KATEDRA BIOCHEMII Wydział Biologii i Ochrony Środowiska BADANIE WŁASNOŚCI KOENZYMÓW OKSYDOREDUKTAZ ĆWICZENIE 2 Nukleotydy pirydynowe (NAD +, NADP + ) pełnią funkcję koenzymów dehydrogenaz przenosząc jony wodorkowe (2e - i 1 H + ) między utlenianym substratem, a redukowanym akceptorem. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) katalizuje reakcję: Kierunek reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanową zależy od ph. Przy ph 7 równowaga reakcji jest przesunięta w kierunku powstania mleczanu, natomiast przy ph 10 w kierunku tworzenia pirogronianu z jednoczesną redukcją NAD + do NADH + H +. Przejście formy utlenionej NAD + w formę zredukowaną NADH można śledzić spektrofotometrycznie. czasie redukcji pirogronianu do mleczanu. ZADANIE 1 SPEKTROFOTOMETRYCZNE ROZRÓŻNIANIE NAD + OD NADH+H + 1. Zmierzyć widmo absorpcyjne roztworów NAD + i NADH+H w zakresie od 240 do 400 nm. Wyznaczyć długości fali, przy której obserwuje się maksimum absorpcji ( max) dla obydwu form koenzymów. 1
2. Wiedząc, że: Absorbancja (A) światła monochromatycznego jest wprost proporcjonalna do grubości warstwy (l) i do stężenia roztworu (c). A = k l c Współczynnik k nazywa się współczynnikiem absorpcji i ma on charakterystyczną stałą wartość dla każdej substancji, przy stałej długości fali świetlnej ( ). Miano i wartość liczbowa tego współczynnika zależą od jednostek stężenia. Przy stężeniu wyrażonym w mol/l przyjmuje on nazwę molowego współczynnika absorpcji i oznacza się go symbolem. Liczbowo równa się on absorbancji A, jaką wykazuje roztwór 1 molowy o grubości warstwy roztworu 1 cm. Obliczyć: 3. Teoretyczną wartość absorbancji 0,1 mm roztworu NADH + H+ przy =340 nm. Molowy współczynnik absorpcji dla NADH przy 340 nm wynosi 6220. ZADANIE 2 OZNACZANIE AKTYWNOŚCI DEHYDROGENAZY MLECZANOWEJ W KOMÓRKACH DROŻDŻY METODĄ WRÓBLEWSKIEGO I LA DUE 1. Przygotować próbę ślepą: w tym celu do kuwety UV o objętości 3 ml wprowadzić: a. 3 ml wody destylowanej. 2. Włączyć spektrofotometr. 3. Ustawić długość fali = 340 nm. 4. Kuwetę z próbą ślepą umieścić w uchwycie urządzenia. Nacisnąć przycisk Zero aby wyzerować przyrząd. 5. Przygotować próbkę badaną: W tym celu do kuwety UV o objętości 3 ml wprowadzić: 6. 2,7 ml 0,1 M buforu fosforanowego o ph 7,4 7. 100 l roztworu NADH 8. 100 l surowej frakcji enzymatycznej 9. Wyjąć próbkę odniesienia i włożyć kuwetę z próbką badaną. 10. Wprowadzić 100 l roztworu pirogronianu sodu (substrat). UWAGA!!! Reakcja rozpoczyna się w momencie dodania substratu do mieszaniny reakcyjnej. W tym momencie należy włączyć stoper i kontrolować czas prowadzenia reakcji. 7. Co 30 sekund, przez 5 minut mierzyć spadki absorbancji przy 340 nm. 8. Uzyskane wartości absorbancji wpisać do Tabeli 1. 2
Tabela 1 Czas, min 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 Absorbancja przy długości fali = 340 nm ZADANIE 2 OZNACZANIE BIAŁKA METODĄ BRADFORDA W metodzie tej wykorzystuje się wiązanie barwnika Coomassie Brilliant Blue G-250 z białkiem za pomocą wiązań jonowych i hydrofobowych. Z barwnikiem głównie reagują reszty argininy, w minimalnym stopniu reszty histydyny, lizyny, tyrozyny, tryptofanu i fenyloalaniny. Błękit brylantynowy CBB G-250 w środowisku kwasowym ma brunatne zabarwienie, które po reakcji z białkiem zmienia się na błękitne. Wiąże się z tym zmiana maksimum pochłaniania z 465 na 595 nm. Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze. W zależności od budowy białka, mogą zaistnieć różnice w wiązaniu barwnika, co powoduje uzyskiwanie różnego natężenia barwy przy tych samych stężeniach odmiennych białek. A) SPORZĄDZANIE KRZYWEJ WZORCOWEJ Do 11 probówek odpipetować odpowiednio od 0 do 1 ml roztworu białka wzorcowego (roztwór albuminy jaja kurzego o stężeniu 0,35 mg/ml w 0,9% NaCl) i uzupełnić roztworem NaCl według tabeli 1. Zawartość probówki nr jeden należy traktować jako próbę kontrolną. Do wszystkich probówek dodać po 5 ml odczynnika Bradforda i wymieszać. Po 10 minutach zmierzyć ekstynkcję przy długości fali 595 nm. Wyniki zanotować w Tabeli 2, sporządzić krzywą wzorcową oraz obliczyć współczynnik regresji dla tej krzywej. 3
Tabela 2 Lp. Ilość roztworu wzorcowego [ml] Ilość roztworu 0,9%NaCl [ml] białka [ g/lm] 1 0,0 1,0 0,0 2 0,1 0,9 35 3 0,2 0,8 70 4 0,3 0,7 105 5 0,4 0,6 140 6 0,5 0,5 175 7 0,6 0,4 210 8 0,7 0,3 245 9 0,8 0,2 280 10 0,9 0,1 315 11 1,0 0,0 350 Ekstynkcja Wniosek: Badaną krzywą kalibracyjną opisuje równanie:... Uwaga! Krzywą kalibracyjną do oznaczania stężenia białka zachować do dalszych ćwiczeń!!! B) Oznaczanie stężenia białka w materiale biologicznym 1. Pobrać 1 ml surowej frakcji enzymatycznej. Dodać 5 ml odczynnika Bradforda i starannie wymieszać. Po 10 minutach zmierzyć absorbancję roztworu przy długości fali =595 nm względem próby ślepej. 2. Obliczyć stężenie białka w badanej próbie korzystając ze współczynnika kierunkowego krzywej kalibracyjnej. 3. Wynik wpisać do Tabeli 3. OPRACOWANIE WYNIKÓW 1. Obliczyć aktywność dehydrogenazy mleczanowej w U aktywność LDH [U] = A/min Vk ε d Vp Gdzie: 103 = A/min Vk 103 6,22 Vp U- ilość enzymu przekształcająca 1 M substratu/min/100ml A/min- różnica absorbancji w ciągu 1 minuty 4
Vk- końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej Vp- objętość wyciągu enzymatycznego (próby) d- grubość warstwy badanego roztworu (1 cm) ε milimolowy współczynnik absorpcji dla NADH przy 340 nm = 6,22 2. Obliczyć aktywność właściwą dehydrogenazy mleczanowej w U/mg białka Tabela 3 Aktywność dehydrogenazy mleczanowej U [ M/min] białka w próbie, g/ml białka w próbie, [mg/ml] Aktywność właściwa, U/mg białka ZAKRES MATERIAŁU Klasy koenzymów. Budowa i funkcja koenzymów oksydoreduktaz (NAD +, NADP +, FAD, FMN, FAD, ubichinon). Literatura 1. Biochemia, J. M. Berg i wsp., PWN, Warszawa 2007 2. Biochemia Harpera, R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa 2006 3. Cytobiochemia, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 2002 4. Biochemia kręgowców, W. Minakowski, S. Weidner, PWN, Warszawa 2005 5. Zarys biochemii, P. Karlson, PWN, Warszawa 1987 6. Ćwiczenia z biochemii, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 2005 7. Ćwiczenia z biochemii, Strzeżek J., ART, 1997 8. Ćwiczenia z biochemii, A. Łogin i in., ART, Olsztyn, 1997 5