CHROMATOGRAFIA ADSORPCYJNA I PODZIAŁOWA. 1. Rozdział barwników roślinnych metodą chromatografii adsorpcyjnej (techniką kolumnową)

Transkrypt

1 Ćwiczenie nr 7 CHROMATOGRAFIA ADSORPCYJNA I PODZIAŁOWA 1. Rozdział barwników roślinnych metodą chromatografii adsorpcyjnej (techniką kolumnową) Zasada: Barwniki roślinne charakteryzują się różnym powinowactwem adsorpcyjnym do fazy stałej w układzie chromatograficznym. Wynika to z różnej masy, budowy przestrzennej i obecności różnych grup funkcyjnych w cząsteczkach poszczególnych barwników. Odczynniki: tlenek glinu (Al 2 O 3 ) skrobia natka pietruszki heksan metanol woda destylowana Materiały i sprzęt: kolumna szklana o długości 30 cm rozdzielacz moździerz porcelanowy cylinder miarowy lejek szklany zlewka bagietka szklana wata linijka łyżka Wykonanie: 1) Przygotowanie kolumny na dnie kolumny umieścić zwitek waty ( ubić za pomocą bagietki szklanej) upakować ustawioną pionowo kolumnę: w tym celu należy (używając lejka i łyżki) nasypać do kolumny poszczególne składniki złoża, równocześnie delikatnie ostukując kolumnę bagietką, co spowoduje ciasne ułożenie ziaren. Kolejne składniki złoża: około 5-centymetrowa warstwa tlenku glinu około 20-centymetrowa warstwa skrobi upakowana na warstwie tlenku glinu złoże zamknąć niewielkim zwitkiem waty wysycić upakowaną kolumnę heksanem (stanowiącym fazę ruchomą): w tym celu podłączyć kolumnę do pompki wodnej i następnie wlewać na wierzch złoża heksan, utrzymując jego około 1-centymetrową warstwę 2) Przygotowanie ekstraktu barwników rozetrzeć dokładnie w moździerzu natkę pietruszki dodać 20 cm 3 heksanu i 5 cm 3 metanolu i dalej rozcierać

2 uzyskaną mieszaninę roztwór barwników roślinnych umieścić w rozdzielaczu, dodać 20 cm 3 wody destylowanej i wytrząsać (około 5 minut pamiętając o odpowietrzaniu), a następnie pozostawić do wyraźnego rozdzielenia się warstw dolną mętną warstwę wodną odrzucić (zlać do zlewki otwierając dolny kurek) dwukrotnie przemyć heksanowy ekstrakt barwników roślinnych wodą destylowaną (20 cm 3 wody destylowanej umieścić ponownie w rozdzielaczu, wytrząsać, pozostawić do wyraźnego rozdzielenia się warstw i odrzucić dolną warstwę wodną) górną ciemnozieloną, klarownej warstwę heksanową należy przelać (przez górny otwór rozdzielacza) do zlewki, uważając, by nie dostały się do niej również mętne zanieczyszczenia 3) Rozdział barwników roślinnych na wysyconą heksanem kolumnę nanieść przygotowany heksanowy roztwór barwników roślinnych Schemat rozdziału barwników roślinnych chlorofil b chlorofil a ksantofil SKROBIA karoteny Al 2 O 3

3 2. Rozdział węglowodanów metodą chromatografii podziałowej (techniką planarną cienkowarstwową) Zasada: Rozdzielane węglowodany różnią się współczynnikami podziału pomiędzy dwie nie mieszające się ze sobą fazy ciekłe: wodę (osadzoną na nośniku fazę stałą) i aceton (fazę ruchomą). Odczynniki: Materiały i sprzęt: 1% roztwory węglowodanów (roztwory wzorcowe i mieszanina) układ rozwijający: mieszanina acetonu i wody roztwór wywołujący: mieszanina aldehydu anyżowego, etanolu, kwasu siarkowego, kwasu octowego płytka szklana pokryta cienką warstwą krzemionki (nośnik) komora chromatograficzna bibuła pipeta automatyczna suszarka do włosów piec spryskiwacz minutnik ołówek linijka igła Wykonanie: 1) Przygotowanie płytki chromatograficznej i przeprowadzenie rozdziału w odległości około 1,5 centymetra od dolnej krawędzi płytki szklanej delikatnie (nie uszkadzając podłoża), za pomocą ołówka i linijki, zaznaczyć linię startową posługując się linijką i igłą zaznaczyć na linii startowej miejsca nałożenia próbek analizowanych cukrów (równomiernie rozmieścić je na linii startowej) za pomocą pipety automatycznej nanosić na linię startową kolejno poszczególne roztwory węglowodanów, tak aby uzyskać plamki o średnicy 2-3 mm po naniesieniu wszystkich roztworów cukrów, wysuszyć plamki suszarką i ponownie w te same miejsca nanieść poszczególne roztwory węglowodanów (czynności te powtórzyć jeszcze 2-3-krotnie) 2) Przygotowanie komory chromatograficznej i przeprowadzenie rozdziału węglowodanów dno komory wyłożyć bibułą wlać do komory przygotowaną mieszaninę acetonu z wodą - uzyskując około 1-centymetrową warstwę układu rozwijającego płytkę (z naniesionymi roztworami i dokładnie wysuszoną) umieścić w komorze chromatograficznej linią startową w dół i następnie szczelnie zamknąć komorę płytkę pozostawić w komorze chromatograficznej na około minut (rozwijanie chromatogramu)

4 3) Wywołanie chromatogramu i obliczenia wyjąć płytkę z komory i natychmiast zaznaczyć ołówkiem czoło rozpuszczalnika po wysuszeniu płytki suszarką, należy spryskać ją roztworem wywołującym (pod digestorium) umieścić płytkę w piecu o temperaturze około C na 5-10 minut zaznaczyć środek geometryczny każdej wywołanej plamki odpowiadającej poszczególnym węglowodanom za pomocą linijki zmierzyć odległość środka każdej plamki od linii startowej (a) oraz odległość czoła rozpuszczalnika od linii startu (A) wyznaczyć współczynniki R f dla każdej plamki chromatogramu według wzoru: R f = odległość środka plamki danej substancji od linii startu (a) odległość czoła rozpuszczalnika od linii startu (A) na podstawie uzyskanych wartości R f zidentyfikować węglowodany wchodzące w skład mieszaniny CZOŁO A a ` START Wzorce węglowodanów Badana mieszanina węglowodanów

5 Współczynnik opóźnienia R f (ang. retardation factor), określany również mianem czasu retencji, jest parametrem stosowanym do opisu zjawisk zachodzących w warstwie chromatograficznej. Jest on wielkością stałą, charakterystyczną dla danej substancji w określonych warunkach rozdziału. Wartość R f, podobnie jak i innych parametrów retencji, uzależniona jest od rodzaju analitu, rodzaju fazy stacjonarnej i ruchomej. Zawiera się ona w przedziale od 0 do 1, przy czym: R f = 0 oznacza, że rozdzielane substancje w zastosowanym układzie chromatograficznym zbyt silnie oddziaływują z fazą nieruchomą i praktycznie nie znajdują się w fazie mobilnej, R f = 1 oznacza, że substancje wędrują z czołem rozpuszczalnika, brak jest natomiast ich oddziaływań z fazą nieruchomą. Przyjmuje się, że optymalna wartość R f, przy której warunki rozdziału chromatograficznego są najbardziej stabilne, powinna zawierać się w przedziale 0,2 0,8. Wartość R f obliczona dla każdego wzorca węglowodanowego stanowi podstawę do jego identyfikacji w mieszaninie cukrów. PIŚMIENNICTWO 1. Bober J., Chlubek D., Dołęgowska B.: Przewodnik do zajęć z chemii medycznej dla studentów I roku PAM. Wydawnictwo Pomorskiej Akademii Medycznej; Materiały do ćwiczeń laboratoryjnych z chemii organicznej dla studentów biologii. Red.A.Jarczewski. Wydanie II poprawione i uzupełnione. Poznań; Kealey D., Haines P.J.: Krótkie wykłady. Chemia analityczna. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN; Kędryna T.: Chemia ogólna z elementami biochemii dla studentów kierunków medycznych i przyrodniczych. Wydawnictwo Zamiast Korepetycji. Kraków; 2001.