DNA w pomieszczeniu pre-pcr. Należy zawsze pracować w fartuchach i używać jednorazowych rękawiczek. Do przygotowania reakcji PCR najlepiej używać pipet, które są autoklawowalne (co pewien czas należy je autoklawować). Zaleca się także używanie tipsów z filtrami. Najlepiej stosować oddzielne pipety do każdego etapu oznaczenia (izolacja, przygotowanie mieszaniny reakcyjnej, dodawanie matryc, nanoszenie na żel agarozowy). Zalecane jest nastawianie reakcji PCR pod wyciągiem laminarnym. Wskazana jest 30-minutowa sterylizacja pustych probówek reakcyjnych, statywów, pipet i tipsów pod lampą UV przed dodaniem mieszanin reakcyjnych. Należy pamiętać, aby nie naświetlać roztworów zawierających DNA, Master Mix, dntps i polimerazy. Należy przestrzegać zasady, że tylko jedna probówka może być otwarta w danym momencie. Dzięki temu zmniejsza się ryzyko przenoszenia kontaminacji przez powietrze. Ponadto należy unikać dotykania krawędzi probówek. Kontrolę negatywną najlepiej dodawać jako pierwszą, kontrolę pozytywną jako ostatnią. Poważnym źródłem zanieczyszczeń może być autoklaw, szczególnie gdy jest on stosowany do sterylizacji komórkowego materiału hodowlanego. Stąd, zalecane jest stosowanie osobnego autoklawu przeznaczonego tylko do sterylizacji wyposażenia i roztworów potrzebnych do czynności pre-pcr. Należy wykonać próbę, gdzie w miejsce matrycy dodajemy jałową wodę (PCRgrade) kontrola negatywna. Wynik negatywny wskazuje, że zestaw nie został skontaminowany. Po rozdziale elektroforetycznym, w kontroli negatywnej nie mogą nigdy pojawić się prążki o wielkości 318 i 199 pz. Jeśli się pojawią zalecane jest powtórzenie oznaczeń. Należy starannie nanosić próbki na żel, aby produkt PCR z próby pozytywnej nie przepłynął do ścieżki kontroli negatywnej.