Właściwości kinetyczne fosfatazy kwaśnej z ziemniaka Celem ćwiczenia jest zapoznanie się metodyką wyznaczania szybkości reakcji Vmax oraz stałej Michaelisa Menten dla fosfatazy kwaśnej z ziemniaka WPROWADZENIE Szybkość przeprowadzanych reakcji enzymatycznych i jej dostosowanie do warunków środowiskowych lub bodźców hormonalnych ma istotne znaczenie dla każdego organizmu dążącego do zachowania homeostazy. Badaniem szybkości reakcji enzymatycznych i wpływu na nią różnych czynników zajmuje się dział enzymologii nazywany kinetyką enzymatyczną. Szybkość reakcji enzymatycznej mierzy się ubytkiem stężenia substratu lub przyrostem stężenia produktu reakcji w jednostce czasu. Na przebieg reakcji enzymatycznej wpływa wiele czynników chemicznych i fizycznych, takich jak stężenie enzymu, stężenie substratu, temperatura, ph, stężenie aktywatorów i inhibitorów, mogących przyśpieszać lub hamować reakcje. W warunkach optymalnych przy nadmiarze substratu i stałym stężeniu enzymu szybkość reakcji powinna być wielkością stałą a wykres szybkości odpowiadać linii prostej (reakcja zerowego rzędu). Jednak w rzeczywistości wraz z upływem czasu szybkość reakcji (V) często maleje wskutek ubytku substratu, hamowania przez produkt oraz stopniowej inaktywacji enzymu i dlatego wyznaczając szybkość początkową reakcji (Vo) powinno stosować się możliwie krótki czas inkubacji enzymu z substratem. W celu poznania ogólnego mechanizmu działania enzymu, szczególnie istotne jest badanie wpływu stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej. Dla wielu enzymów zależność szybkości reakcji (Vo) od stężenia substratu [S] może być wyrażona zależnością matematyczną zawartą w równaniu Michaelisa Menten: gdzie: Vo- szybkość początkowa reakcji V max szybkość maksymalna reakcji dl enzymu całkowicie wysycanego substratem, [S]-stężenie substratu K m stała Michaelisa 1
W omawianym modelu kinetycznym zakłada się powstawanie odwracalnego kompleksu enzym substrat (E-S) oraz nieodwracalnej reakcji rozpadu tego kompleksu na produkt i enzym: k +1 k E + S ES 2 E + P k -1 gdzie: k +n stałe szybkości przy tworzeniu nowych związków a k -n stała szybkości w kierunku odwrotnym. Obrazem graficznym tego równania jest hiperbola : Rys 1. Wykres zależności szybkości reakcji od stężenia substratu wg. Michaelisa-Menten. Przy niższych stężeniach substratu szybkość reakcji rośnie proporcjonalnie do wzrostu jego stężenia. W miarę nasycenia enzymu substratem szybkość reakcji enzymatycznej asymptotycznie zbliża się do wartości granicznej, nazywanej szybkością maksymalną (Vmax). Reakcja osiąga szybkość maksymalną przy stężeniu substratu wystarczającym na wysycenie wszystkich miejsc aktywnych enzymu, w takim momencie dalsze zwiększanie stężenia substratu nie powoduje zmian szybkości katalizy. Stężenie substratu [S] przy którym szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej (Vmax) nosi nazwę stałej Michaelisa (Km). Wartość Km, wyrażana w jednostkach stężenia substratu, jest cechą charakterystyczną każdego enzymu określającą powinowactwo enzymu do danego substratu. Wartości stałych Km zwykle zawierają się w granicach 10-1 do 10-7 M i są zależne od rodzaju substratu, nie są natomiast zależne od stężenia enzymu. Ten sam enzym ma więc różne wartości Km dla 2
różnych. swoich substratów. Wysoka wartość tej stałej wskazuje na słabe powinowactwo a niska na wysokie powinowactwo enzymu do substratu. Stałą Michaelisa wyznacza się stosując w reakcji kilka różnych stężeń substratu. Nie jest możliwe jednak dokładne wyznaczenie tej wartości z wykresu będącego graficznym przedstawieniem równania Michaelisa Menten, dlatego najczęściej do wyznaczania parametrów kinetycznych stosuje się wykres Lineweavera i Burka odpowiadający odwrotności tego równania. Zgodnie z równaniem Lineweavera i Burka, przez odłożenie na osi rzędnych 1/Vo a na osi odciętych 1/S otrzymuje się prostą przecinającą się z osią rzędnych w punkcie odpowiadającym 1/Vmax a z osią odciętych -1/Km, z nachylenia prostej można odczytać wartość km/v. Rys 2. Wykres Lineweara-Burka Wykres Lineweavera i Burka jest także użyteczny przy wyznaczaniu typu inhibicji danej reakcji enzymatycznej. W przypadku inhibicji kompetycyjnej zmianie ulega punkt przecięcia prostej z osią odciętych a więc wartość -1/Km, niezmienny pozostaje punkt przecięcia z osią rzędnych a więc 1/Vmax (rys 3) Rys. 3. Wykres Lineweara-Burka dla inhibicji kompetycyjnej 3
W przypadku inhibicji niekompetycyjnej bez zmian pozostaje punkt przecięcia prostej z odciętych punkt -1/Km, zmianie ulega punkt przecięcia z osią rzędnych (rys 4) Rys. 4 Wykres Lineweara-Burka dla inhibicji niekompetycyjnej Obok przedstawionych powyżej zależności do wyznaczania typu inhibicji w reakcjach enzymatycznych stosuje się także wykresy, np. Hanesa Woolfa lub Woolfa Auguistinsson Hofstee. Bardziej szczegółowe informacje na temat kinetyki reakcji oraz inhibitorów enzymów zostaną podane na wykładzie 4
Fosfatazy należą do klasy hydrolaz, podklasy esteraz i katalizują rekcję odszczepienia reszty fosforanowej od cukrowców, białek, tłuszczowców, nukleotydów i innych naturalnych estrów fosforanowych, zgodnie z ogólnym schematem: Wyróżnia się fosfatazy alkaliczne, z optimum ph w zakresie 9,0-11,0 oraz fosfatazy kwaśne z optimum pomiędzy 3,8 a ph 7,0. Fosfatazy występują powszechnie u wielu organizmów, ich obecność stwierdzono m.in. u bakterii, roślin i zwierząt. Fosfatazy kwaśne zwierzęce występują głównie w lizosomach, gdzie są uważane za enzymy znacznikowe (markerowe) tych struktur komórkowych. Aktywność tego enzymu występującego u człowieka w znacznej ilości w gruczole sterczowym, gwałtownie wzrasta w pierwszych etapach rozwoju raka tego narządu, co jest obecnie wykorzystywane w diagnostyce medycznej. Większość poznanych dotychczas roślinnych fosfataz kwaśnych to glikoproteiny o zróżnicowanej masie cząsteczkowej wahającej się od 20 do 200 kda. Niskocząsteczkowe formy tych enzymów (20-70 kda) występują jako monomery, wysokocząsteczkowe (powyżej 70 kda) jako dimery lub tetrametry. Obecność fosfataz stwierdzono w różnych organach roślin m.in. w nasionach i bulwach, gdzie ich aktywność zwiększa się podczas kiełkowania i maleje w miarę wzrostu kiełków, co może być związane z rolą tego enzymu w uwalnianiu fosforanów z organicznych substancji zapasowych estrów inozytoli. Fosfataza kwaśna występująca w dużym stężeniu w bulwach ziemniaka będzie obiektem badań podczas zajęć laboratoryjnych. Zasada metody oznaczania aktywności fosfatazy kwaśnej: Aktywność tego enzymu będzie oznaczana z wykorzystaniem syntetycznego substratu p-nitrofenylofosforanu, produktami tej reakcji hydrolizy będą p-nitrofenol i kwas fosforowy, zgodnie z poniższą reakcją: 5
Produkt reakcji, p-nitrofenol przyjmuje w środowisku zasadowym barwę żółtą, co jest przy wykorzystane do oznaczania absorbancji w próbach przy długości fali 420 nm. WYKONANIE Studenci wykonują ćwiczenie parami 1. Przygotowanie wyciągu enzymu: Odważyć 5 gramową porcję obranej bulwy z ziemniaka oraz 2 g piasku, rozdrobnić i ucierać w moździerzu stopniowo dodając 20 ml 0,1 M buforu octanowego o ph 5,0. Homogenat przenieść ilościowo ma sączek z gazy i przesączyć do kolby miarowej o pojemności 100 ml, uzupełnić do kreski buforem octanowym, przelewając porcjami przez gazę, dokładnie wymieszać. Dalsze rozcieńczenie przygotować przez przeniesienie np. 10 ml rozcieńczonego roztworu z kolby (100 ml) do kolby miarowej na 25 ml i dopełnić do kreski buforem octanowym, dokładnie wymieszać. Tak rozcieńczony ekstrakt enzymatyczny wykorzystywać do oznaczeń aktywności fosfatazy kwaśnej. 2. Oznaczanie aktywności fosfatazy kwaśnej: Do trzech próbówek -2 próby pełne i 1 próba materiałowa - odmierzyć po 1 ml p-nitrofenylofosforanu, 1 ml wody oraz 1 ml buforu octanowego. wszystkie próby preinkubować 5 min w temp. 30 C, po 5 min (nie wyjmując prób z łaźni) dodać do dwóch po 0,5 ml ekstraktu enzymatycznego (próby pełne) i dokładnie wymieszać. Wszystkie próby inkubować 15 min. w 30 C. Reakcję enzymatyczną przerwać dodając do prób pełnych i materiałowej po 2,5 ml 0,1 M NaOH, dokładnie wymieszać i dodać do próby materiałowej 0,5 ml ekstraktu enzymu. Wyzerować fotometr wobec próby materiałowej przy długości fali 420 mn, zmierzyć absorbancję prób pełnych. Uwaga: Uśredniona wartość absorbancji prób pełnych powinna zawierać się 0,40-0,45 Jeśli uzyskana absorbancja nie mieści się w tym przedziale, należy po konsultacji z nauczycielem prowadzącym zajęcia - zmienić stopień rozcieńczenia ekstraktu roślinnego. 6
3. Wyznaczanie stałej K M i Vmax fosfatazy z ziemniaka Oznaczenie enzymatyczne będzie wykonywane przy 6 różnych stężeniach substratu w dwóch powtórzeniach, próbę materiałową w jednym powtórzeniu, zgodnie z poniższą tabelą: Numer bufor octanowy substrat (ml) H 2 O (ml) próby (ml) 1 1 0,1 1,9 2 1 0,2 1,8 3 1 0,4 1,6 4 1 0,6 1,4 5 1 0,8 1,2 6 1 1,0 1,0 M 1 1,0 1,0 Wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej o temp. 30º C i preinkubować 5 min., po tym czasie dodać do wszystkich-z wyjątkiem próby materiałowej- po 0,5 ml odpowiednio rozcieńczonego wyciągu enzymu z bulwy ziemniaka, wymieszać i inkubować 15 min w 30ºC. Reakcję enzymatyczną przerwać przez dodanie 2,5 ml NaOH, wymieszać, do próby materiałowej dodać 0,5 ml wyciągu enzymu. Zmierzyć absorbancję prób pełnych w fotometrze wyzerowanym na próbę materiałową przy długości fali 420 nm. OPRACOWANIE WYNIKÓW Wyznaczanie Km i Vmax W celu obliczenia ilości mikrogramów uwolnionego w reakcji p-nitrofenolu należy średnią wartość absorbancji równoległych prób podzielić przez molowy współczynnik absorbancji 0,002 dla 1 μg p-nitrofenolu. Następnie obliczyć szybkość reakcji enzymatycznej (V) przy poszczególnych stężeniach substratu, przedstawić ją w μmol p-nitrofenolu (masa molowa p-nitrofenolu wynosi 139). Należy także obliczyć stężenie substratu [S](mol/litr) w poszczególnych próbach, uwzględniając jego rozcieńczenie w mieszaninie reakcyjnej. W celu sporządzenia wykresu Lineweara i Burka należy odłożyć na osi rzędnych 1/Vo oraz na odciętych 1/[S]. Prostą łączącą naniesione punkty należy przedłużyć, tak aby przecięła się z osią odciętych, z punktu przecięcia odczytać wartość -1/Km, obliczyć Km. Z punktu przecięcia prostej z osia rzędnych odczytać wartość 1/Vmax, obliczyć Vmax. 7
Obliczenie aktywności fosfatazy kwaśnej z ziemniaka Uwzględniając rozcieńczenie obliczyć aktywność enzymu w μmol p-nitrofenolu utworzonego w czasie 1 min przez enzym z 1 g bulwy ziemniaka. 8