Kierunek Biotechnologia Biotechnologia w utylizacji odpadów stałych od 2014 Enzymatyczna hydroliza skrobi

Transkrypt

1 Enzymy hydrolizujące skrobie Oprócz celulozy skrobia jest głównym polisacharydem pochodzenia roślinnego. Z przemysłowego punktu widzenia istotne znaczenie maja przede wszystkim produkty jej hydrolizy umożliwiające produkcje syropów glukozowych, dekstryn, cyklodekstryn, glukozy (krystalicznej i zestalonej) i innych produktów wykorzystywanych głównie w przemyśle spożywczym. Stosowana do niedawna kwasowa hydroliza skrobi wraz z postępem w dziedzinie biotechnologii coraz częściej ustępuje miejsca procesom enzymatycznym. Enzymy stosowane do hydrolizy skrobi podzielić można na 5 grup: endoamylazy, egzoamylazy, enzymy usuwające rozgałęzienia, izomerazy oraz glikozylotransferazy cyklodekstryn (Rysunek 2). Endoamylazy α-amylaza Enzymy z tej grupy umożliwiają hydrolizę wiązań α-1,4-glikozydowych zarówno w amylozie jak amylopektynie a nie są aktywne w stosunku do wiązań α-1,6- (np. w amylopektynie). Produktami hydrolizy w tym przypadku są oligosacharydy posiadające konfiguracje α przy węglu C1. Enzymy te działają w środku łańcucha polimerowego co powoduje gwałtowny spadek lepkości hydrolizowanego kleiku skrobiowego. Znane są dwa rodzaje α-amylazy: termostabilna i termolabilna. α-amylaza termostabilna jest enzymem pochodzenia bakteryjnego. Enzym ten w przypadku pochodzenia ze szczepu Bacillus subtilis wykazuje optimum temperaturowe pomiędzy 65 a 70 o C w obecności jonów wapnia, i ze względu na swoja niska stabilność nie jest stosowana w zastosowaniach komercyjnych. α-amylaza pochodząca ze szczepu Bacillus licheniformis (Rysunek 3.) jest natomiast aktywna i stabilna w temperaturach powyżej 90 o C, a dodatkowo jej aktywność w znacznie mniejszym stopniu zależny od obecności jonów Ca 2+ oraz stosowanego ph. Działanie opisywanego enzymu sprowadza się głównie do generowania z łańcucha polisacharydowego jednostek zawierających 5 jednostek glukozowych. Powoduje to, ze szybkość hydrolizy jest bardzo wysoka na początku procesu a potem wraz z postępem reakcji spada. Na dalszych etapach procesu generowane są jednostki o mniejszej liczbie merów. Termolabilne α-amylazy są enzymami pochodzenia grzybowego. Produktami hydrolizy skrobi w tym przypadku są: maltoza i maltotrioza. Enzymy pochodzenia grzybowego wykazują większa w porównaniu do swoich bakteryjnych odpowiedników odporność na zmiany ph środowiska reakcji. Egzoamylazy Enzymy z grupy egzoamylaz dzielą się na układy działające z wytworzeniem glukozy lub maltozy. γ-amylaza Glukoamylaza zwana także γ-amylazą umożliwia wysoce efektywna reakcje hydrolizy wiązań α- 1,4-glikozydowych z wytworzeniem glukozy jako produktu końcowego. Atak enzymu rozpoczyna się na nieredukującym końcu łańcucha polimerowego a powstająca glukoza posiada konfigurację β. Enzym ten działa na skrobie odcinając po jednej jednostce glukozowej, aż do miejsca rozgałęzienia. Hydroliza wiązań 1,6-glikozydowych z udziałem glukoamylazy również jest możliwa choć proces ten przebiega z bardzo niską szybkością. W przypadku wysokich stężeń glukozy lub enzymu możliwa jest także podobnie jak w przypadku hydrolizy kwasowej reakcja repolimeryzacji (rewersji) glukozy z wytworzeniem maltozy i izomaltozy. Glukoamylaza charakteryzuje się dużą odpornością na zmiany ph (stabilność w zakresie 1,8-8,8 dla enzymu z Aspergillus niger oraz 1,8-10,5 dla układu pochodzącego z Aspergillus awamori) (Rysunek 4). Enzym ten najwyższą aktywność przejawia przy ph z zakresu 4,0-5,6 w temperaturze o C. Odwrotnie niż w przypadku α-amylazy jony Ca 2+ wykazują inhibicyjne działanie na proces enzymatycznej hydrolizy z udziałem glukoamylazy. β-amylaza β-amylaza jest enzymem działającym na skrobię z wytworzeniem maltozy jako produktu finalnego. Głównym źródłem tego enzymu są zboża takie jak: pszenica i jęczmień oraz soja. Znane są jednak także bakteryjne źródła β-amylazy. β-amylaza umożliwia degradacje łańcuchów amylozy i amylopektyny poprzez hydrolizę wiązań α-1-4- glikozydowych pomiędzy drugą a trzecią jednostką glukozową licząc od nieredukującego końca łańcucha. Wytworzona w ten sposób maltoza jest beta-anomerem. Ponieważ enzym ten nie umożliwia hydrolizy wiązań 1,6-glikozydowych

2 produktami hydrolizy skrobi z jego udziałem są maltoza (w przypadku amylozy) oraz mieszanina oligosacharydów o różnym stopniu rozgałęzienia, tzw. dekstryny graniczne (dla amylopektyny). Optimum kwasowości środowiska reakcji dla tego enzymu wynosi około 5 a optymalna temperatura działania o C. Jeśli chodzi o budowę enzymu to w odróżnieniu od innych enzymów hydrolitycznych skrobi beta-amylaza nie zawiera w centrum aktywnym jonów metali a jedynie grupy merkaptanowe (-SH). Wszystkie beta-amylazy tracą swoja aktywność w obecności takich związków jak HgCl 2, AgNO 3 oraz jodu. Enzymy usuwające rozgałęzienia α, β i γ-amylazy to enzymy które bądź to są nieaktywne w stosunku do wiązań 1,6-glikozydowych bądź tez reakcja hydrolizy tych wiązań zachodzi przy ich udziale z niezadawalającą szybkością. Enzymy usuwające rozgałęzienia działają natomiast selektywnie właśnie na wiązania α-1,6-glikozydowe w łańcuchach polisacharydowych, umożliwiając pełniejsza hydrolizę skrobi. Najważniejszymi przedstawicielami tej grupy są pullulanaza oraz izoamylaza. Izoamylaza, glikogen 6-glukanohydrolaza. Izoamylaza podobnie jak opisywana wyżej pullulanaza jest enzymem umożliwiającym hydrolizę rozgałęzień łańcuchów polisacharydowych oraz dekstryn granicznych wszędzie tam, gdzie występują wiązania 1,6-glikozydowe. W odróżnieniu od pullulanazy izoamylaza nie hydrolizuje jednak wiązań 1,6- w pullulanie lecz w glikogenie. Enzym ten nie jest aktywny w stosunku do polisacharydów liniowych, nierozgałęzionych. Najczęściej enzym ten pozyskuje się z takich szczepów bakterii jak: Bacillius amyloliquefaciens, Escherichia coli, Flavobacterium odoratum, Pectobacterium chrysanthemi, Pseudomonas amylodermosa (Rysunek 6). Pullulanaza, pullulan-6-glukanohydrolaza. Enzym ten umożliwia usuniecie rozgałęzień zarówno amylopektyny jak i amylozy. Efektem finalnym jego działania są oligo- i poli- sacharydy o stopniu polimeryzacji z zakresu Enzym ten jest z reguły stosowany w kombinacji z α, β lub γ- amylazami. Optimum temperaturowe dla pullulanazy wynosi ok 60 o C. Chociaż enzym ten zidentyfikowano w takich roślinach jak: bawełna, ryż i szpinak to jednak w celach przemysłowych izoluje się go głównie ze szczepów bakterii (np. Bacillus stearothermophilus). Pullulanaza umożliwia hydrolizę wiązań 1,6- glikozydowych jedynie gdy wiązanie to scala łańcuchy polisacharydowe połączone wiązaniem 1,4-glikozydowym (np. w pullulanie stąd nazwa). W zależności od zdolności pollulanazy do hydrolizy oprócz wiązań 1,6-, takze układów 1,4- rozróżnia się dwa typy pollulanaz: I (nieaktywne w hydrolizie wiązań 1,4-) i II (aktywne w hydrolizie wiązań 1,4-). Działanie obu wymienionych enzymów na skrobie (amylopektyne) jest natomiast zbliżone. Opisane enzymy nie wyczerpują wszystkich możliwości enzymatycznej hydrolizy skrobi. Jednak to α, β i γ- amylaza wraz z pullulanaza i izoamylaza maja największe znaczenie przemysłowe. Przemysłowe zastosowanie hydrolizy enzymatycznej skrobi. Metoda enzymatycznej hydrolizy skrobi umożliwia otrzymywanie szerokiej gamy modyfikator skrobiowych z dużą wydajnością i efektywnością. Spośród produktów o największym tonażu wyróżnia się produkcję: syropów skrobiowych, maltodekstryn, syropu glukozowego i glukozy krystalicznej oraz syropów maltozowych a po dalszej przeróbce także takich nowoczesnych produktów jak syropy o wysokiej zawartości fruktozy. Produkcja maltodekstryn. Produkcja maltodekstryn przebiega zgodnie ze Rysunkiem 7. Przygotowana suspensja skrobi w wodzie jest zakwaszana do ph odpowiedniego dla zastosowanego enzymu a następnie uzupełniana o jony wapnia oraz pierwsza porcje enzymu. Tak otrzymana zawiesina poddawana jest działaniu wysokiej temperatury, co z jednej strony ułatwia szybkie skleikowanie skrobi z drugiej jednak powoduje inaktywacje części dodanego enzymu. Po skleikowaniu mieszanina reakcyjna jest ochładzana do właściwej temperatury pracy enzymu oraz uzupełniana o kolejną jego porcje. Po zakończeniu procesu, czyli osiągnieciu wartości DE w zależności od zakładanego stopnia hydrolizy enzym jest inaktywowany poprzez zakwaszenie środowiska oraz podwyższenie temperatury a otrzymany syrop poddawany filtracji i oczyszczaniu na węglu aktywnym. Maltodekstryny charakteryzują się miedzy innymi takimi właściwościami jak: niska higroskopijność, wysoka lepkość, a także bardzo niska słodkość (w sensie sensorycznym) oraz własności hamujące wzrost kryształów w takich substancjach spożywczych jak lody. Implikuje to ich szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym (produkcja lodów i cukierków) i farmaceutycznym (powlekanie tabletek i produkcja syropów). Ponadto ze względu na skłonność do kapsułkowania aromatów wykorzystywane być mogą do ochrony związków małocząsteczkowych (np. aromatów żywności, składników leków itp.) przed utlenianiem. Nowoczesne zastosowania maltodekstryn w przemyśle spożywczym skupiają się na stosowaniu ich jako zamienników tłuszczy, odzywkach dla sportowców oraz środkach spożywczych dla niemowląt.

3 Produkcja syropów glukozowych/glukozy krystalicznej. Produkcja syropów glukozowych metoda enzymatyczna jest procesem wielostopniowym (Rysunek 8). Etapy wstępne, a wiec otrzymywanie suspensji skrobi oraz jej kleikowanie są identyczne z procesem otrzymywania maltodekstryn podobnie jak wstępne upłynnienie kleiku skrobiowego przy użyciu α- amylazy. Kolejnym etapem procesu jest w przypadku syropów glukozowych scukrzanie upłynnionej skrobi aż do wartości DE ok 95 w celu otrzymania maksymalnej wydajności glukozy. Wartość graniczna DE = ok. 95 wynika z możliwej reakcji repolimeryzacji glukozy przy wysokich jej stężeniach w obecności amyloglukozydazy. Kolejne etapy procesu obejmują oczyszczanie produktu (usuwanie białek i tłuszczy), dekoloryzacje (na węglu aktywnym) oraz usuwanie składników mineralnych (kolumny jonowymienne). Syropy glukozowe produkowane metoda enzymatyczna zawierają 94-98% glukozy, 1-3% maltozy, 0,3-0,5% maltotriozy i do 2% wyższych polisacharydów. Syropy te wykorzystywane są w procesach biotechnologicznych bez udziału drożdży (produkty farmaceutyczne, synteza organiczna, produkcja witamin), do produkcji glukozy krystalicznej oraz syropów fruktozowych (np. HFCS). Z glukozy otrzymuje się tez tzw. polidekstrozę o niskiej kaloryczności oraz sorbitol. Produkcja syropów maltozowych i syropu wysokoscukrzonego. Zarówno syropy maltozowe jak i syrop wysokoscukrzony produkowane są metodą enzymatyczą dwustopniową. W pierwszym etapie po otrzymaniu suspensji skrobiowej poddaje się ją kleikowaniu a następnie upłynnieniu (do DE max. 10 w przypadku syropów maltozowych i DE = w przypadku syropu wysokoscukrzonego). Drugi etap procesu polega zwykle na procesie scukrzania enzymatycznego i de facto prowadzi do otrzymania właściwego końcowego produktu. W przypadku syropów maltozowych proces ten prowadzić można na dwa sposoby stosując różne enzymy i warunki prowadzenia procesu otrzymując syropy o różnej zawartości maltozy. Zastosowanie enzymów usuwających rozgałęzienia (pullulanaza lub izoamylaza) umożliwia pełna hydrolizę zarówno amylozy jak i amylopektyny, co skutkuje wysoką zawartością związków niskocząsteczkowych (zwłaszcza maltozy). W produkcji syropu wysokoscukrzonego również stosuje się mieszaninę enzymów (α-amylaza i amyloglukozydaza) w celu zwiększenia stopnia konwersji. Syropy maltozowe otrzymywane metoda enzymatyczna znajdują zastosowanie w piwowarstwie, produkcji napojów, konserw i wyrobów cukierniczych. Ich dodatek do żywności ułatwia kontrole wodochłonności. Syropy te stosuje się także jako wypełniacze i stabilizatory żywności przetworzonej. Można je, podobnie jak maltodekstryny, stosować do opóźniania wzrostu kryształów. Dodatkowo z syropu o wysokiej zawartości maltozy produkuje się maltozę krystaliczna wykorzystywana do w produkcji leków jako zamiennik glukozy dla diabetyków, maltitolu, maltulozy. Syropy te charakteryzują się niską lepkością w roztworach, niska higroskopijnością oraz stabilnością w podwyższonych temperaturach. Inne zastosowania Wytwarzanie polialkoholi. Cukry otrzymywane w syropiarniach mogą być poddawane katalicznemu uwodornieniu, połączonemu z rozdziałem chromatograficznym. Umożliwia to w miarę efektywna produkcje polialkoholi, takich jak sorbitol, ksylitol, maltitol i erytritol. Produkcja kwasów organicznych Kwas cytrynowy jest najważniejszym kwasem organicznym, produkowanym w dużych ilościach i wykorzystywanym w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym. Większa cześć produkcji opiera się na Aspergillus niger. Źródłem węgla mogą być miedzy innymi hydrolizaty skrobiowe i inne pożywki oparte na skrobi. Kwas mlekowy produkowany jest głównie w oparciu o maltozę i glukozę. Bezpośrednia hydroliza skrobi jest możliwa przy udziale bakterii kwasu mlekowego: Lactobacillus thermophillus oraz Lactobacillus amylophillus. Inne kwasy organiczne produkowane w syropiarniach to kwas itakonowy (do produkcji tworzyw sztucznych, farb i lakierów) i glukonowy (preparaty do czyszczenia, glukoniany wapnia, magnezu i żelaza wykorzystywane są jako dodatki wzbogacające produkty spożywcze w odpowiednie sole mineralne). Piekarstwo Preparaty amylolityczne są wykorzystywane przy produkcji pieczywa w celu zwiększenia zawartości cukrów w cieście, zintensyfikowania fermentacji, a co za tym idzie zwiększenia objętości miękiszu i porowatości, poprawy koloru skórki, oraz polepszenia smaku i zapachu pieczywa. Powstające w wyniku działania α-amylazy niskocząsteczkowe dekstryny wpływają na przedłużenie trwałości pieczywa, gdyż utrudniają powstawanie połączeń pomiędzy skrobią i glutenem oraz spowalniają retrogradacje skrobi. Gorzelnictwo i browarnictwo Źródłem skrobi do produkcji etanolu mogą być różne rośliny, np. kukurydza, pszenica, ziemniaki, maniok. Ponieważ drodze zazwyczaj nie są zdolne do hydrolizy skrobi, używa się do tego celu preparatów enzymatycznych. Duże ilości preparatów amylolitycznych zużywane są także przez browary, przy produkcji piwa, podczas zacierania (przy stosowaniu surowców niesłodowanych) i klarowania. Zastosowanie w browarnictwie surowców niesłodowanych i preparatów enzymatycznych zwiększa wydajność warzelni i obniża koszty związane z budową i eksploatacją słodowni. Produkcja acetonu i butanolu W roku 1914 Chaim Weizmann wyizolował Clostridium acetobutylicum, bakterie zdolna do przetwarzania skrobi w aceton i butanol. Ze względu na znaczenie militarne (produkcja nitrocelulozy) proces Weizmanna został

4 szybko wdrożony i był powszechnie wykorzystywany do końca drugiej wojny światowej. Ze względów ekologicznych technologia ta ma pewne szanse na powtórne wprowadzenie w innych krajach. Produkcja pasz Dodatek odpowiednich enzymów do pasz może poprawiać ich przyswajalność, co obniża wskaźnik zużycia pasz na przyrost ciężaru ciała. Do produkcji preparatów dla celów paszowych szczególnie nadaje się Aspergillus oryzae, wytwarzający enzymy amylolityczne i proteolityczne. Preparaty enzymatyczne mogą być stosowane w procesie ich produkcji lub jako bezpośredni dodatek do gotowych mieszanek paszowych. Biodegradacja α-amylaza jest wykorzystywana jako dodatek przyspieszający biodegradację na składowiskach odpadów oraz w oczyszczalniach ścieków. Usuwanie zanieczyszczeń skrobiowych Zanieczyszczenia skrobiowe mogą być usuwane z różnego rodzaju produktów spożywczych i niespożywczych. Glukoamylaza jest wykorzystywana do klarowania wina i soków owocowych. Wytłoki jabłkowe, używane jako surowiec w produkcji pektyny zawierają pewne ilości skrobi. Ich obecność powoduje silne zmętnienie soku pektynowego i wpływają niekorzystnie na proces filtracji. Usuwanie skrobi można przeprowadzać różnymi metodami, (samosklarowanie, dodatek taniny, oziębianie, filtracja), jednak najkorzystniejsze jest użycie do tego celu α-amylazy o optimum ph 3 4. W przemyśle włókienniczym używa się substancji sklejających osnowę zawierzających skrobię lub jej hydrolizaty. W procesie odklejania tkanin konieczne jest dokładne usuniecie klejonki, która przeszkadza w dalszych etapach technologicznych (bielenie, farbowanie, tłoczenie). W tym celu używa się preparatów α-amylazy. Podobne preparaty mogą być używane także do innych celów (oczyszczanie papieru, mycie naczyń, proszki do prania itp.). Wybrane metody oznaczania aktywności enzymów amylolitycznych. Metody wykorzystujące przyrost redukcyjności w mieszaninie reakcyjnej. Metoda z heksascyjanożelazianem (III) potasu. W tej metodzie wykorzystuje się właściwości redukujące cukrów powstałych w trakcie enzymatycznej hydrolizy polisacharydów. Te uwolnione mono-, di- i oligosacharydy reagują z alkalicznym roztworem heksascyjanożelazianu (III) potasu- K 3Fe(CN) 6. Roztwór heksascyjanożelazianu (III) potasu posiada żółty kolor, który po zredukowaniu przez uwalniane w trakcie hydrolizy skrobi cukry redukujące przekształca się w bezbarwny heksascyjanożelazian (II) potasu K 4Fe(CN) 6. Stopień osłabienia intensywności zabarwienia alkalicznego roztworu heksascyjanożelazianu (III) potasu jest zależny od ilości uwalnianych cukrów redukujących i może być miarą aktywności enzymów amylolitycznych. Metoda Bernfelda. W metodzie Bernfelda wykorzystuje się właściwości redukujące maltozy i innych cukrów, które w środowisku zasadowym redukują grupę nitrową soli sodowej kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) w pozycji 3 do grupy aminowej. Powstałe pochodne aminowe mają barwę pomarańczową, silnie absorbują świtało przy długości fali w zakresie od nm. Intensywność powstałej barwy zależy od ilości w próbie cukrów redukujących uwalnianych podczas działania enzymów, dlatego reakcja ta może stanowić podstawę do ich oznaczenia fotometrycznego. Metoda Somogyi i Nelsona. W tej metodzie podobnie jak w poprzednio opisanych metodach, wykorzystuje się właściwości redukujące sacharydów (głównie mono- i disacharydów), które w środowisku zasadowym redukują jony miedzi (II) do jonów miedzi (I) w obecności winianu sodowopotasowego (odczynnik Somogyi) z wytworzeniem tlenku miedzi CuO w postaci ceglastego osadu. Po dodaniu kwasu arsenomolibdenowego (odczynnik Nelsona) do utworzonego tlenku miedzi zachodzi redukcja tego kwasu do odpowiedniego barwnika o kolorze błękitnym, intensywność otrzymanej barwy można mierzyć w zakresie długości fali od nm i jest ona proporcjonalna do ilości utworzonych cukrów redukujących w czasie działania enzymów amylolitycznych. Metoda wykorzystująca zdolność skrobi do tworzenia kompleksu z jodem. Cząsteczki skrobi zależnie od ilości zawartej w nich amylozy i amylopektyny adsorbują jod na swojej powierzchni, dając zabarwienie niebieskie lub niebieskofioletowe. Natomiast produkty częściowej degradacji skrobi zależnie od wielkości ich cząsteczek dają zabarwienie fioletowe (dekstryny wysokocząsteczkowe), czerwone i czerwonobrunatne (dekstryny o średniej masie cząsteczkowej). Z kolei dekstryny niskocząsteczkowe nie dają zabarwienia z jodem. Metoda Sandstedta, Kneena i Blisha oznaczania aktywności amylaz polega na pomiarze ilości rozłożonej skrobi, na podstawie zmiany intensywności zabarwienia w mieszaninie reakcyjnej z jodem po określonym czasie działania enzymu w optymalnym ph i temperaturze. Stosowana w ćwiczeniu jako substrat skrobia ziemniaczana barwi się z jodem na niebiesko (ze względu na znaczną ok. 20% zawartość amylozy). Po przerwaniu reakcji enzymatycznej i wprowadzeniu jodu w próbie materiałowej (bez enzymu) oznacza się pochłanianie barwnego kompleksu powstałego z całą ilością skrobi wprowadzonej do reakcji, natomiast w próbie z udziałem enzymu oznacza się absorbancję kompleksu skrobi nie rozłożonej i dekstryn. Ilość rozłożonej skrobi znajduje się z różnicy pomiarów tych dwóch prób. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia będzie enzymatyczna hydroliza surowców skrobiowych przy wykorzystaniu α- i β-amylazy, w zależności od warunków reakcji (temperatura lub ph) Wykonanie ćwiczenia 1. Odczynniki używane w doświadczeniu:

5 1.1. Bufor fosforanowy ph 6, mm roztwór maltozy 1.3. Preparaty amylaz: α-amylazy i β-amylazy % kleik skrobiowy: odważyć 1 g skrobi i przygotować zawiesinę w ok. 10 ml wody. Zagotować ok. 90 ml wody i do wrzątku wlać zawiesinę skrobiową, zagotować i szybko schłodzić % roztwór DNS (najpierw przygotowano roztwory: 1 g DNS w 20 ml H 2O roztwór A i 1,6 g NaOH w 15 ml H 2O roztwór B; do roztworu A powoli wkroplono roztwór B i ogrzano mieszaniną na łaźni wodnej, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu; następnie, ciągle mieszając dodano 30 g winianu sodowo-potasowego; roztwór uzupełniono do objętości 200 ml wodą i w razie potrzeby przefiltrowano) 2. Przeprowadzenie hydrolizy skrobi 2.1. Do 7 probówek dodajemy 0,5 ml 1% kleiku skrobiowego oraz 0,5 ml buforu fosforanowego, całość mieszamy Probówki inkubujemy w odpowiedniej temperaturze zgodnie z tabelą, przez 5 minut: Seria z α-amylazą Seria z β-amylazą temperatura Probówka nr 1 Probówka nr 4 20 Probówka nr 2 Probówka nr 5 55 Probówka nr 3 Probówka nr Do ogrzanych probówek nr 1, 2 i 3 dodajemy 0,2 ml roztworu α-amylazy, do kolejnych trzech 0,2 ml roztworu β-amylazy, mieszamy, ostatnia - 7 probówka stanowi próbę kontrolną w której enzym zastępujemy wodą Po wprowadzeniu enzymów probówki ponownie inkubujemy w odpowiednich temperaturach, zgodnie z tabelą, przez 5 minut (próbę kontrolną w temperaturze pokojowej) Po upływie 5 minut przerywamy reakcję dodając 1 ml kwasu 3,5-dinitrosalicynowego do wszystkich 7 probówek, ponownie mieszamy Następnie wstawiamy probówki do zlewki z wrzącą wodą na kolejne 5 minut Po tym czasie wyjmujemy probówki z wrzątku i ochładzamy je do temperatury pokojowej Po ochłodzeniu wszystkich probówek wprowadzamy do każdej 10 ml wody destylowanej i po wymieszaniu dokonujemy pomiaru absorbancji przy długości fali 530 nm (lub 470 nm konsultacja z prowadzącym) wobec próby kontrolnej. 3. Wykonanie krzywej wzorcowej dla maltozy 3.1. Do 6 probówek wprowadzić roztwór maltozy i bufor fosforanowy według tabeli, całość wymieszać. Nr probówki Ilość roztworu maltozy Ilość buforu fosforanowego Stężenie maltozy [µm/l] 1 0,0 10, ,0 9, ,0 8, ,0 6, ,0 4, ,0 2, Do kolejnych 6 probówek pobrać po 0,5 ml przygotowanych wcześniej roztworów maltozy i buforu, dodać po 0,5 ml buforu fosforanowego i 1 ml DNS, całość wymieszać Mieszaninę ogrzać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut i po schłodzeniu dodać 10 ml wody, wymieszać Zmierzyć absorbancję roztworów przy długości fali 530 nm (lub 470 nm konsultacja z prowadzącym) wobec próby kontrolnej (roztwór bez maltozy). 4. Opracowanie wyników 4.1. Wykreślić krzywą wzorcową zależności absorbancji od stężenia maltozy z roztworze Wyznaczyć aktywność α-amylazy i β-amylazy, przyjmując jako jednostkę aktywności (JAA) ilość maltozy (µm) uwolnionej przez 1 ml enzymu podczas 1 minutowej hydrolizy skrobi: JAA = S m 6 5 gdzie: Sm stężenie maltozy odczytane z krzywej wzorcowej [µm/l] 4.3. Wyznaczyć zależność JAA f(temp.) dla obu amylaz. Określić wpływa temperatury na aktywność zastosowanych enzymów. 5. Literatura - Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna I i II tom; Wyd. Politechniki Łódzkiej; Klimiuk E., Łebkowska M., Biotechnologia w ochronie środowiska. PWN, 2008.