bi ~ Zestaw dydal<tyczny umożliwiający przeprowadzenie izolacji genomowego DNA z bakterii EasyLation Genomie DNA INSTRUI<CJA DLA STUDENTÓW

Transkrypt

1 Zestaw dydaktyczny EasyLation Genomie DNA Nr kat. DY80 Wersja zestawu: Zestaw dydal<tyczny umożliwiający przeprowadzenie izolacji genomowego DNA z bakterii INSTRUI<CJA DLA STUDENTÓW OPIS Proponowany zestaw dydaktyczny ma na celu zapoznanie studentów z metodą izolacji oraz oczyszczania genomowego DNA z bakterii Eschericia coli. Genomowe DNA oczyszczane jest z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże krzemionkowe, wydajnie i selektynie wiążące DNA. Zastosowanie odpowiednich buforów płuczących pozwala na usunięcie zanieczyszczeń il lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Izolaty poddawane są następnie elektroforezie w żelu agarozowym w celu porównania wydajności izolacji oraz czystości otrzymanych preparatów DNA z wzorcowym genomowym DNA E. coli. Sugerujemy przeprowadzenie ćwiczenia laboratoryjnego w sześciu dwuosobowych grupach studenckich. GWARANCJA Gwarancja na zestaw dydaktyczny Easylation Genomie DNA wynosi 6 miesięcy. bi ~ GOAJ'ISK BURT S.A.. ul. Trzy Lipy 3/1.38, Gdańsk, T: F: E:info@dnagdansk.com

2 1. PRZEBIEG ĆWICZENIA A. IZOLACJA GENOMOWEGO DNA PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. LiofiLizat Proteinase K należy rozpuścić w 200 IJL buforu do Proteinazy K (Proteinase Buffer) & Po zawieszeniu Proteinazy K w buforze, enzym należy przechowywać w -20 (. 3. LiofiLizat RNase A należy rozpuścić w 100 IJLbuforu do RNazy (RNase Buffer) & RNaza A w roztworze przechowywana w temp. +4 C zachowuje całkowitą aktywność przez 2-3 tygodnie. JeśLi wymagane jest przechowywanie RNazy A przez dłuższy okres czasu zaleca się rozporcjowanie roztworu RNAzy A i przechowywanie w -20 (. 4. W przypadku wytrącenia osadu w buforach, probówki z roztworem należy ogrzać do temperatury 3rC (BacW Buffer) Lub temp C (pozostałe roztwory) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 5. Nagrzać termoblok Lubłażnię wodną do temp. 3rC i 55 (. 6. Można ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70 (.

3 Nr kat. DY80 IZOLACJA DNA 1. Osad z 1.5 ml hodowli bakteryjnej Escherichia coli dokładnie zawiesić w 300 ~l BacLBuffer. 2. Dodać 4 ~l RNase A i wymieszać przez worteksowanie. 3. Inkubować 10 minut w temperaturze 37 oc. 4. Dodać 10 ~l Proteinase K i wymieszać przez worteksowanie. 5. Inkubować 10 minut w temperaturze 55 oc. 6. Dodać 350 ~l BacBBuffer i dokładnie wymieszać. 7. Inkubować kolejne 5 min w temp. 55 oc. 8. Po inkubacji próbkę intensywnie worteksować przez 15 s. 9. Wirować 2 min przy tys. rpm. (11-15 tys. x g). 10. Nie naruszając osadu delikatnie przenieść supernatant do minikolumny ze złożem, umieszczonej w probówce odbierającej wirować 1 min przy tys. rpm (11-15 tys. x g) 11. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml). 12. Dodać do minikolumny 600 ~l buforu płuczącego BacW Buffer i wirować 30 s przy tys. rpm (11-15 tys. x g). 13. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej ponownie minikolumnę. 14. Dodać do minikolumny 400 pt BacW Buffer i wirować 30 s przy tys. rpm (11-15 tys. x g). 15. Wyjąć minikolumnę. wylać przesącz i umieścić ponownie w probówce odbierającej. 16. Wirować 2 min przy tys. rpm (15-21 tys. x g). 17. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieści ją w jałowej probówce 1.5 ml typu Eppendorf. & Bufor płuczący Wash Buffer zawiera alkohol. który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych. dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. 18. Nanieść 100 ~l buforu elucyjnego Elution Buffer podgrzanego do 70 0 ( centralnie na złoże krzemionkowe w mini kolumnie. Nw.dnagdansk.com. t.!& ~ r GOANSK

4 19. Inkubować minikolumnę z buforem przez 2 min w temp. pokojowej. 20. Wirować 1 min przy tys. rpm (11-21 tys. x g). 21. Minikolumnę usunąć. a wyizolowane DNA przechowywać w +4 ( Lub-20 0 ( do czasu dalszych analiz. B. PRZYGOTOWANIE 1% ŻELI AGAROZOWYCH UWAGA!!! Wszystkie operacje należy wykonywać w rękawiczkach nitrylowych. stanowiących ochronę przed bromkiem etydyny (czynnik rakotwórczy). 1. Należy przygotować lx stężony bufor TAE poprzez 50-krotne rozcieńczenie buforu 50x TAE. Na przykład dla przygotowania 1000 ml buforu lx TAE należy do naczynia o odpowiedniej wielkości nalać 20 ml 50x TAE i 980 ml wody. 2. Następnie 0.5 g agarozy należy rozpuścić w 50 ml buforu lx TAE. Do kolbki wsypujemy odmierzoną ilość agarozy. zalewamy buforem lx TAE. i następnie podgrzewamy w mikrofalówce lub nad palnikiem laboratoryjnym. Gdy roztwór zacznie wrzeć. należy zamieszać kolbką i sprawdzić. czy agaroza rozpuściła się całkowicie (roztwór powinien być klarowny). 3. Po schłodzeniu roztworu żelu do temp. około 70 0 ( należy dodać 5 ~l roztworu bromku etydyny o stężeniu 1 mg/ml i dokładnie wymieszać. 4. Wylać zawartość kolbki do tacki do wylewania żeli z osadzonym odpowiednio grzebieniem lub grzebieniami. Należy zwrócić uwagę. aby w żelu nie było pęcherzyków powietrza (można je usunąć np. przy pomocy tipsa). Gdy żel jest za bardzo schłodzony i zaczyna polimeryzować w kolbce. należy rozpuścić go ponownie. 5. Po zastygnięciu żelu należy wyjąć grzebienie w taki sposób. aby nie uszkodzić studzienek. Wstawić żel do komory aparatu do elektroforezy poziomej i zalać buforem lx TAE. aby całkowicie wypełnit komory elektrodowe i pokrył powierzchnię żelu.

5 Nr kat. DY80 C. ELEKTROFOREZA AGAROZOWA GENOMOWEGO DNA. ~ RozdziaŁ elektroforetyczny należy prowadzić w 1% żelu agarozowym ~ Uzyskane preparaty bakteryjnego gdna należy nanosić za pomocą pipety do studzienek żelu. w następujący sposób: pl buforu obciążającego 6x Green i 5 pl wzorcowego genomowego DNA Escnerlenia coli pl buforu obciążającego 6x Green i 5 ~l wyizolowanego genomowego DNA. ~ RozdziaŁ elektroforetyczny należy prowadzić przez h. przy napięciu 8-10 V/cm długości żelu ( v), ~ Należy zwrócić uwagę. aby odpowiednio podłączyć elektrody do zasilacza. DNA migruje od elektrody (-l do elektrody (+l. Bromek etydyny migruje w odwrotnym kierunku. dlatego podczas długiego czasu prowadzenia elektroforezy zaczyna wychodzić z żelu. w konsekwencji czego w dolnej części żelu prążki DNA są coraz mniej widoczne. ~ MaŁe fragmenty DNA poruszają się szybciej niż większe. których ruch jest silniej hamowany przez plątaninę włókien agarozy tworzących żel. Szybkość. z jaką przesuwa się w żelu cząsteczka DNA jest odwrotnie proporcjonalna do jej masy cząsteczkowej. Dodany barwnik (najczęściej bromek etydynyl także migruje i jego ruch pozwala na śledzenie przebiegu elektroforezy. Barwnik ten. po związaniu z DNA fluoryzuje w świetle UV. ~ Po zakończonej elektroforezie żel należy analizować w świetle UV transiluminatora. D A bł- GDAŃSK